ניתוח התוכן של חומצות שומן והרכב בMicroalgae

Summary

שיטה לקביעת תכולת חומצות שומן והרכב באצות המבוססות על הפרעה מכאנית של תאים, מיצוי שומנים מבוסס ממס, transesterification, וכימות וזיהוי של חומצות שומן באמצעות גז כרומטוגרפיה מתוארת. תקן פנימי tripentadecanoin משמש כדי לפצות על ההפסדים האפשריים בחילוץ וtransesterification שלם.

Abstract

שיטה כדי לקבוע את התוכן ואת ההרכב של חומצות שומן הכוללת בהווה באצות הוא תאר. חומצות שומן הן מרכיב עיקרי של ביומסה microalgal. חומצות שומן אלו יכולות להיות נוכחים בשיעורי acyl שומנים בדם שונים. בעיקר חומצות השומן קיים בtriacylglycerol (TAG) הן עניין מסחרי, משום שהם יכולים לשמש לייצור דלקים לתחבורה, כימיקלים בצובר, בריאותיים (ω-3 חומצות שומן), ומוצרי מזון. כדי לפתח יישומים מסחריים, שיטות אנליטיות אמינות לכימות של תכולת חומצות שומן והרכב יש צורך. Microalgae הם תאים בודדים מוקף דופן תא נוקשה. שיטת ניתוח חומצת השומן אמורה לספק הפרעה תא מספיק כדי לשחרר את כל שומני acyl והליך המיצוי משמש אמור להיות מסוגל לחלץ את כל כיתות השומנים acyl.

עם השיטה המוצגת כאן את כל חומצות השומן הנוכחיות באצות יכולות להיות מדויקת וreproducibly IDENtified ולכמת באמצעות כמויות קטנות של מדגם (5 מ"ג) עצמאיות באורכם שרשרת, מידת unsaturation, או ברמת השומנים בדם שהם חלק ממנה.

שיטה זו אינה מספקת מידע על השפע היחסי של כיתות שומנים שונות, אבל ניתן להאריך להפריד כיתות שומנים בדם אחד מהשני.

השיטה מבוססת על רצף של הפרעה מכאנית של תאים, מיצוי שומנים מבוסס ממס, transesterification של חומצות שומן לאסטרים מתילים של חומצות שומן (fames), וכימות וזיהוי של fames באמצעות גז כרומטוגרפיה (GC-FID). סטנדרטי TAG פנימי (tripentadecanoin) הוא הוסיף לפני הליך האנליטיות לתיקון להפסדים במהלך החילוץ וtransesterification שלם.

Introduction

חומצות שומן הן אחד המרכיבים העיקריים של ביומסה microalgal ובדרך כלל לפצות בין 5-50% מהמשקל היבש של תאי ^1-3. הם בעיקר בהווה בצורה של glycerolipids. glycerolipids אלה בתורם בעיקר מורכב מפוספוליפידים, glycolipids, וtriacylglycerol (TAG). בעיקר חומצות השומן קיים בTAG הן עניין מסחרי, משום שהם יכולים לשמש כמשאב לייצור דלקים לתחבורה, כימיקלים בצובר, בריאותיים (ω-3 חומצות שומן), ומוצרי מזון ^3-6. Microalgae יכול לגדול בתקשורת טיפוח על בסיס מים ים, יכול לקבל את הפרודוקטיביות אזוריות גבוהה הרבה יותר מאשר צמחים יבשתיים, ויכול להיות מעובד בphotobioreactors מקומות שאינם מתאימים לחקלאות ב, ואולי אפילו מהחוף. מסיבות אלה, microalgae נחשב לעתים קרובות חלופה מבטיחה לצמחים יבשתיים לייצור של מוצרים בתפזורת אחרים ^3-6 ביו דיזל ו. פוטנציאל לא l חקלאיואו מים מתוקים (כשטפח בphotobioreactors הסגור או כאשר משמשים microalgae הימי) נחוץ לייצור שלהם. לכן, דלק ביולוגי הנגזר מmicroalgae נחשב 3 ^rd דלק ביולוגי מדור.

התוכן הסלולרי הכולל של חומצות שומן (% ממשקל יבש), הרכב ברמת שומנים בדם, כמו גם את אורך חומצות שומן ומידת הרוויה הוא משתנה מאוד בין מיני microalgae. יתר על כן, מאפיינים אלה משתנים עם תנאי גידול, כגון זמינות חומרי מזון, טמפרטורה, pH, ועוצמת אור ^1,2. לדוגמא, כאשר הם נחשפים לרעב חנקן, microalgae יכול לצבור כמויות גדולות של TAG. בתנאי גידול אופטימליים TAG בדרך כלל מהווה פחות מ -2% ממשקל יבש, אבל כאשר הם נחשפים לתוכן TAG רעב חנקן יכול להגדיל לעד 40% מהמשקל היבש microalgal ^1.

Microalgae בעיקר לייצר חומצות שומן עם אורכי שרשרת 16 ו18אטומי פחמן, אבל כמה מינים יכולים לעשות חומצות שומן של עד 24 אטומי פחמן באורך. שני רוויים כמו גם חומצות שומן בלתי רוויות מאוד מיוצרות על ידי אצות חד. האחרון כולל חומצות שומן עם יתרונות תזונתיים (ω-3 חומצות שומן) כמו C20: 5 (חומצת eicosapentaenoic; EPA) וC22: 6 (docosahexaenoic acid; DHA) שעבורם אין חלופות ירקות קיימות ^1,2,4,7. (חלוקת) אורך שרשרת של חומצות שומן ומידת הרוויה גם קובע את התכונות ואיכות של דלק ביולוגי המופקת מאצות ושמן מאכל ^4,8.

כדי לפתח יישומים מסחריים של חומצות שומן microalgal נגזר, שיטות אנליטיות אמינות לכימות של תכולת חומצות שומן והרכב יש צורך.

כמו גם ציין ידי Ryckebosch et al. ^9, ניתוח של חומצות שומן באצות חד מבדיל את עצמו ממצעים אחרים (למשל שמן צמחי, מוצרי מזון, ברקמות של חיות וכו ') יהיוmicroalgae לגרום 1) הם תאים בודדים מוקפים בקירות תא נוקשה, מסבכים מיצוי שומנים בדם; 2) microalgae מכיל מגוון רחב של שיעורי שומנים וההפצה ברמת שומנים בדם משתנה ⁷ מאוד. יש כיתות שומנים שונות אלה מגוון רחב במבנה כימי ותכונות כגון קוטביות. כמו כן, שיעורי שומנים אחרים מאשר שומני acyl מיוצרים; 3) microalgae מכיל מגוון רחב של חומצות שומן, הנע 12-24 אטומי פחמן באורך ומכיל הן רווי וכן חומצות שומן בלתי רוויות מאוד. לכן, שיטות שפותחו לניתוח חומצות שומן במצעים אחרים מאשר microalgae, לא יכולות להיות מתאימות כדי לנתח את חומצות שומן באצות.

כפי שנסקר על ידי Ryckebosch et al. ^9, ההבדל העיקרי בין הליכי מיצוי שומנים נפוצים הוא בממס המערכות הנמצאים בשימוש. בגלל המגוון הגדול של סוגי שומנים בהווה באצות, כל משתנה בקוטביות, שחולץכמות שומנים תשתנה עם ממסים משמשים ^10-12. זה מוביל לחוסר העקביות בתוכן השומנים בדם ובהרכב מובא ^ב9,10 ספרות. בהתאם למערכת הממס בשימוש, שיטות המבוססות על מיצוי בממסים ללא הפרעה דרך תא, למשל, מכות חרוז או sonication, ייתכן שלא לחלץ את כל השומנים בגלל המבנה הנוקשה של כמה מיני microalgae ^9,13. במקרה של מיצוי שומנים שלם, המיצוי יעילות של שומנים בדם הכיתות השונות יכולה להשתנות ^14. זה יכול גם להיות השפעה על הרכב חומצות שומן נמדד, כי הרכב חומצות שומן משתנה בין מעמדות שומנים בדם ^7.

השיטה שלנו מבוססת על רצף של הפרעה מכאנית של תאים, מיצוי שומנים מבוסס ממס, transesterification של חומצות שומן לאסטרים מתילים של חומצות שומן (fames), וכימות וזיהוי של fames באמצעות כרומטוגרפיה גז בשילוב עם ioniza להבהגלאי tion (GC-FID). תקן פנימי בצורה של triacylglycerol (tripentadecanoin) הוא הוסיף לפני ההליך אנליטית. הפסדים אפשריים במהלך החילוץ וtransesterification שלם אז יכולים להיות מתוקנים ל. השיטה יכולה לשמש כדי לקבוע את התוכן כמו גם את ההרכב של חומצות השומן קיימים ביומסה microalgal. כל חומצות השומן המצויים בסוגים השונים acyl שומנים בדם, כוללים אחסון (TAG), כמו גם שומני קרום תא (glycolipids, פוספוליפידים), מזוהים, שזוהה ולכמת באופן מדויק וreproducibly בשיטה זו משתמשת רק בכמויות קטנות של מדגם (5 מ"ג) . שיטה זו אינה מספקת מידע על השפע היחסי של כיתות שומנים שונות. עם זאת, השיטה יכולה להתארך להפריד כיתות שומנים מכל ¹ אחר. הרכב חומצות שומן של הריכוז וכיתות שומנים השונים אז יכול להיות נקבע באופן אינדיבידואלי.

בספרות מספר שיטות אחרות הןתאר לניתוח שומנים באצות. חלק מהשיטות להתמקד ברכיבי lipophilic כולל ^15, בעוד שיטות אחרות מתמקדות בחומצות שומן כוללת ^9,16. חלופות אלה כוללות קביעת gravimetric של שומני חילוץ בסך הכל, טרנס esterification הישיר של חומצות שומן בשילוב עם כימות באמצעות כרומטוגרפיה, ותאי צביעה עם צבעי ניאון lipophilic.

חלופה נפוצות לכימות של חומצות שומן באמצעות כרומטוגרפיה היא כימות של שומנים באמצעות נחישות gravimetric ^17,18. יתרונותיו של נחישות gravimetric הם חוסר דרישות לציוד מתקדם ויקר כמו גז כרומטוגרף; להקל להגדיר את ההליך, בגלל הזמינות של ציוד הסטנדרטי אנליטיים (למשל Soxhlet); ונחישות gravimetric היא פחות מזמן רב כרומטוגרפיה שיטות. מבוססת היתרון העיקרי של שימוש בשיטות כרומטוגרפיה המבוססת על othאה יד היא כי בשיטה כזו רק חומצות השומן נמדדות. בנחישות gravimetric החומצה שאינה שומנית המכילה שומנים, כמו פיגמנטים או סטרואידים, כלולה גם בנחישות. שומני חומצה שאינה מכיל שומן אלו יכולים לפצות על חלק גדול (> 50%) של שומנים בסך הכל. אם מישהו מעוניין רק בתכולת חומצות שומן (לדוגמא ליישומים ביו דיזל), זה יהיה בהערכת, כאשר הוא משמשת נחישות gravimetric. בנוסף, בנחישות gravimetric הדיוק של האיזון האנליטית המשמש לשקילת השומנים חולצו קובע את גודל המדגם שצריך להיות בשימוש. כמות זו היא בדרך כלל הרבה יותר מהסכום הדרוש, כאשר הוא משמש כרומטוגרפיה. לבסוף, יתרון נוסף של שימוש בכרומטוגרפיה על נחישות gravimetric הוא כי כרומטוגרפיה מספקת מידע על הרכב חומצות שומן.

חלופה נוספת לשיטה שהוצגה היא ^16,19,20 transesterification ישירים.בשיטה זו שאיבת שומנים בדם וtransesterification של חומצות שומן לfames משולבים בצעד אחד. שיטה זו היא מהירה יותר מאשר שלב חילוץ וtransesterification נפרד, אבל שילוב של צעדים אלה מגביל את הממסים שיכולים לשמש לחילוץ. זה עלול להשפיע לרעה על יעילות שאיבה. יתרון נוסף של צעד נפרד שאיבת שומנים בדם וtransesterification הוא שהיא מאפשרת להפרדה ברמת שומנים בדם נוספת בין שלבי ¹ אלה. זה לא אפשרי בעת השימוש transesterification הישיר.

שיטות נפוצות אחרות כדי לקבוע את תוכן השומנים באצות כוללות מכתימות את ביומסה עם כתמי ניאון lipophilic כגון הנילוס אדום או BODIPY ומדידת אותות הקרינה ^21,22. יתרון של שיטות אלה הם שהם פחות מייגע יותר מאשר בשיטות אלטרנטיביות. חסרון של שיטות אלה הוא שתגובת הניאון היא, מסיבות שונות, משתנה בין species, תנאי גידול, סוגי שומנים בדם, ונהלים אנליטיים. כדוגמא, כמה וריאציות אלה נגרמים על ידי הבדלים בספיגה של הצבע על ידי microalgae. כיול באמצעות שיטה אחרת, כמותית יש צורך אפוא, שבוצע רצוי לכל תנאי גידול השונים ושלבי צמיחה. לבסוף, שיטה זו אינה מספקת מידע על הרכב חומצות שומן ופחות מדויק ולשעתק מאשר שיטות כרומטוגרפיה מבוססת.

השיטה שהוצגה מבוססת על השיטה שתוארה על ידי למרס et al. ²³ וסנטוס et al. ²⁴ וגם יושמה על ידי מחברים שונים אחרים ^1,25-27. גם שיטות אחרות זמינות המבוססים על אותם העקרונות ויכולות לספק ^9,28 תוצאות דומות.

Protocol

1. לדוגמא הכנה ישנם שני פרוטוקולים חלופיים עבור מדגם הכנה כלל כצעדי 1.1 ו1.2. שני השיטות מתאימות במידה שווה ולתת תוצאות דומות, אבל אם יש כמות מוגבלת של אצות תרבות נפח זמינה, שיטה 1.1 מומלצת. הערה: בכל …

Representative Results

הכרומתוגרמה טיפוסית המתקבלת באמצעות תהליך זה מוצגת באיור 1. Fames מופרדים לפי גודל ומידת הרוויה לפי עמודת GC והפרוטוקול המשמש. יש חומצות קצרות שרשרת אורך שומן וחומצות שומן רווי יותר (קשרים כפולים פחות) פעמים שמירה קצרות יותר. עמודת GC משמש ופרוטוקול לא מתכוונים ל…

Discussion

השיטה המתוארת יכולה לשמש כדי לקבוע את התוכן כמו גם את הרכב חומצות שומן בסך הכל קיימים ביומסה microalgal. חומצות שומן הנגזרות מכל מעמדות השומנים בדם, לרבות אחסון (TAG), כמו גם שומני קרום (פוספוליפידים וglycolipids), מזוהות. ניתן לאתר בכל אורכי חומצת שומן השרשרת והמעלות של רוויה שנמצ…

Materials

Reagent and equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
tripentadecanoin (C15:0 TAG)	Sigma Aldrich	T4257	CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Larodan
Beadbeater	Bertin Technologies	Precellys 24
beadbeater tubes	MP Biomedicals	Lysing matrix E 116914500
GC-FID	Hewlett-Packer	HP6871
GC column	Supelco	Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl	Mettler Toledo	MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000	Mettler Toledo	C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml	VWR	612-1925
glass tubes	VWR	SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000	VWR	SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps	VWR	SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator	VWR	445-2101
Heated Evaporator/Concentrator	Cole-Parmer	YO-28690-25