Анализ жирных кислот содержание и состав микроводорослей
Summary
Способ определения содержания жирных кислот и состава микроводорослей на основе механического разрушения клеток, на основе экстракции липидов растворителем, переэтерификации и количественного и идентификации жирных кислот с использованием газовой хроматографии описано. Tripentadecanoin внутренний стандарт используется для компенсации возможных потерь при добыче и неполной переэтерификации.
Abstract
Способ для определения содержания и состава общего количества жирных кислот, присутствующих в микроводорослей описывается. Жирные кислоты являются основным компонентом микроводорослей биомассы. Эти жирные кислоты могут присутствовать в различных ацил-липидной классов. Особенно жирные кислоты, присутствующие в триацилглицерина (TAG) имеют коммерческий интерес, потому что они могут быть использованы для производства транспортного топлива, сыпучих химических веществ, биологически активные добавки (ω-3 жирных кислот), а также продовольственных товаров. Чтобы разрабатывать коммерческие приложения, надежные аналитические методы для количественного определения содержания кислоты жирного и состава необходимы. Микроводорослей одиночные клетки, окруженные жесткой клеточной стенки. Метод анализа жирных кислот должно обеспечить нарушение достаточное клеток, чтобы освободить все ацильные липиды и процедуры экстракции используется должны быть в состоянии извлечь все классы ацил липидные.
С метод, представленный здесь все жирные кислоты, присутствующие в микроводорослей можно точно и воспроизводимо тождающиеся и количественно, используя небольшое количество образца (5 мг) независимо от их длины цепи, степени ненасыщенности или класса липидов они являются частью.
Этот метод не дает информации о относительного обилия различных классов липидов, но может быть продлен, чтобы отделить классы липидов друг от друга.
Метод основан на последовательности механическое разрушение клеток, экстракции липидов на основе растворителя, переэтерификацией жирных кислот в метиловых эфиров жирных кислот (Fames), а также количества и идентификации МЭЖК с использованием газовой хроматографии (GC-FID). TAG внутренний стандарт (tripentadecanoin) добавляется до аналитической процедуры для коррекции потерь при добыче и неполной переэтерификации.
Introduction
Жирные кислоты являются одним из основных компонентов микроводорослей биомассы и обычно составляют от 5-50% клеточной сухого веса 1-3. Они в основном присутствуют в виде глицеролипидов. Эти глицеролипиды, в свою очередь состоят в основном из фосфолипидов, гликолипидов и триглицеридов (TAG). Особенно жирные кислоты, присутствующие в TAG имеют коммерческий интерес, потому что они могут быть использованы в качестве ресурса для производства транспортного топлива, сыпучих химических веществ, биологически активные добавки (ω-3 жирных кислот), а также продовольственных товаров 3-6. Микроводорослей может расти в морской воде на основе выращивания СМИ, может иметь гораздо более высокую поверхностную производительность, чем наземных растений, и могут быть выращены в фотобиореакторов в местах, непригодных для сельского хозяйства, возможно, даже в море. По этим причинам, микроводоросли часто считают перспективной альтернативой наземных растений для производства биодизеля и других сыпучих продуктов 3-6. не Потенциально не сельскохозяйственного ли или пресная вода (при культивировании в закрытых фотобиореакторов или когда морские водоросли используются) необходим для их производства. Таким образом, биотопливо, полученные из микроводорослей считаются 3 биотопливо й поколения.
Общий клеточный содержание жирных кислот (% от сухого веса), состав класса липидов, а также длины жирных кислот и степени насыщения сильно варьируют между микроводорослей видов. Кроме того, эти свойства меняются в зависимости от условий культивирования, такие как наличие питательных веществ, температуры, рН и интенсивности света 1,2. Например, при воздействии азотного голодания, микроводоросли могут накапливаться в больших количествах TAG. При оптимальных условиях роста TAG обычно составляет менее 2% от сухого веса, но при контакте с азотного голодания содержания TAG может увеличиться до до 40% от микроводорослей сухого веса 1.
Микроводорослей в основном производят жирные кислоты с длиной цепи от 16 до 18атомы углерода, но некоторые виды могут сделать жирных кислот вплоть до 24 атомов углерода в длину. Оба насыщенный а также ненасыщенных жирных кислот получают путем микроводорослей. К последним относятся жирные кислоты с питательной ценности (ω-3 жирных кислот), как С20: 5 (эйкозапентаеновая кислота; ЭПК) и С22: 6 (докозагексаеновая кислота; DHA), для которых нет растительные альтернативы не существуют 1,2,4,7. (Распределение) жировой длины цепи кислоты и степени насыщения также определяет свойства и качества водорослей, полученных биотоплива и пищевыми маслами 4,8.
Для разработки коммерческих приложений микроводорослей происходит жирных кислот, надежные аналитические методы для количественного определения содержания кислоты жирного и состава необходимы.
Кроме того, как указал Ryckebosch др.. 9, анализ жирных кислот в микроводорослей отличается от других субстратов (например, растительное масло, продукты питания, ткани животных и т.д.) бытьвызвать 1) микроводорослей одиночные клетки, окруженные жесткими стенками клеток, что затрудняет экстракции липидов, 2) микроводоросли содержат широкий спектр классов липидов и распределение липидов класс сильно варьирует 7. Эти различные классы липидов имеют широкий спектр по химической структуре и свойствам, таким как полярности. Кроме того, липидные классы, кроме ацильных липидов производятся; 3) микроводоросли содержат широкий спектр жирных кислот, в пределах от 12-24 атомов углерода в длину и содержит как насыщенные, так и ненасыщенных жирных кислот. Таким образом, методы, разработанные для анализа жирных кислот в других, чем микроводорослей субстратов, могут не подходить для анализа жирных кислот в микроводорослей.
Как показали в Ryckebosch др.. 9, основное различие между наиболее часто используемых процедур экстракции липидов в растворителя-систем, которые используются. Из-за большого разнообразия липидных классов, присутствующих в микроводорослей, каждый разной полярности, извлеченныйколичество липидов будет варьировать в зависимости растворителей, используемых 10-12. Это приводит к несогласованности в содержании липидов и композиции, представленные в литературе 9,10. В зависимости от системы используемого растворителя, методы, основанные на экстракции растворителем без разрушения клеток через, например, шарик избиение или ультразвуком, не могли бы извлечь все липиды из-за жесткой конструкции некоторых видов микроводорослей 9,13. В случае неполного экстракции липидов, эффективность экстракции из различных классов липидов может изменяться 14. Это также может оказывать влияние на измеренного состава жирных кислот, так как состав жирных кислот является переменной между липидными классов 7.
Наша методика основана на последовательности механическое разрушение клеток, экстракции липидов на основе растворителя, переэтерификацией жирных кислот в метиловых эфиров жирных кислот (Fames), а также количества и идентификации МЭЖК с использованием газовой хроматографии в сочетании с ионизации пламениДетектор уравнение (GC-FID). Внутреннего стандарта в виде триглицеридов (tripentadecanoin) добавляют до аналитической процедуры. Возможные потери при добыче и неполного переэтерификации затем могут быть исправлены в течение. Метод может быть использован для определения содержания а также состав жирных кислот, присутствующих в микроводорослей биомассы. Все жирные кислоты, присутствующие в различных ацил-липидной классов, включая хранение (TAG), а также мембранные липиды (фосфолипиды, гликолипиды), которые обнаружены, определенные и количественно точно и воспроизводимо этим методом, используя только небольшое количество образца (5 мг) . Этот метод не дает информации о относительного обилия различных классов липидов. Однако метод может быть расширен, чтобы отделить классы липидов друг от друга 1. Состав концентрация кислоты и жирных из различных классов липидов может быть определена индивидуально.
В литературе несколько другие методыописано для анализа липидов в микроводорослей. Некоторые методы сосредоточиться на общих липофильных компонентов 15, в то время как другие методы сосредоточиться на общего количества жирных кислот 9,16. Эти альтернативы включают весового определения общего извлеченных липидов, прямой транс-этерификации жирных кислот в сочетании с количественной использованием хроматографии, и окрашивания клеток с липофильных красителей люминесцентных.
Обычно используется альтернатива количественной оценки жирных кислот с использованием хроматографии является количественная оценка липидов с помощью весового определения 17,18. Преимущества весового определения являются отсутствие требований к передовой и дорогостоящего оборудования, как газовый хроматограф; облегчить настроить процедуру, из-за наличия стандартизированного аналитического оборудования (например Сокслета) и гравиметрические определения меньше времени, чем хроматографии на основе методов. Основное преимущество использования хроматографию, основанную на методы др.ER рука является то, что в таком способе измеряют только жирные кислоты. В весовом определении не-жирной кислоты, содержащий липиды, как пигменты или стероидов, также учитывается при определении. Эти не жирных кислот, содержащие липиды могут составить значительную долю (> 50%) общих липидов. Если заинтересован только в содержания жирных кислот (например, для применения биодизеля), он будет переоценить при использовании гравиметрических определение. Кроме того, в весовом определении точность аналитических весах используются для взвешивания извлеченные липиды определяет размер выборки, которая должна быть использована. Эта величина обычно значительно больше, чем количество, необходимое при использовании хроматографии. И, наконец, еще одно преимущество с помощью хроматографии на весового определения является то, что хроматографии дает информацию о составе жирных кислот.
Еще одной альтернативой нашей предложенного метода является прямым переэтерификации 16,19,20.В этом методе экстракции липидов и переэтерификации жирных кислот в МЭЖК объединены в одну стадию. Этот способ быстрее, чем отдельный экстракции и переэтерификации шаг, но сочетания этих шагов ограничивает растворители, которые могут быть использованы для извлечения. Это может негативно повлиять эффективность экстракции. Еще одним преимуществом отдельного экстракции липидов и переэтерификации стадии, что она позволяет для дополнительного разделения класса липидов между этими шагами 1. Это невозможно при использовании прямой переэтерификации.
Другие часто используемые методы для определения содержания липидов в микроводорослей включают окрашивания биомассы с липофильных флуоресцентных красителей, таких как Нил красный или BODIPY и измерения сигнала флуоресценции 21,22. Преимуществом этих методов является то, что они менее трудоемкий, чем альтернативные методы. Недостатком этих методов является то, что флуоресцентный ответ, по разным причинам, переменная между SPECIэс, условия культивирования, классы липидов и аналитические процедуры. В качестве примера, некоторые из этих изменений обусловлены различия в поглощения красителя в микроводорослей. Калибровка с помощью другого количественный метод Поэтому необходимо, предпочтительно выполняется для всех различных условий культивирования и стадий роста. Наконец, этот метод не дает информации о составе жирных кислот и является менее точным и воспроизводимым, чем хроматографии на основе методов.
Представленный способ основан на методике, описанной Lamers соавт. 23 и Santos соавт. 24 и также применяется в различных других авторов 1,25-27. Существуют и другие методы доступны, которые основаны на тех же принципах и может обеспечить аналогичные результаты 9,28.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный способ может быть использован, чтобы определить содержание а также состав общего количества жирных кислот, присутствующих в микроводорослей биомассы. Жирные кислоты, полученные из всех классов липидов, включая хранение (TAG), а также мембранные липиды (фосфолипиды и гликолипи…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Часть этой работы выполнена при финансовой поддержке Института содействия инновациям по науке и технике Стратегический фундаментальных исследований (ВВТ-СБО) проекта солнечного света и BioSolar клеток. Эрик Болдер и BackKim Нгуен признаны за их вклад в оптимизации процедуры избиения борта.
Materials
| Reagent and equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| tripentadecanoin (C15:0 TAG) | Sigma Aldrich | T4257 | CAS Number 7370-46-9 |
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Sigma Aldrich | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Lipidox | ||
| TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample | Larodan | ||
| Beadbeater | Bertin Technologies | Precellys 24 | |
| beadbeater tubes | MP Biomedicals | Lysing matrix E 116914500 |
|
| GC-FID | Hewlett-Packer | HP6871 | |
| GC column | Supelco | Nukol 25357 | |
| Positive displacement pipette 100-1000μl | Mettler Toledo | MR-1000 | |
| Positive displacement pipet tips C-1000 | Mettler Toledo | C-1000 | |
| Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml | VWR | 612-1925 | |
| glass tubes | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| Teflon coated screw-caps | VWR | SCERKSSR15415BY10 | |
| STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator | VWR | 445-2101 | |
| Heated Evaporator/Concentrator | Cole-Parmer | YO-28690-25 |
Referências
- Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
- Hu, Q., Sommerfeld, M., et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal. 54 (4), 621-639 (2008).
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances. 25 (3), 294-306 (2007).
- Draaisma, R. B., Wijffels, R. H., et al. Food commodities from microalgae. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (2), 169-177 (2012).
- Wijffels, R. H., Barbosa, M. J. An outlook on microalgal biofuels. Science. 329 (5993), 796-799 (2010).
- Wijffels, R. H., Barbosa, M. J., Eppink, M. H. M. Microalgae for the production of bulk chemicals and biofuels. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4 (3), 287-295 (2010).
- Guschina, I. A., Harwood, J. L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Progress in Lipid Research. 45 (2), 160-186 (2006).
- Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., et al. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production. BioEnergy Research. 1 (1), 20-43 (2008).
- Ryckebosch, E., Muylaert, K., Foubert, I. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae. Journal of the American Oil Chemists’ Society. 89 (2), 189-198 (2011).
- Laurens, L. M. L., Dempster, T. A., et al. Algal Biomass Constituent Analysis: Method Uncertainties and Investigation of the Underlying Measuring Chemistries. Analytical Chemistry. 84 (4), 1879-1887 (2012).
- Iverson, S. J., Lang, S. L. C., Cooper, M. H. Comparison of the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids. 36 (11), 1283-1287 (2001).
- Grima, E. M., Medina, A. R., et al. Comparison Between Extraction of Lipids and Fatty Acids from microalgal biomass. JAOCS. 71 (9), 955-959 (1994).
- Lee, J. Y., Yoo, C., Jun, S. Y., Ahn, C. Y., Oh, H. M. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresour Technol. 101, 75-77 (2010).
- Guckert, J. B., Cooksey, K. E., Jackson, L. L. lipid solvent systems are not equivalent for analysis of lipid classes in the micro eukaryotic green alga. Journal of Microbiological Methods. 8, 139-149 (1988).
- Pruvost, J., Van Vooren, G., Cogne, G., Legrand, J. Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor. Bioresource Technology. 100 (23), 5988-5995 (2009).
- Griffiths, M. J., Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Selection of Direct Transesterification as the Preferred Method for Assay of Fatty Acid Content of Microalgae. 45 (11), 1053-1060 (2010).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol. Chem. 226, 497-509 (1956).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Lepage, G., Roy, C. C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. Journal of Lipid research. 25, 1391-1396 (1984).
- Welch, R. W. A micro-method for the estimation of oil content and composition in seed crops. J. Sci. Food Agric. 28 (7), 635-638 (1002).
- Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., Hu, Q. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of Microbiological Methods. 77 (1), 41-47 (2009).
- Cooper, M. S., Hardin, W. R., Petersen, T. W., Cattolico, R. A. Visualizing “green oil” in live algal cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 109 (2), 198-201 (2010).
- Lamers, P. P., van de Laak, C. C., et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina. Biotechnology and Bioengineering. 106 (4), 638-648 (2010).
- Santos, A. M., Janssen, M., Lamers, P. P., Evers, W. A., Wijffels, R. H. Growth of oil accumulating microalga Neochloris oleoabundans under alkaline-saline conditions. Bioresour Technol. 104, 593-599 (2012).
- Mulders, K. J. M., Weesepoel, Y., et al. Growth and pigment accumulation in nutrient-depleted Isochrysis aff. galbana T-ISO. J. Appl. Phycol. , (2012).
- Kliphuis, A. M., Klok, A. J., et al. Metabolic modeling of Chlamydomonas reinhardtii: energy requirements for photoautotrophic growth and maintenance. J. Appl. Phycol. 24 (2), 253-266 (2012).
- Lamers, P. P., Janssen, M., De Vos, R. C. H., Bino, R. J., Wijffels, R. H. Carotenoid and fatty acid metabolism in nitrogen-starved Dunaliella salina, a unicellular green microalga. Journal of Biotechnology. 162 (1), 21-27 (2012).
- Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).
