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Bioengineering

Glycoengineering metabólica do ácido siálico usando N-acil-modificado Mannosamines

Published: November 25, 2017 doi: 10.3791/55746
Automatic Translation
1,2, 3
1Max von Pettenkofer-Institut & Genzentrum, Virologie, Nationales Referenzzentrum für Retroviren, Medizinische Fakultät, LMU München, 2Institut für Laboratoriumsmedizin, klinische Chemie und Pathobiochemie, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Institut für Physiologische Chemie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Summary

Ácido siálico é uma monossacarídeo-unidade típica encontrada em glicoconjugados. Está envolvido em uma infinidade de interações moleculares e celulares. Aqui nós apresentamos um método para modificar a expressão de superfície de ácido siálico célula usando glycoengineering metabólica com derivados de N- acetylmannosamine.

Abstract

Ácido siálico (Sia) é um componente altamente importante de glicoconjugados, tais como N- e O- os glicanos ou glicolipídeos. Devido à sua posição na termini não-redução de oligo - e polissacarídeos, bem como suas características químicas únicas, ácido siálico é envolvido em uma infinidade de interações ligante-receptor diferente. Modificando a expressão de ácido siálico na superfície das células, dependentes de ácido siálico interações serão influenciadas consequentemente. Isto pode ser útil para investigar interações ácido siálico-dependente e tem o potencial para influenciar certas doenças de uma forma benéfica. Via metabólica glycoengineering (MGE), a expressão de ácido siálico na superfície da pilha pode ser modulada. Neste documento, células, tecidos ou mesmo todo animais são tratados com C2-modificado derivados de N- acetylmannosamine (ManNAc). Estes aminoácidos açúcares atuam como moléculas de ácido siálico precursor e, portanto, são metabolizados para ácido siálico espécie correspondente e expressa na glicoconjugados. Aplicar este método produz efeitos intrigantes sobre diversos processos biológicos. Por exemplo, ele pode reduzir drasticamente a expressão de ácido polysialic (polySia) em células neuronais tratadas e afeta, portanto, diferenciação e crescimento neuronal. Aqui, nós mostramos a síntese química de duas das mais comuns derivadas - acylmannosamine C2-modificado N, N- propionylmannosamine (ManNProp) bem como o N- butanoylmannosamine (ManNBut) e ainda mostrar como esses não-naturais aminoácidos açúcares podem ser aplicados em experiências da cultura de pilha. A expressão de espécies modificadas ácido siálico é quantificada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e mais analisada através de espectrometria de massa. Os efeitos sobre a expressão de ácido polysialic são elucidados através de Western blot utilizando um anticorpo ácido polysialic comercialmente disponível.

Introduction

Ácido siálico é um monossacarídeo que normalmente pode ser encontrado na termini não-redução de glicoconjugados, tais como N- e O- os glicanos ou glicolipídeos. Entre todos os monossacarídeos, ácido siálico tem algumas características químicas únicas. Tem um backbone de átomo C 9, um grupo carboxílico na posição C-1, que é deprotonado e, assim, negativamente carregadas sob condições fisiológicas e uma função amino na posição C-5. Embora a data1, caracterizaram-se mais de 50 naturais variantes de ácido siálico, a forma predominante de ácido siálico, encontrado em seres humanos é N- acetilneuramínico ácido (Neu5Ac). Outros mamíferos também expressam quantidades mais elevadas de N- glycolylneuraminic ácido (Neu5Gc)2,3.

Devido à sua posição exposta em glicoconjugados, ácido siálico é envolvido em uma infinidade de interações ligante-receptor, por exemplo, a vinculação dependente de hemaglutinina do vírus da gripe ao anfitrião células4. Um epítopo de ácido siálico, com importantes funções biológicas, especialmente durante a embriogênese e no sistema nervoso, é o ácido polysialic. O ácido Polysialic é um polímero de até 200 ácidos siálicos de 2,8-lig alfa. O portador de proteína principal do ácido polysialic é a molécula de adesão celular neural (NCAM). Polysialic ácido expressão modula a propriedade adesiva da NCAM em que polysialic ácido expressão diminui a adesão e aumenta a plasticidade com o sistema nervoso5.

Alterações na expressão de ácido siálico de (poli) acabará por afectar uma infinidade de interações biológicas diferentes. Isso pode ser usado para estudar processos dependentes de conhecido de ácido siálico em um nível molecular, para descobrir o romance glicoconjugado interações, ou explorar possíveis abordagens terapêuticas. Existem diferentes métodos disponíveis pelo qual a expressão de ácido siálico na superfície da pilha pode ser modulada, por exemplo, tratamento com ácido siálico glicosidases específico (sialidases), inibição de enzimas envolvidas na biossíntese de ácido siálico6 ,7,8, ou derrubando ou mudar a expressão da enzima chave da biossíntese de ácido siálico9.

Outro método versátil para modular a expressão de ácido siálico é MGE (engenharia metabólica também conhecido como oligossacarídeo, MOE). Neste documento, células, tecidos ou até os animais são tratados com não-naturais derivados de ManNAc que levam a modificações C2-amino. Sendo moléculas precursoras para o ácido siálico, após a absorção celular, estes análogos de ManNAc são metabolizados para não-natural unidirecionais siálico ácidos e podem ser expressa na sialylated glicoconjugados. As células tratadocom com derivados de ManNAc carregando C2-modificações alifáticas, tais como ManNProp ou ManNBut, incorporar ácido de N- propionylneuraminic (Neu5Prop) ou N- butanoylneuraminic acid (Neu5But) em seus glicoconjugados10 , 11. usando grupos funcionais apresentados a posição C2 de ManNAc, podem ser acoplados os ocorrendo ácidos siálicos não-naturais, por exemplo, através da ligadura de Staudinger ou a azida alkine cicloadição, com corantes fluorescentes e, portanto, visualizado na superfície celular12.

A expressão destes ácidos siálicos do não-natural tem efeitos intrigantes em muitos processos biológicos, incluindo infecções do patógeno, a adesão e migração de células tumorais, adesão celular geral, bem como vascularização e diferenciação (para revisão Ver: Wratil et al . 13). Curiosamente, MGE com N-acil modificado mannosamines também pode ser usado para interferir com a expressão de ácido polysialic. O ácido Polysialic é gerado por dois polysialyltransferases diferentes (ST8SiaII e ST8SiaIV). Foi demonstrado, que polysialyltransferase ST8SiaII é inibida pela natural ácido siálico precursores, tais como ManNProp ou ManNBut de14,15. Além disso, foi demonstrado em células de neuroblastoma humano que ManNProp ou ManNBut aplicativo reduz também sialylation no total15.

MGE com N-acil modificado mannosamines é um fácil de aplicar o método que tem sido utilizado com sucesso, não só em mamíferos e cultura de células de bactérias mas também em toda animais de diferentes espécies, tais como Caenorhabditis elegans16, zebrafish17ou18,de ratos a19,20,21. Especialmente ManNAc derivados alifáticas modificações, incluindo ManNProp e ManNBut, do rolamento são insignificante citotóxicos, mesmo em concentrações milimolar em meio de cultura celular ou plasma sanguíneo. Além disso, eles são relativamente fáceis de sintetizar.

Aqui, nós fornecemos detalhes sobre como usar o MGE com N-acetil modificado mannosamines. Primeiro, a síntese química de dois dos mais utilizados derivativos ManNAc neste campo, ManNProp e ManNBut, é explicado. Em seguida, mostramos como MGE pode ser aplicada em um experimento na vivo . Como exemplo, a linhagem de células de neuroblastoma Kelly foi escolhida para demonstrar a diminuição da expressão do epítopo polysialic por Western blot após o tratamento com os derivados de ManNAc. Os ácidos siálicos não-natural na superfície da pilha foram quantificados por CLAE e mais analisados através de espectrometria de massa.

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Protocol

1. preparação dos reagentes e Buffers

  1. Preparação da solução de metóxido de sódio 3 mM
    1. Dissolva o metóxido de sódio 8,1 mg em 50 mL de metanol (3 mM) em um frasco de vidro de 100 mL com uma barra de agitação. Armazenar em temperatura ambiente (RT) durante várias semanas.
  2. Preparação de tampão Tris-HCl
    1. Combinar a 8,766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl e 146 mg de EDTA em uma garrafa de vidro de 100 mL com uma barra de agitação e dissolver em 80 mL de água.
    2. Adicionar o hidróxido de sódio (1 M, em água) ou HCl (20%, em água) para a solução de agita, enquanto observa o pH com um medidor de pH e ajustar o pH para 8,0.
    3. Adicione o volume de água necessário para alcançar um volume final de 100 mL. Filtre a solução através de um sistema de filtro estéril de 0,22 µm.
      Nota: a reserva de 100 mL de Tris-HCl conterá 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl e 5 mM EDTA (pH 8.0). A solução pode ser armazenada a 4 ° C durante várias semanas.
  3. Preparação da solução de aprotinina
    1. Dissolva a aprotinina 10 mg em 1 mL de água (1,54 mM). Alíquota da solução de aprotinina em 10 x 1,5 mL-plástico tubos (100 µ l cada). Armazenar a-20 ° C durante várias semanas.
  4. Preparação da solução de leupeptin
    1. Dissolva leupeptin 10 mg em 2 mL de água (10 mM). Alíquota da solução leupeptin 10 x 1,5 mL-plástico tubos. Armazenar a-20 ° C durante várias semanas.
  5. Preparação da solução de fluoreto (PMSF) phenylmethylsulfonyl
    1. Dissolva 34,8 mg PMSF em 2 mL de etanol (100 mM). Alíquota da solução PMSF em 10 x 1,5 mL-plástico tubos. Armazenar a-20 ° C durante várias semanas.
  6. Preparação da solução de 1,2-diamino-4,5-methyldioxybenzol-dicloridrato (DMB)
    1. Combine 15,62 mg DMB, 352 µ l β-Mercaptoetanol e solução bissulfito de sódio 48 µ l (39%) e adicionar água de 9,6 mL (6,9 mM DMB, 500mm β-Mercaptoetanol e 0,19% bissulfito de sódio). Alíquota da solução DMB em 40 x 1,5 mL-plástico tubos (250 µ l cada). Armazenar protegido da luz, a-20 ° C durante várias semanas.
  7. Preparação 1 M trifluoroacético (TFA) da solução de ácido
    1. Adicione 770.3 µ l de 100% TFA para 9,23 mL de água em um tubo plástico de 15 mL (1 M). Armazenar a 4 ° C durante várias semanas.
  8. Preparação da solução de TFA de 120 mM
    1. Adicione 92.4 µ l TFA (100%) para 9,91 mL de água (120 mM) em um tubo plástico de 15 mL. Armazenar a 4 ° C durante várias semanas.
  9. Preparação da solução de hidróxido de sódio (NaOH) de 400 mM
    1. 160 mg de NaOH em 10 mL de água (400 milímetros) em um tubo plástico de 15 mL, dissolva. Armazenar a 4 ° C durante várias semanas.
  10. Preparação de Lise borrão ocidental
    1. Dissolver 5,84 g NaCl, 0,1 g de Tris (hidroximetil)-aminomethan (Tris), 0,1 g de CaCl2, 0,95 g MgCl2e Triton-X100 1G em 100 mL de água e ajustar o pH a 7,8. Loja a 4 ° C. Adicione 100 µ l de cada inibidor de protease (aprotinina, leupeptin e PMSF) antes de usar o tampão de Lise.
  11. Preparação do tampão de eletroforese (SDS-PAGE) do sódio Dodecil sulfato gel de poliacrilamida
    1. Dissolver 0,3 g Tris glicina 1,5 g e 0,1 g SDS em 100 mL de água e ajustar o pH para 7,3. Loja em RT.
  12. Preparação do buffer de borrão ocidental
    1. Dissolver 0,3 g Tris, glicina 1,1 g em 90 mL de água e adicionar 10 mL de etanol. Loja em RT.
  13. Preparação da solução de bloqueio
    1. Dissolva 1 g de poder de gordura de leite grátis na salina de 25 mL tamponada fosfato (PBS). Sempre prepare fresco.

2. síntese de ManNProp e afins N-acil-modificado Mannosamines

  1. Dissolva o cloridrato de mannosamine 431,2 mg em 10 mL solução de metóxido de sódio de 3 mM em um frasco de vidro de 50 mL com uma barra de agitação.
  2. Arrefecer a mistura no gelo a 0 ° C. Para a solução de agita, adicione lentamente cloreto de propionil gota 210 µ l (2,4 mmol), ou cloreto de butanoyl 248 µ l (2,4 mmol) para sintetizar ManNProp ou ManNBut, respectivamente. Incube a mistura mexendo a 0 ° C, durante 4 h.
  3. Transferi a solução para um tubo de plástico de 50 mL. Picar furos de 4-8 na tampa do tubo plástico com uma agulha fina. Congelar rapidamente a solução usando nitrogênio líquido e posteriormente lyophilize (gelo seco) para 48 h ou até que esteja completamente seca.
  4. 350 g de gel de sílica 60 se misturam com 750ml etil-acetato/metanol/água (15:2:1) (esta é uma suspensão). Preencher uma coluna de vidro (35 mm de diâmetro e 70 cm de comprimento) com a suspensão de sílica gel 60 e lavar a coluna preparada com uma adicional de 100 mL etil-acetato/metanol/água (15:2:1) antes do uso.
  5. Dissolver os produtos secos da etapa 2.3 (produto de 5 g secada) em 10 mL etil-acetato/metanol/água (15:2:1) e carga-los usando uma pipeta para a sílica gel de coluna. Colete frações 4 mL após 500 mL (para ManNProp). Nota: ManNBut vai eluir da coluna aproximadamente depois de 700 mL.
  6. Transferi as frações eluted para tubos de plástico de 15 mL. Picar 3-6 furos na tampa do tubo plástico com uma agulha fina. Rapid congelar a solução usando nitrogênio líquido e posteriormente lyophilize-la até que esteja completamente seca.
    Nota: Os produtos liofilizados podem ser armazenados por vários meses no RT
  7. Verificar a pureza dos produtos por espectrometria de massa (ver seção 9).
    Nota: Como alternativa, pureza também pode ser verificada por 1H. ressonância magnética Nuclear (RMN).

3. cultura celular

  1. Células de neuroblastoma Kelly cultura meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contendo 10% de soro fetal bovino, 100 U penicilina, estreptomicina 100 mg, 2 mM L-glutamina contendo 5 mM ManNAc, ManNProp de 5 mM ou 5 mM ManNBut, a 37 ° C e 5% de CO2.
    Nota: As células cultivadas em meio sem ManNAc ou seus análogos são usadas como um controle.
  2. Antes da aplicação do mannosamines, separar as células de neuroblastoma Kelly incubando-os por 10 min com tripsina/EDTA (0,25%, 0,02%, em PBS) e conta usando um contador-câmara de Neubauer ou célula. As células com números definidos com base no tamanho do prato/placa de semente.
    1. Para medir os monossacarídeos ácido siálico, sementes 1 x 105 células no meio de 500 µ l para uma placa de cultura de tecidos de 48-bem. Para a análise de ácidos polysialic, sementes 1 x 106 células em 3 mL de meio numa placa de cultura de células de diâmetro de 6 cm. Incube a 37 ° C e 5% de CO2. Substitua o medium cada 24 h.
      Nota: O efeito da MGE aumenta com o tempo total de tratamento. Para alta eficiência metabólica trate as células de 5-7 dias.
  3. Após o tratamento, decante o meio. Lave os pratos/placas com PBS. Separe as células incubando-os por 10 min com tripsina/EDTA (0,25%, 0,02%, em PBS). Neutralize a tripsina, adicionando o mesmo volume de meio de cultura celular para as células desanexadas. Transferi as células destacadas para tubos de plástico de 15 mL. Centrifugar as amostras por 3 min a 500 x g e descartar o sobrenadante.
    1. Adicione células de PBS e centrífuga de 5 mL (ver passo 3.3). Repita o procedimento de lavagem mais duas vezes.
      Nota: O centrifugado lavados sem sobrenadante pode ser armazenado a-20 ° C por vários dias. Se a expressão de ácido polysialic é para ser elucidado continuam a seção 10.

4. Lysis da pilha para análise HPLC

  1. Preparação de tampão de Lise HPLC
    1. Combine o tampão Tris-HCl de 5 mL, 5 µ l aprotinina solução, solução de leupeptin 20 µ l e solução PMSF 50 µ l.
      Nota: 5 mL de tampão de Lise HPLC conterá 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 µM aprotinina, 40 µM Leupeptin e 1 mM PMSF (pH 8.0). Esse buffer deve estar sempre preparado fresco antes da lise celular.
  2. Ressuspender as células coletadas Pelotas (passo 3.3) cada em 500 µ l gelada HPLC-Lise e ultraproceda à sonicação as amostras com uma agulha de processador ultrasônico três vezes durante um período de 30 s às amplitudes de média-alta. Fixe as amostras no gelo pelo menos 1 min entre os ciclos.

5. separação da fração de membrana

  1. Centrifugar as amostras de células lisados por 2 h a 20.000 x g e 4 ° C. Separe o sobrenadante (aproximadamente 480 µ l), representando as proteínas cytosolic, em tubos plásticos de 1,5 mL. Determine a concentração de proteína destas frações usando, por exemplo, o Bradford ou ensaio bicinchoninic ácido (BCA).
    Nota: A concentração de proteína (aproximadamente 1 mg/mL) das frações citosólica mais tarde pode estar relacionada com a mediu a quantidade de espécies respeitado ácido siálico. A pelota representa a fração de membrana, que é usada na etapa 6.1.

6. ácido hidrólise

Nota: Oligo - e polissacarídeos nas membranas celulares são hidrolisados a monossacarídeos. Além disso, possível O-modificações nos monossacáridos são hidrolisadas, também. Isto é necessário para a análise quantitativa de HPLC, porque a esmagadora maioria dos ácidos siálicos nas fracções da membrana é naturalmente incorporada em glicoconjugados e possivelmente pode suportar O-acetil ou O- lactolyl modificações.

  1. Adicionar 150 µ l M 1 TFA-solução para as frações separadas da membrana (pelota da seção 5). Incube as amostras por 4 h a 80 ° C com agitação a 200-600 rpm.
  2. Centrifugar as amostras por aproximadamente 30 min em 20.000 x g e 21 ° C, utilizando tubos de filtro de 0,5 mL com 3 membranas de exclusão kDa, até que o volume da fase superior é inferior a 20 µ l.
    Nota: Este passo é importante para eliminar detritos molecular superior.
  3. Transferi a fase inferior contendo moléculas menores, incluindo as espécies de ácido siálico, para tubos de plástico de 2 mL. Picar furos de 2-4 para as tampas dos tubos de plástico com uma agulha fina. Rapid congelar as amostras usando nitrogênio líquido e depois lyophilize-los durante a noite.
    Nota: As amostras secas podem ser armazenadas por vários dias no RT. Replace um boné sem buracos para conservação mais longa.

7. fluorescente de rotulagem

  1. Re-suspender as amostras secas em solução de TFA 10 µ l 120 mM e adicionar 50 µ l de solução DMB. Transferi as amostras para tubos de escuro 1,5 mL para protegê-los de luz ultravioleta.
  2. Para os padrões, dissolver 1 µ l Neu5Ac (60 ng/mL, em água) ou 1 µ l Neu5Gc (60 ng/mL, em água) em 10 µ l 120mm TFA solução tubos escuros 1,5 mL. Adicione 50 µ l solução DMB.
  3. Incubar as amostras da membrana celular e os padrões para 1,5 h a 56 ° C protegido da luz. Após a incubação, adicione 4 µ l de solução de NaOH de 400mm para cada amostra para parar a reação de rotulagem.

8. HPLC análise

Nota: Amostras etiquetadas são analisadas em um sistema HPLC equipado com uma coluna C18 RP (110 Å, tamanho de partícula de 3 µm, 4.6 x 150 mm), um detector de fluorescência e um coletor de fração. Os solventes usados são o metanol, acetonitrila e água. Certifique-se de desgaseificar todos os solventes antes da medição, se o sistema HPLC carece de um desgaseificador interno.

  1. Definir a temperatura da coluna a 40 ° C e configurar o detector de fluorescência com 373 nm de excitação e 448 nm por emissão, respectivamente. Injetar o volume de amostra 10 µ l e separar as sondas por 50 min na taxa de fluxo de 0,5 mL/min com água/metanol/acetonitrilo (6:8:86) como eluente. Para análise de espectrometria de massa, recolha os picos de interesse.
    Nota: Neu5Gc deverá eluído após 6-8 min, Neu5Ac após 9-12 min, Neu5Prop depois de 17-23 min e Neu5But após 38-44 min. As amostras fracionadas podem ser armazenadas por vários h a 4 ° C, protegido da luz.
  2. Após a medição de cada amostra, lavar a coluna para 7,5 min a taxa de fluxo de 1,0 mL/min (≈ 1,5 volume) com água/metanol/acetonitrilo (6:25:69) e re-equilibrar o sistema para 7,5 min, a taxa de fluxo de 1,0 mL/min com água/metanol/acetonitrilo (6:8:86).
  3. Para análise quantitativa, calcule a área sob a curva dos picos de interesse usando o software operacional do respectivo sistema de HPLC-22ácido siálico.
    Nota: Os dados obtidos podem ser relacionados para o Neu5Ac ou o padrão de Neu5Gc e as concentrações de proteína medido nas fracções citosólica (ver secção 5.1).

9. espectrometria análise de monossacarídeos ácido siálico

Nota: Picos de retenção HPLC de interesse podem ser mais analisados por espectrometria maciça de cromatografia líquida (LC)-ionização electrospray (ESI-MS), a fim de verificar a espécie natural ácido siálico.

  1. Para análise de espectrometria de massa, injetar 20 µ l de amostra coletada em um sistema Detector seletivo LC/massa (MSD) com metanol de 79,9%, 20% de álcool isopropílico e 0,1% de ácido fórmico como eluente, taxa de fluxo de 0,5 mL/min, 4 kV tensão capilar e 350 ° C temperatura capilar 22 , 23.
  2. Do software de avaliação do respectivo sistema LC/MSD, selecione o pico de interesse no cromatograma total do íon. Ver os o espectro de massa do pico resolvido. Exiba a relação massa/carga positiva entre 300 e 700.
    Nota: DMB rotulagem de ácidos siálicos leva a um aumento na massa molecular de 116,2 g/mol. As espécies de DMB-rotulado o ácido siálico têm as seguintes massas moleculares: DMB-Neu5Ac = 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436.2 g/mol, DMB-Neu5But = 453,2 g/PM comum adutos são acetonitrilo, sódio ou álcool isopropílico.

10. Western Blot análise de ácido Polysialic em células de Neuroblastoma de Kelly

  1. Preparação de lisados celulares
    1. Adicione 1 mL de tampão de Lise borrão ocidental para as pelotas de célula da etapa 3.3 e vórtice. Incube durante 30 min no gelo. Vórtice cada 5 min. Centrifugar as amostras por 1,5 h em 20.000 x g e 4 ° C. Recolha o sobrenadante contendo as proteínas das células lisadas.
    2. Determine a concentração de proteína das frações de proteína, por exemplo, o Bradford ou o ensaio BCA. Dilua as amostras a uma concentração de proteína de 1,5 µ g / µ l de tampão de Lise.
    3. Preparar as amostras para o SDS-PAGE, adicionando 10 amortecedor da amostra Laemmli µ l a fração de proteína 90 µ l (1,5 µ g / µ l) e ferver a amostra por 5 min24.
  2. Immunoblotting
    1. Use gel de SDS-acrilamida 8% com 20-30 µ l bolsos e 0,75 ou 1 mm de espessura. Funcione o gel a 25 mA por 2 h no RT
    2. Remova cuidadosamente a tampa de vidro do gel. Cortar e descartar a parte superior do gel contendo os bolsos de carregamento. Coloque o gel em uma membrana de nitrocelulose (0,2 µm), previamente embebido em buffer de Western blot. Transferência das proteínas de nitrocelulose, de acordo com a recomendação do sistema (por exemplo, 250 mA para 1 h a 4 ° C).
    3. Remova a membrana de nitrocelulose do sistema mancha. O blot com Ponceau mancha vermelha para visualizar as proteínas. Transferir a membrana de nitrocelulose em uma câmara de plástico e adicionar 10 mL de solução de bloqueio. Incubar durante 1 h no RT ou overnight a 4 ° C.
    4. Decantar a solução de bloqueio e adicionar o anticorpo monoclonal anti-polySia 735 (1 µ g/mL) em PBS. Incubar a membrana por 1h no RT ou overnight a 4 ° C. Após a incubação, lave a membrana pelo menos três vezes por 5 min com PBS.
    5. Adicione policlonal anti-mouse IgG anticorpo secundário (1 µ g/mL) acoplado a peroxidase de rábano (HRP) ou uma etiqueta fluorescente em PBS. Incubar a membrana por 1h no RT Após a incubação, lave a membrana pelo menos três vezes por 5 min com PBS.
    6. Transferi a membrana em uma placa de um adequado sistema de imagem. Detecta o sinal de acordo com as instruções do fabricante.

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Representative Results

Cromatogramas HPLC do fluorescente etiquetado Neu5Ac e os padrões de Neu5Gc estão representadas na Figura 2. Usando o método descrito neste documento, Neu5Gc DMB-rotulado elutes tipicamente entre 7-9 min tempo de eluição e DMB-Neu5Ac entre 10 a 12 min. Vários pequenos picos no cromatograma costumam aparecem entre 2-6 min. Estes picos representam não tenha reagido DMB e reação intermediários25.

A Figura 3 mostra representativas cromatogramas de lisados celulares. Em comparação com os cromatogramas das normas DMB-rotulado (Figura 2), nestes cromatogramas vários picos indefinidos são visíveis. Isto é provavelmente devido a impureza interna de lisados celulares e ao fato de que o DMB não só reage com ácido siálico espécies, mas também com outros α-ceto ácidos presentes no lisados celulares, incluindo o piruvato, succinato e α-cetoglutarato26. A presença de pequenas quantidades de ácidos siálicos tendo O-modificações de acetil que não tem sido clivadas pela hidrólise do ácido acético também podem ser discutidas como uma razão para estes picos indefinido23. Cromatogramas de células não tratadas lisadas são comparadas com cromatogramas de células que tenham sido previamente tratadas com ManNAc ou seus análogos. Como mostrado aqui, tratamento com ManNAc muitas vezes leva a um esgotamento quase todo, de Neu5Gc na superfície das células. Em cromatogramas de lisados células tratadas com Neu5Prop ou Neu5But, os picos são visíveis que não aparecem nos cromatogramas das células não tratadas. Estes picos (para ManNProp tratados células aproximadamente 19 min tempo de eluição e para ManNBut tratados células em 42 min) indicam o aparecimento dos correspondentes não-naturais ácidos siálicos, Neu5Prop e Neu5Gc. Conforme descrito na seção 8.3 do protocolo, os cromatogramas HPLC podem ser analisados de forma a quantificar as quantidades das espécies diferentes de ácido siálico nos lisados celulares.

O fato de que distintos HPLC de retenção picos correspondem a determinadas espécies de ácido siálico, verificou-se através de espectrometria de massa. Dados do representante ESI-MS desde picos HPLC coletados de interesse são representados na Figura 4: o espectro do pico de retenção do DMB-Neu5Ac coletado no painel esquerdo superior, DMB-Neu5Gc no painel superior direito e as duas espécies de ácido siálico de não-naturais, DMB-Neu5Prop e DMB-Neu5But nos painéis esquerdos e direito mais baixo. A reação com DMB leva a um aumento na massa molecular de 116,2 Da, em comparação com as espécies de ácido siálico que não são rotuladas com este corante. Em espectros de massa, ao exibir a relação massa/carga positiva das amostras injetadas entre 300 e 700, vários picos são visíveis. Isto é devido à aduto formação da sonda DMB-rotulado respeitada. Além do protonado íon [M + H]+, o sódio adutos [M + nd]+ e [M + 2Na-H]+ aparecem. Como acetonitrila (ACN) está presente durante a análise de LC, pode ser encontrado como um aduto em espectros de massa (mostrado para DMB-Neu5Gc, Figura 4: painel superior direito). Devido à fragmentação causada por ativações de descompensação colisão geradas na região electronspray de transporte entre o capilar e o primeiro do skimmer, desidratado ácido siálico também pode ser observada espécie [M + H]+-H2O (mostrado para DMB-Neu5Ac, Figura 4: painel esquerdo superior)23,,27. Na configuração da LC, DMB-Neu5Gc elutes logo após as DMB-espécies não tenha reagidas ou parcialmente reagiram. Portanto, a sonda de DMB-Neu5Gc coletada pode conter impurezas causadas por estes intermediários de reação. Isto serve como explicação para o aparecimento de indefinido picos no espectro de massa DMB-Neu5Gc (Figura 4: painel superior direito).

Tratamento de células de neuroblastoma Kelly com ManNProp ou ManNBut leva a expressão reduzida de ácido polysialic na NCAM, como demonstrado pela análise ocidental do borrão da membrana celular de células lisadas (Figura 5). Polysialic ácido normalmente aparece como uma mancha de heterogeneidade no tamanho e na carga de (≈ 200 kDa). Tratamento com análogos de ManNAc leva à redução do ácido polysialic na superfície de células: quanto mais tempo o alifáticos N-acil lado corrente, quanto mais forte a redução28.

Figure 1
Figura 1: O princípio geral da MGE com N-acil modificado mannosamines. Após o tratamento com a N-acil modificado mannosamines, estes análogos ManNAc são unidirecionalmente metabolizado (metabolismo intracelular) aos correspondentes ácidos siálicos não-naturais. Estas são transportadas para o Golgi, transferidas para o aceitador de oligossacarídeo respectivos por sialyltransferases e expressos na superfície das células sialosides (aqui, uma glicoproteína). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: representante cromatogramas das normas DMB-rotulado o ácido siálico. DMB-rotulado Neu5Ac (painel superior) e Neu5Gc (painel inferior) foram analisados por HPLC. Retenção vezes (linhas tracejadas) e áreas de pico de ambos os ácidos siálicos foram determinadas após injetar 10 ng da espécie DMB-rotulado respeitada no sistema de HPLC. Nos cromatogramas representante aqui mostrados, DMB-Neu5Gc eluídos após aproximadamente um tempo de retenção de 8 min e DMB-Neu5Ac em 11 min, respectivamente. Vários pequenos picos no cromatograma costumam aparecem entre 2-6 min, representando não tenha reagidos intermediários DMB e reação. Uma pequena fração do DMB-rotulado Neu5Ac aparece como uma impureza menor no padrão DMB-Neu5Gc (painel inferior). Esta figura é modificada da referência22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: caracterização dos ácidos siálicos de membrana-limite por HPLC-DMB. As células foram cultivadas na ausência (painel superior, não tratado) ou presença com 5 mM de ManNAc (segundo painel de cima), ManNProp (terceiro painel de cima), ou ManNBut (painel inferior), respectivamente, por 7 dias. O meio foi mudado a cada 24 h. células foram colhidas e membrana frações foram preparadas, rotuladas com DMB e analisadas por HPLC. Em comparação com os cromatogramas de DMB-rotulado o ácido siálico padrões (Figura 2), picos para os tempos de retenção entre 8-9 min foram identificados como DMB-Neu5Gc e picos entre 10-11 min como DMB-Neu5Ac. Em comparação com os picos obtidos de injetar padrões DMB-rotulado o ácido siálico, cromatogramas de lisados celulares mostram picos adicionais, indefinidos. Isto é devido a impureza interna das sondas, bem como o fato de que DMB pode reagir com ácido siálico presente nos lisados celulares, mas também com outros α-ceto ácidos presentes no lisados celulares, incluindo piruvato, succinato e α-cetoglutarato. Picos que aparecem somente nos cromatogramas das amostras de células cultivadas na presença de N-acil modificado análogos mannosamine indicam os correspondentes DMB-rotulado não naturais ácidos siálicos. Esta figura é modificada da referência22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: massa espectros de DMB-rotulado o ácido siálico espécies encontradas no lisados celulares. Picos de retenção HPLC de interesse (ver Figura 3) foram recolhidos e posteriormente analisados por ESI-MS. 20 µ l de retenções recolhidas picos foi injetado no sistema de LC-MSD. Reação com DMB leva a um aumento na massa molecular de 116,2 Da comparado a espécie não tenha reagido ácido siálico correspondente. As espectrogramas de relação massa/carga positiva obtidas de espécies diferentes de ácido siálico são retratadas (DMB-Neu5Ac: painel esquerdo superior, DMB-Neu5Gc: painel superior direito, DMB-Neu5Prop: painel inferior esquerdo, DMB-Neu5But: painel canto inferior direito). Devido à formação de aduto vários picos são visíveis. Além do protonado íon [M + H]+, sódio adutos [M + nd]+ e [M + 2Na-H]+ aparecem. Acetonitrila, que está presente durante a análise de LC, também pode ser encontrada como um aduto (painel superior direito). DMB-Neu5Ac desidratada, que é gerado pela fragmentação no [M + H]+-H2O instrumento pode ser observada (painel esquerdo superior). A sonda de DMB-Neu5Gc coletada pode conter impurezas causadas por DMB não tenha reagido, bem como a reação intermediários vistos como picos indefinidos adicionais (painel superior direito). ACN, acetonitrilo; H, hidrogênio; At, sódio. Esta figura é modificada da referência22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: análise do polysialylation de NCAM. As células de neuroblastoma de Kelly foram cultivadas na ausência ou presença de 5 mM, ManNAc, ManNProp ou ManNBut por 7 dias. As células foram colhidas e proteínas foram separadas em gel de SDS-acrilamida 8% e analisadas por Western blot utilizando anticorpo monoclonal anti-polySia 735. Observe que polySia aparece como uma mancha devido à sua heterogeneidade em número de Sia, resultando em diferentes tamanhos e taxas de polySia.

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Discussion

Se os derivados quimicamente sintetizados do ManNAc, ManNProp e ManNBut são analisados através de espectrometria de massa, apenas o pico de massa correto para ambas as amostras deve ser identificado. Portanto, os produtos podem ser considerados para ter um grau de pureza superior a 99%. Pequenas quantidades de Neu5Gc, que normalmente não é encontrada em células humanas29, são detectadas nas fracções da membrana das células lisadas. Isto provavelmente ocorre através de uma via de salvamento que recrutas Neu5Gc de soro fetal bovino sialoglycoconjugates no mídia30. O tratamento com o precursor natural da biossíntese de ácido siálico, ManNAc, reduz drasticamente a expressão do epítopo de Neu5Gc na superfície das células.

Aplicação de modificado mannosamines é insignificante tóxica para todas as células investigadas até agora. Células aceitam aumento açúcar milimolar concentrações dentro do meio, o que é necessário, uma vez que não há nenhum transportadores específicos para N- acylmannosamines. Foi demonstrado que as vias de transdução de sinal são ativadas a pedido de N- acylmannosamines, que podem afetar sua célula crescimento ou diferenciação31,32. Se isto é devido a um padrão de sialylation alterado ou reflete efeitos directos sobre o sialylation modificado não é conhecido até agora. Crescimento de células na presença de análogos a C2-modificado ManNAc, ManNProp ou ManNBut resulta na expressão de espécies não-natural o ácido siálico carregando o correspondente N-substituição de acila. A eficiência metabólica dos dois testados N-acil modificado mannosamines varia. Tratamento com ManNProp geralmente leva à expressão da Neu5Prop correspondente na superfície das células e a uma diminuição da expressão de Neu5Ac, bem como de Neu5Gc. Outros N-acil modificado mannosamine análogos, como N- cyclopropylcarbamyl mannosamine, tendem a ter um ainda maior eficiência metabólica22.

Estudos anteriores revelaram que precursores siálico interferem com polysialylation. Ácidos Polysialic exprimem-se quase exclusivamente sobre o NCAM. Curiosamente, NCAM pode ser polysialylated por duas polysialyltransferases distintas, expressado no Golgi (ST8SiaII e ST8SiaIV). Descobriu-se que ManNProp, ManNBut e outros N-acil-mannosamines modificados interferir com polysialylation e que se trata, predominantemente, devido à interação com ST8SiaII14. Este sialyltransferase é expresso durante o desenvolvimento e é importante para o desenvolvimento do cérebro. Curiosamente também, muitos tumores de origem neuronal re-express ST8SiaII aumentando sua malignidade e ainda mais, tornando-os indetectável do sistema imunológico,33. Em contraste, a aplicação de ManNAc leva a um aumento de polySia, uma vez que conduz a um aumento da CMP-Neu5Ac, que é o substrato natural de ambos os polysialyltransferases.

MGE é um método exclusivo para introduzir novos ácidos siálicos em proteínas de interesse (por exemplo, a eritropoietina) e para modular, assim, sua função. Além disso, pode ser usada para modular a glicosilação de superfície celular, que pode ser um interesse de muitas doenças, como câncer, uma vez que muitas células cancerosas tentarem escapar do sistema imunológico expressando altos níveis de ácido siálico. Permite que o método apresentado aqui: primeiro, para executar glycoengineering utilizando culturas de células e segundo, para analisar engenharia os glicanos para provar glycoengineering bem sucedido. O método é muito robusto e até agora, sem armadilhas são relatadas; em contraste, o método foi expandido para introduzir grupos químicos de ativos para executar o clique-química em células13.

Aqui apresentamos dois análogos ManNAc alifáticos N-acil lado cadeia as modificações que são comparativamente simples para sintetizar, até mesmo por laboratórios com equipamentos de menos e menos experiência na síntese química. Grupos que são mais familiares para química orgânica poderiam sintetizar outros análogos de ManNAc com estruturas mais complexas e usá-las para MGE, incluindo os chamados 'opaco' análogos, que podem ser utilizados, por exemplo, para visualizar o sialylated glicoconjugados. Existem artigos de revisão, dando uma visão geral do N-acetil-derivados de mannosamine que foram sintetizados até à data de13,34. N- azidoacetyl mannosamine (ManNAz), uma substância que é usada frequentemente, Visualizar os glicanos sialylated, está disponível comercialmente. Devido a permeabilidade de membrana de baixa de análogos de ManNAc, pode ser vantajoso usar derivados destes açúcares com grupos hidroxila protegidos, por exemplo, peracetylated ManNAc análogos. Depois de entrar no citoplasma, os grupos de proteção são clivados por esterases citoplasmáticas, liberando assim os monossacarídeos ativo35,36,37. No entanto, peracetylated ManNAc análogos exponham citotoxicidade maior em comparação com os derivados desprotegidos correspondente.

Neste manuscrito, escolhemos as células de neuroblastoma imortalizado para nossos experimentos com MGE. Geralmente, a MGE (especialmente com ManNProp e ManNBut) pode ser aplicado em uma ampla variedade de linhas de células, incluindo as linhas de célula imortalizado (ver Wratil et al 13 . para obter exemplos) e as células primárias38,39. Além disso, MGE com êxito foi utilizada para alterar o sialylation em vivo em c. elegans40zebrafish17,41, rato19,20,42e rato 43 , 44. o tempo de tratamento e a concentração dos análogos ManNAc em experiências MGE podem ser variados para afetar a eficiência metabólica deste método. De nossa experiência, mais tempo de tratamento e concentrações mais elevadas correspondem com melhor substituição das espécies ocorrem naturalmente ácido siálico glicoconjugados por Neu5R modificados. Se muito altas concentrações de derivados de ManNAc a ser usado, deve ser avaliada a citotoxicidade do tratamento, por exemplo, o ensaio de MTT ou o resazurina ensaio de redução.

Neste manuscrito, nós sugerimos o uso de ultra-sonication para homogeneização de célula. Outros métodos de lise celular foram testados em nosso laboratório, incluindo douncing no gelo (aproximadamente 250 strokes) e francês imprensa interrupção (10.000 psi, 4 passagens), com resultados comparáveis em relação a quantidade de ácido siálico detectado nas amostras. A vantagem de homogeneização de ultra som é que precisa de tempo e não requer a adição de DNAase para as amostras antes da lise.

Enfocamos nossa análise as frações de membrana de lisados celulares, porque queríamos mostrar alterações no sialylation da membrana vinculado glicoconjugados. Derivados do ácido siálico e as respectivas concentrações também podem ser medidas no citosol das células, após a fração de membrana foi separada por centrifugação de alta velocidade, usando o mesmo método, conforme descrito acima. No entanto, as concentrações de ácido siálico no citosol são até 100 x mais baixo comparado ao ácido siálico expressão na membrana celular7. Assim, grandes quantidades de células são necessários para gerar resultados confiáveis. A piscina de ácido siálico-CMP citosólica, ativado pode ser medida indiretamente pelo pré-tratamento citosólica frações de lisados celulares com borohidreto de sódio antes da hidrólise7,45. Para hidrolisar ácido siálico em glicoconjugados e ácido siálico com modificações de hidroxila, as células foram incubadas com 1 M TFA. Outras soluções ácidas podem ser usadas para a hidrólise, bem como, por exemplo, 2 M de ácido propiônico, ácido acético de 2 M ou 1 M de HCl.

Um possível problema encontrado durante a análise HPLC é que picos de interesse se sobrepõem com picos indefinidos. Isto é especialmente problemático quando a quantidade de ácido siálico em uma amostra é calculada pela área sob a curva de um determinado pico. Para separar um pico de interesse de um pico de indefinido, a concentração de acetonitrilo no solvente HPLC pode ser ajustada (± 3%). Nós sugerimos o uso constantes concentrações de solventes para análise HPLC, dando a vantagem de preparar a mistura solvente antes de cromatografia. Portanto, nosso método requer apenas uma bomba HPLC e é viável para uma ampla gama de diferentes sistemas HPLC. Se mais do que uma bomba está disponível no sistema de HPLC, pode ser aplicado um gradiente de isocrática com concentrações crescentes de acetonitrilo, por exemplo, 4-9% em 35 min45. Usando esta técnica, o tempo de retenção de certos picos HPLC vai ser alterado consideravelmente. Esta estratégia também pode ajudar a alcançar a melhor separação de sobreposição de picos. Ionização de dessorção do laser assistida por matriz de espectrometria de massa (MALDI-MS) foi estabelecida com êxito verificar a expressão de modificado espécies de ácido siálico na superfície de células45e, portanto, serve como um equivalente para o método de ESI-MS aqui apresentado .

Devido a Hidrofilia dos análogos de ManNAc e a falta de transportadores específicos para a absorção destes derivados46, altas concentrações são necessários no MGE experiências com estes compostos. Portanto, em experimentos de escala acima e, especialmente em ensaios na vivo , grandes quantidades dos respectivos análogos de ManNAc são necessárias, mostrando uma possível limitação desta técnica. Por outro lado, dependendo da linha de celular usada, um certo número mínimo de células tratadas é necessário para obter resultados fiáveis em análise HPLC. De nossa experiência, um mínimo de cerca de 100.000 células aderentes ou 150.000 suspensão células (1-2 poços de uma placa de 96 poços com confluentes) é suficiente. Isso pode se tornar um gargalo, se a análise for dispensado, por exemplo, em abordagens de triagem.

Com os métodos apresentados neste manuscrito, ácido siálico e seus derivados podem ser detectados em lisados celulares. No entanto, a estrutura e composição de glicoconjugados em células tratadas com derivados de ManNAc não podem ser avaliados com a técnica descrita neste documento. Resolução da estrutura de glicoconjugados, e.g.,N- e O- os glicanos, geralmente requer maior experiência e uma facilidade de glycomics47. A nosso conhecimento, até agora, não estão disponíveis dados sobre a estrutura distinta de glicoconjugados de células que tenham sido tratados com análogos de ManNAc.

Análise ocidental do borrão de ácido polysialic é um método muito rápido e fácil. No entanto, dados obtidos por esse método não são quantitativos, desde a detecção utiliza anticorpos e quimioluminescência. Portanto, o uso de métodos HPLC é uma vantagem sobre a mancha ocidental. No entanto, sugerimos que usando o método de immunoblotting, uma vez que é conhecido por trabalhar muito confiável e fácil de aplicar.

A expressão de ácido siálico na superfície da pilha pode ser alterada também por métodos diferentes MGE. Conforme descrito acima, as células podem ser tratadas com sialidase, uma enzima que cliva resíduos de ácido siálico de glicoconjugados de forma relativamente inespecíficas. Tratamento Sialidase consequentemente induz hyposialylation em células tratadas. Infelizmente, sialidase tratamento é uma técnica bastante limitada, pois é citotóxico, não é viável para o tratamento de longo tempo e não aplicável em experimentos na vivo . Outra técnica para induzir hyposialylation nas células é usando inibidores da biossíntese de ácido siálico. Uma variedade de inibidores está disponível que seja alvo a enzima chave da biossíntese de ácido siálico, a UDP -N- acetilglicosamina-2-DSEL /N- acetylmannosamine-quinase (GNE/MNK), ou o grupo de sialyltransferases6, 7,8,48. Um destes compostos, um ácido siálico de C3-fluorado analógico, foi mostrado para reduzir a expressão de ácido siálico na vida de ratos49. Os animais tratados com esta substância, no entanto, mostrou deficiência hepática, disfunção renal irreversível e falha prosperar49. Estes resultados confirmam o papel crucial de Neu5Ac em função de fígado e rim e ainda mais, indicar os limites de inibidores de sialylation para experimentos na vivo . Um terceiro método para gerar células com sialylation de superfície de célula alterada está interferindo com a expressão de enzimas que são cruciais para a biossíntese de ácido siálico. Um knock-down do GNE/MNK em células imortalizadas, por exemplo, foi mostrado para processar essas células hyposialylated 9. A possibilidade de facilmente bater-no e - genes no celular e na vivo usando a novela e bem reconhecido CRISPR-Cas9 técnica podem levar a novas descobertas sobre a biossíntese de ácido siálico e célula de superfície sialylation.

A vantagem da MGE em comparação com as técnicas descritas aqui, é que é fácil de aplicar e adaptável a uma miríade de diferentes experiências, de ensaios em vitro para celular baseado em ensaios e experimentos em vivo . Um método alternativo para a expressão e concentrações de espécies diferentes de ácido siálico em amostras de células de medição é por cromatografia permutadora de alto desempenho (HPAEC) com deteção de eletroquímica pulsado50. Usando que esse método, a expressão de ácido siálico é medido diretamente e não depois de rotulagem com um corante fluorescente. A vantagem deste método é que pode ser utilizada também para analisar monossacarídeos diferentes ácido siálico e seus derivados em amostras de células e proteínas. Infelizmente, a sensibilidade do HPAEC é mais baixo comparada ao fluorométrica detecção do ácido siálico-DMB. Assim, HPAEC é limitado a experimentos com a disponibilidade de amostra grande quantidades51.

Os métodos descritos neste documento podem ser usados para revelar características desconhecidas de glicoconjugados. Uma infinidade de exemplos para o uso do MGE para investigar interações dependente de ácido siálico já existe13, mostrando a viabilidade dessa técnica no contexto de uma ampla gama de configurações experimentais.

Hoje em dia, MGE com N- acetylmannosamines é usado principalmente por pesquisadores no campo da glycobiology. Esperamos que esta técnica será reconhecida por um público mais amplo como uma ferramenta versátil para modificar glicoconjugados. Outros campos, incluindo Imunologia, virologia, Neurologia ou Oncologia beneficiará adaptando-se esta técnica para seus próprios fins. A investigação cruzado pode habilitar a descoberta de áreas ainda inexploradas e, portanto, dar uma melhor compreensão da saúde e da doença. Em estudos iniciais, por exemplo, esta técnica foi usada para produzir glicoproteínas com glicosilação modificada, que mais tarde servem para vacinação na vivo . Em certos casos, o tratamento com essas vacinas glycoengineered levar a produção de anticorpos que expostos a avidez avançada e toxicidade para os respectivos destinos52,53. Outros utilizados com êxito MGE para desenvolver um modelo para a terapia de alvo do tumor em ratos54. Outro estudo mostrou que injeção sistêmica na vivo da ManNProp promovida de regeneração do nervo55. No caso de polySia, foi demonstrado que diminuindo a expressão deste epítopo em células de neuroblastoma pelos métodos apresentados neste manuscrito, aumenta a sensibilidade dessas células de tumor à radiação ou tratamento com drogas anticâncer56.

As quantidades de ácido siálico, medido dentro de amostras podem ser diferentes dependendo do método usado para separar as células expostas. Neste manuscrito, incubação com tripsina foi usada para destacar células. Se outras técnicas devem ser utilizadas, tais como raspar as células ou tratamento de longa data com PBS + EDTA, as quantidades de ácido siálico medido nas amostras podem ser diferentes. Mesmo adaptar o tempo de incubação com tripsina pode ter um impacto sobre as concentrações de ácido siálico medidas mais tarde. De nossa experiência, o impacto do método desprendimento celular nas quantidades de ácido siálico medido é abaixo de 15%, mas se os resultados estão a ser normalizado e comparado, isso pode se tornar um gargalo importante. Além disso, o método de Lise das células pode afetar o resultado da análise de HPLC. Assim, recomendamos que o leitor para padronizar o desprendimento de célula e lise em seus experimentos.

Para conseguir a separação da fração de membrana em lisados celulares, usamos a centrifugação por 2 h a 20.000 x g e 4 ° C (seção 5.1). Outros protocolos de centrifugação podem afetar a separação e, portanto, as quantidades de ácido siálico detectado nas amostras. Um composto crítico neste protocolo é DMB, porque é muito sensível à luz e degrada ao longo do tempo. Aqui é recomendável para partes pequenas alíquotas da solução-DMB loja como estoques em - 20 ° C, protegido da luz (secção 1.6.1). Desta forma a DMB-solução pode ser armazenada por várias semanas. Se os resultados da análise de DMB-HPLC mostram sinais de ácido siálico espécies de diminuindo ou aumentando os sinais dentro o primeiro 6 min da medição HPLC, representando DMB e seus produtos de reação, novo DMB-solução deve ser preparada. Não congele novamente e re-utilização DMB-solução após a descongelação-lo. Depois de DMB rotulagem, todas as amostras devem ser analisadas imediatamente. Se um número maior de amostras (> 10) devem ser analisados, estas amostras devem ser divididas em pequenos emblemas e gradualmente rotuladas com DMB. Tanto a reação de rotulagem, bem como as sondas DMB-rotulado devem ser protegidas da luz em todos os tempos. Após a eluição, a espécie de DMB-rotulado o ácido siálico deve ser analisada imediatamente por ESI-MS. direto atrelar a HPLC com o sistema de ESI-MS (em uma instalação de LC-ESI-MS) não é necessário, mas pode ser vantajoso para alcançar maior qualidade a espectrometria de massa análise.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos L. D. Nguyen pela revisão do manuscrito e frutíferos debates. Além disso, agradecemos J. Dernedde e H. G. Nguyen nos ajudar a preparar a gravação do vídeo. A maioria das cenas do vídeo foram filmadas nos laboratórios da R. Tauber. Agradecemos também o Instituto Max Planck de coloides e interfaces e por nos dar livre acesso a suas instalações de espectrometria de massa. RH foi apoiado pelo DFG (ProMoAge).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Agilent
ESI-MSD-System Agilent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioengenharia edição 129 ácido siálico ácido polysialic cromatografia líquida de alta performance cultura celular glycoengineering metabólica engenharia metabólica oligossacarídeo
Glycoengineering metabólica do ácido siálico usando <em>N</em>-acil-modificado Mannosamines
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Wratil, P. R., Horstkorte, R.… More

Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).

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