Analyse de la teneur en acide gras et de la composition en microalgues
Summary
Procédé pour la détermination de la teneur en acides gras et de la composition en micro-algues sur la base de la rupture mécanique des cellules, le solvant d'extraction à base de lipide, de transestérification, et la quantification et l'identification des acides gras par chromatographie en phase gazeuse est décrit. Un étalon interne tripentadecanoin est utilisé pour compenser les pertes possibles lors de l'extraction et de transestérification incomplète.
Abstract
Procédé pour déterminer la teneur et la composition des acides gras totaux présents dans les micro-algues est décrit. Les acides gras sont un constituant majeur de la biomasse de microalgues. Ces acides gras peuvent être présents dans différentes classes d'acyl-lipide. En particulier, les acides gras présents dans triacylglycérols (TAG) sont d'un intérêt commercial, car ils peuvent être utilisés pour la production de carburants de transport, les produits chimiques en vrac, des nutraceutiques (ω-3 acides gras), et les produits alimentaires. Pour développer des applications commerciales, les méthodes analytiques permettant la quantification de la teneur en acide gras et de la composition sont nécessaires. Les microalgues sont des cellules individuelles entourées par une paroi cellulaire rigide. Procédé d'analyse d'acide gras doit fournir suffisamment de rupture des cellules pour libérer tous les lipides d'acyle et la procédure d'extraction utilisée doit être capable d'extraire toutes les classes de lipides acyle.
Avec la méthode présentée ici tous les acides gras présents dans les microalgues peuvent être précise et reproductible idenTIFIÉ et quantifiés à l'aide de petites quantités d'échantillon (5 mg), indépendamment de leur longueur de chaîne, le degré d'insaturation, ou la classe de lipides, ils font partie.
Ce procédé ne fournit pas d'informations sur l'abondance relative des différentes classes de lipides, mais peut être étendu à séparer les classes de lipides de l'autre.
La méthode est basée sur une séquence de rupture mécanique des cellules, l'extraction par solvant à base de lipide, la transestérification des acides gras en esters gras méthyliques d'acide (FAME), et la quantification et l'identification de FAME à l'aide de Chromatographie en phase gazeuse (GC-FID). Un étalon interne de TAG (tripentadecanoin) est ajouté avant le procédé d'analyse pour corriger les pertes au cours de l'extraction et de transestérification incomplète.
Introduction
Les acides gras sont un des principaux constituants de la biomasse de microalgues et de faire généralement entre 5-50% du poids sec des cellules 1-3. Ils sont principalement présents sous la forme de glycérolipides. Ces glycérolipides à son tour principalement constitués de phospholipides, des glycolipides et triglycérides (TAG). En particulier, les acides gras présents dans le TAG sont d'intérêt commercial, car ils peuvent être utilisés comme une ressource pour la production de carburants de transport, les produits chimiques en vrac, des nutraceutiques (ω-3 acides gras), et les produits alimentaires 3-6. Microalgues peuvent croître dans des milieux de culture à base d'eau de mer, peut avoir une productivité de surface beaucoup plus élevé que les plantes terrestres, et peut être cultivé dans des photobioréacteurs à des endroits qui sont impropres à l'agriculture, peut-être même à l'étranger. Pour ces raisons, les microalgues sont souvent considérés comme une alternative prometteuse pour les plantes terrestres pour la production de biodiesel et d'autres produits en vrac 3-6. Potentiellement pas l agricoleet ou d'eau douce (lorsqu'elles sont cultivées dans des photobioréacteurs fermés ou quand microalgues marines sont utilisés) est nécessaire pour leur production. Par conséquent, les biocarburants dérivés de microalgues sont considérées comme 3 ème génération de biocarburants.
Le contenu cellulaire total en acides gras (% du poids sec), la composition de la classe de lipides, ainsi que la longueur de l'acide gras et le degré de saturation sont très variables selon les espèces de microalgues. En outre, ces propriétés varient avec les conditions de culture telles que la disponibilité des nutriments, la température, le pH, l'intensité lumineuse et 1,2. Par exemple, lorsqu'ils sont exposés à la privation d'azote, de micro-algues peuvent accumuler de grandes quantités de TAG. Dans des conditions de croissance optimales TAG constitue généralement moins de 2% du poids sec, mais lorsqu'ils sont exposés à la famine azote contenu de TAG peut augmenter jusqu'à 40% du poids sec des microalgues 1.
Les microalgues produisent principalement des acides gras à chaîne longue de 16 à 18atomes de carbone, mais certaines espèces peuvent apporter des acides gras allant jusqu'à 24 atomes de carbone en longueur. Les deux saturé ainsi que les acides gras hautement insaturés sont produits par des micro-algues. Ces derniers comprennent les acides gras avec des avantages nutritionnels (ω-3 acides gras) comme C20: 5 (acide eicosapentaénoïque, EPA) et C22: 6 (acide docosahexaénoïque, DHA) pour lesquels aucune solution de rechange végétales existent 1,2,4,7. Le (la distribution de) l'acide gras de longueur de chaîne et du degré de saturation détermine également les propriétés et la qualité des biocarburants d'algues dérivés et les huiles comestibles 4,8.
Pour développer des applications commerciales de microalgues dérivés des acides gras, des méthodes d'analyse fiables pour la quantification de la teneur en acides gras et la composition sont nécessaires.
Comme l'a également souligné Ryckebosch et al. 9, l'analyse des acides gras dans les microalgues se distingue des autres substrats (par exemple l'huile végétale, les produits alimentaires, les tissus d'animaux, etc) êtreprovoquer 1) microalgues sont des cellules individuelles entourées de parois cellulaires rigides, ce qui complique l'extraction des lipides; 2) microalgues contiennent une grande variété de classes de lipides et la distribution de la classe de lipides est très variable 7. Ces différentes classes de lipides ont une grande variété dans la structure chimique et des propriétés telles que la polarité. En outre, les classes de lipides autres que les lipides acyle sont produites, 3) contient des micro-algues d'une grande variété d'acides gras, variant de 12 à 24 atomes de carbone de longueur et contenant à la fois saturés ainsi que des acides gras hautement insaturés. Par conséquent, les méthodes mises au point pour analyser les acides gras dans les substrats autres que les micro-algues, pourrait ne pas être approprié pour analyser les acides gras dans les microalgues.
Comme examiné par Ryckebosch et al. 9, la principale différence entre les procédures d'extraction des lipides couramment utilisés dans les solvants est-systèmes qui sont utilisés. En raison de la grande variété de classes de lipides présents dans les microalgues, chacun variant de polarité, la extraitla quantité de lipides peut varier selon les solvants utilisés 10 à 12. Cela conduit à des incohérences dans le contenu lipidique et la composition présentée dans la littérature 9,10. En fonction du système de solvants utilisé, les méthodes basées sur l'extraction par solvant, sans rupture des cellules par le biais, par exemple, les battements de bourrelet ou sonication, risquent de ne pas extraire l'ensemble des lipides en raison de la structure rigide de certaines espèces de microalgues 9,13. Dans le cas de l'extraction des lipides incomplète, l'efficacité de l'extraction des différentes classes de lipides peut varier 14. Cela peut aussi avoir un effet sur la composition en acides gras mesurée, car la composition en acides gras est variable entre les classes de lipides 7.
Notre procédé est basé sur une séquence de rupture mécanique des cellules, l'extraction par solvant à base de lipide, la transestérification des acides gras en esters gras méthyliques d'acide (FAME), et la quantification et l'identification de FAME à l'aide de Chromatographie en phase gazeuse en combinaison avec une ionisation de flammedétecteur de tion (GC-FID). Un étalon interne sous la forme d'un triacylglycérol (tripentadecanoin) est ajouté avant le procédé d'analyse. Les pertes éventuelles lors de l'extraction et de transestérification incomplète peuvent alors être corrigées pour. La méthode peut être utilisée pour déterminer le contenu ainsi que la composition des acides gras présents dans la biomasse de micro-algues. Tous les acides gras présents dans les différentes classes d'acyl-lipide, y compris le stockage (TAG), ainsi que des lipides membranaires (les glycolipides, phospholipides), sont détectés, identifiés et quantifiés avec précision et de façon reproductible par ce procédé en utilisant uniquement des petites quantités d'échantillon (5 mg) . Cette méthode ne fournit pas d'informations sur l'abondance relative des différentes classes de lipides. Cependant, le procédé peut être étendu à séparer les classes de lipides de l'autre 1. La composition des différentes classes de lipides et de la concentration de l'acide gras peut ensuite être déterminée individuellement.
Dans la littérature plusieurs autres méthodes sontdécrit à analyser les lipides dans les microalgues. Certaines méthodes sont axées sur le total des composants lipophiles 15, alors que d'autres méthodes sont axées sur les acides gras totaux 9,16. Ces solutions comprennent détermination gravimétrique des lipides totaux extraits, trans-estérification directe des acides gras combinés à la quantification en utilisant la Chromatographie, et cellules présentant une coloration avec des colorants fluorescents lipophiles.
Une solution couramment utilisée pour la quantification des acides gras par chromatographie est la quantification des lipides en utilisant une détermination gravimétrique 17,18. Avantages d'une détermination gravimétrique sont l'absence d'exigences pour l'équipement de pointe et coûteux comme un chromatographe en phase gazeuse; facilité à mettre en place la procédure, en raison de la disponibilité de l'équipement analytique standardisée (par exemple Soxhlet), et une détermination gravimétrique est moins de temps que Chromatographie méthodes fondées. L'avantage majeur de l'utilisation des méthodes de chromatographie sur la base de l'OTHer main est que, dans un tel procédé que les acides gras sont mesurés. Dans une détermination gravimétrique de l'acide non gras contenant des lipides, comme des pigments ou des stéroïdes, sont également inclus dans la détermination. Ces acides gras non-contenant des lipides peuvent constituer une part importante (> 50%) des lipides totaux. Si l'on ne s'intéresse qu'à la teneur en acide gras (par exemple pour des applications de biodiesel), il sera surestimée quand une détermination gravimétrique est utilisé. En outre, dans une détermination gravimétrique de la précision de la balance analytique utilisée pour peser les lipides extraits détermine la taille de l'échantillon qui doit être utilisé. Cette quantité est généralement beaucoup plus que la quantité nécessaire lorsque la Chromatographie est utilisée. Enfin, un autre avantage de l'utilisation de la Chromatographie sur détermination gravimétrique est que la Chromatographie fournit des informations sur la composition en acides gras.
Une autre alternative à notre méthode présentée est 16,19,20 de transestérification directe.Dans ce procédé, l'extraction des lipides et la transestérification des acides gras à FAMEs sont combinées en une seule étape. Cette méthode est plus rapide que l'extraction d'une étape séparée et la transestérification, mais la combinaison de ces étapes limite les solvants qui peuvent être utilisés pour l'extraction. Cela pourrait influencer négativement l'efficacité de l'extraction. Un autre avantage d'une extraction des lipides et la transestérification étape séparée est qu'il permet une séparation des classes de lipides supplémentaire entre les étapes 1. Ceci n'est pas possible lorsque la transestérification directe est utilisé.
D'autres méthodes couramment utilisées pour déterminer la teneur en lipides des microalgues sont coloration de la biomasse avec des taches fluorescentes lipophiles tels que le Nil rouge ou BODIPY et mesurer le signal de fluorescence 21,22. Un avantage de ces méthodes est qu'elles sont moins laborieux que les procédés alternatifs. Un inconvénient de ces méthodes est que la réponse fluorescente est, pour diverses raisons, variable entre spécies, les conditions de culture, les classes de lipides, et des procédures analytiques. A titre d'exemple, plusieurs de ces variations sont causées par des différences dans l'absorption du colorant par les micro-algues. L'étalonnage en utilisant une autre méthode quantitative est donc nécessaire, de préférence effectuée pour toutes les différentes conditions de culture et les stades de croissance. Enfin, cette méthode ne fournit pas d'informations sur la composition en acides gras et est moins précise et reproductible que les méthodes de chromatographie en fonction.
La méthode présentée est basée sur la méthode décrite par Lamers et al. 23 et Santos et al. 24 et a également été appliquée par d'autres auteurs 1,25-27. Également d'autres méthodes sont disponibles qui sont basés sur les mêmes principes et pourraient fournir des résultats similaires 9,28.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le procédé décrit peut être utilisé pour déterminer le contenu ainsi que la composition des acides gras totaux présents dans la biomasse de micro-algues. Les acides gras dérivés de toutes les classes de lipides, y compris le stockage (TAG), ainsi que des lipides membranaires (phospholipides et glycolipides), sont détectés. Toutes les longueurs de chaîne d'acides gras et les degrés de saturation qui sont présentes dans les micro-algues peuvent être détectées et distinguées. La méthode est basée su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Une partie de ce travail a été soutenu financièrement par l'Institut pour la promotion de l'innovation par la science et de la technologie-recherche stratégique de base (IWT-SBO) Lumière du soleil de projet et les cellules Biosolar. Erik Bolder et BackKim Nguyen sont reconnus pour leur contribution à l'optimisation de la procédure de coups de talon.
Materials
| Reagent and equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| tripentadecanoin (C15:0 TAG) | Sigma Aldrich | T4257 | CAS Number 7370-46-9 |
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Sigma Aldrich | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Lipidox | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Larodan | ||
| Beadbeater | Bertin Technologies | Precellys 24 | |
| beadbeater tubes | MP Biomedicals | Lysing matrix E 116914500 |
|
| GC-FID | Hewlett-Packer | HP6871 | |
| GC column | Supelco | Nukol 25357 | |
| Positive displacement pipette 100-1000μl | Mettler Toledo | MR-1000 | |
| Positive displacement pipet tips C-1000 | Mettler Toledo | C-1000 | |
| Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml | VWR | 612-1925 | |
| glass tubes | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| Teflon coated screw-caps | VWR | SCERKSSR15415BY10 | |
| STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator | VWR | 445-2101 | |
| Heated Evaporator/Concentrator | Cole-Parmer | YO-28690-25 |
Referências
- Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
- Hu, Q., Sommerfeld, M., et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal. 54 (4), 621-639 (2008).
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances. 25 (3), 294-306 (2007).
- Draaisma, R. B., Wijffels, R. H., et al. Food commodities from microalgae. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (2), 169-177 (2012).
- Wijffels, R. H., Barbosa, M. J. An outlook on microalgal biofuels. Science. 329 (5993), 796-799 (2010).
- Wijffels, R. H., Barbosa, M. J., Eppink, M. H. M. Microalgae for the production of bulk chemicals and biofuels. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4 (3), 287-295 (2010).
- Guschina, I. A., Harwood, J. L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Progress in Lipid Research. 45 (2), 160-186 (2006).
- Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., et al. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production. BioEnergy Research. 1 (1), 20-43 (2008).
- Ryckebosch, E., Muylaert, K., Foubert, I. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae. Journal of the American Oil Chemists’ Society. 89 (2), 189-198 (2011).
- Laurens, L. M. L., Dempster, T. A., et al. Algal Biomass Constituent Analysis: Method Uncertainties and Investigation of the Underlying Measuring Chemistries. Analytical Chemistry. 84 (4), 1879-1887 (2012).
- Iverson, S. J., Lang, S. L. C., Cooper, M. H. Comparison of the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids. 36 (11), 1283-1287 (2001).
- Grima, E. M., Medina, A. R., et al. Comparison Between Extraction of Lipids and Fatty Acids from microalgal biomass. JAOCS. 71 (9), 955-959 (1994).
- Lee, J. Y., Yoo, C., Jun, S. Y., Ahn, C. Y., Oh, H. M. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresour Technol. 101, 75-77 (2010).
- Guckert, J. B., Cooksey, K. E., Jackson, L. L. lipid solvent systems are not equivalent for analysis of lipid classes in the micro eukaryotic green alga. Journal of Microbiological Methods. 8, 139-149 (1988).
- Pruvost, J., Van Vooren, G., Cogne, G., Legrand, J. Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor. Bioresource Technology. 100 (23), 5988-5995 (2009).
- Griffiths, M. J., Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Selection of Direct Transesterification as the Preferred Method for Assay of Fatty Acid Content of Microalgae. 45 (11), 1053-1060 (2010).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol. Chem. 226, 497-509 (1956).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Lepage, G., Roy, C. C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. Journal of Lipid research. 25, 1391-1396 (1984).
- Welch, R. W. A micro-method for the estimation of oil content and composition in seed crops. J. Sci. Food Agric. 28 (7), 635-638 (1002).
- Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., Hu, Q. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of Microbiological Methods. 77 (1), 41-47 (2009).
- Cooper, M. S., Hardin, W. R., Petersen, T. W., Cattolico, R. A. Visualizing “green oil” in live algal cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 109 (2), 198-201 (2010).
- Lamers, P. P., van de Laak, C. C., et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina. Biotechnology and Bioengineering. 106 (4), 638-648 (2010).
- Santos, A. M., Janssen, M., Lamers, P. P., Evers, W. A., Wijffels, R. H. Growth of oil accumulating microalga Neochloris oleoabundans under alkaline-saline conditions. Bioresour Technol. 104, 593-599 (2012).
- Mulders, K. J. M., Weesepoel, Y., et al. Growth and pigment accumulation in nutrient-depleted Isochrysis aff. galbana T-ISO. J. Appl. Phycol. , (2012).
- Kliphuis, A. M., Klok, A. J., et al. Metabolic modeling of Chlamydomonas reinhardtii: energy requirements for photoautotrophic growth and maintenance. J. Appl. Phycol. 24 (2), 253-266 (2012).
- Lamers, P. P., Janssen, M., De Vos, R. C. H., Bino, R. J., Wijffels, R. H. Carotenoid and fatty acid metabolism in nitrogen-starved Dunaliella salina, a unicellular green microalga. Journal of Biotechnology. 162 (1), 21-27 (2012).
- Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).
