Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Metaboliska Glycoengineering av Sialic Acid använder N-acyl-modified Mannosamines

Published: November 25, 2017 doi: 10.3791/55746
Automatic Translation
1,2, 3
1Max von Pettenkofer-Institut & Genzentrum, Virologie, Nationales Referenzzentrum für Retroviren, Medizinische Fakultät, LMU München, 2Institut für Laboratoriumsmedizin, klinische Chemie und Pathobiochemie, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Institut für Physiologische Chemie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Summary

Sialic acid är en typisk monosackarid-enhet finns i Glykokonjugat. Det är involverade i en uppsjö av molekylära och cellulära interaktioner. Här presenterar vi en metod för att ändra cellen ytbehandlar sialic acid uttryck med metabola glycoengineering med N- acetylmannosamine derivat.

Abstract

Sialic acid (Sia) är en mycket viktig beståndsdel av Glykokonjugat, till exempel N- och O- glycans eller glykolipider. På grund av dess ställning på icke-reducerande termini oligo - och polysackarider, samt dess unika kemiska egenskaper, är sialic acid involverad i en mängd olika receptor-ligand interaktioner. Genom att ändra uttrycket av sialic acid på cellytan, påverkas följaktligen sialic acid-beroende interaktioner. Detta kan vara bra att undersöka sialic acid-beroende interaktioner och har potential att påverka vissa sjukdomar på ett fördelaktigt sätt. Via metabola glycoengineering (MGE), kan uttryck av sialic acid på cellytan anpassas. Häri, behandlas celler, vävnader eller ens hela djur med C2-modifierade derivat av N- acetylmannosamine (ManNAc). Dessa amino socker är fungerar som sialic acid föregångare molekyler och därför metaboliseras till motsvarande arter av sialic acid och uttryckt på Glykokonjugat. Tillämpa denna metod ger spännande effekter på olika biologiska processer. Till exempel det kan drastiskt minska uttryck för polysialic syra (polySia) i behandlade neuronala celler och påverkar därmed neuronal tillväxt och differentiering. Här visar vi den kemiska syntesen av två av de vanligaste C2-modifierade N- acylmannosamine derivat, N- propionylmannosamine (ManNProp) samt N- butanoylmannosamine (ManNBut), och ytterligare Visa hur dessa icke-naturlig Amino socker kan tillämpas i cell kultur experiment. Uttrycket av modifierade sialic acid arter är kvantifieras av högtrycksvätskekromatografi (HPLC) och ytterligare analyseras via masspektrometri. Effekterna på polysialic syra uttryck belyses via Western blot använder en kommersiellt tillgänglig polysialic syra antikropp.

Introduction

Sialic acid är en monosackarid som kan vanligtvis hittas på icke-reducerande termini av Glykokonjugat, till exempel N- och O- glycans eller glykolipider. Bland alla monosackarider har sialic acid vissa unika kemiska egenskaper. Den har en ryggrad för 9 C-atom, en karboxylsyror grupp i c-1 position, som är deprotonated och därmed negativt laddade under fysiologiska betingelser och en amino funktion i c-5 position. Även om över 50 naturligt förekommande varianter av sialic acid har präglats till datum1, är dominerande form av sialic acid hittade hos människa N- acetylneuraminic syra (Neu5Ac). Andra däggdjur också uttrycka högre mängder av N- glycolylneuraminic acid (Neu5Gc)2,3.

På grund av sin utsatta position i Glykokonjugat, är sialic acid involverad i en uppsjö av receptor-ligand interaktioner, exempelvis hemagglutinin beroende bindningen av influensavirus att host celler4. Ett sialic acid epitop med viktiga biologiska funktioner, särskilt under embryogenes och i nervsystemet, är polysialic syra. Polysialic syra är en polymer av upp till 200 alfa 2,8-länkade sialic syror. Den stora protein bäraren av polysialic syra är neurala cell adhesion molekyl (NCAM). Polysialic acid uttryck modulerar NCAM självhäftande egendom däri polysialic syra uttryck minskar vidhäftning och ökar plasticitet med nervsystemet5.

Förändringar i uttrycket av (poly) sialic acid kommer i slutändan att påverka en mängd olika biologiska interaktioner. Detta kan användas för att studera kända sialic acid beroende processer på molekylär nivå, att avslöja roman glycoconjugate interaktioner, eller utforska möjliga behandlingsmetoder. Det finns olika metoder tillgängliga som ett uttryck för sialic acid på cellytan kan anpassas, till exempel behandling med sialic acid särskilda glycosidases (sialidases), hämning av enzymer som är involverade i sialic acid biosyntesen6 ,7,8, eller knacka ner eller ändra uttrycket av det nyckel-enzymet av sialic acid biosyntes9.

En annan mångsidig metod att modulera sialic acid uttryck är MGE (kallas även metabola oligosackarid engineering, MOE). Häri, behandlas celler, vävnader eller även djur med icke-naturlig derivat av ManNAc som bär C2-amino ändringar. Att vara föregångare molekyler för sialic acid, efter cellernas upptag, dessa ManNAc analoger är enkelriktad metaboliseras till icke naturliga sialic syror och kan uttryckas på sialylated Glykokonjugat. Celler behandlas med ManNAc derivat transporterar alifatiska C2-ändringar, såsom ManNProp eller ManNBut, införliva N- propionylneuraminic syra (Neu5Prop) eller N- butanoylneuraminic syra (Neu5But) i deras Glykokonjugat10 , 11. genom att använda funktionella grupper introducerade till C2-ställning ManNAc, förekommande icke naturliga sialic syror kan kopplas, exempelvis via den Staudinger ligation eller den natriumazid alkine cykloadditionen, med fluorescerande färgämnen och därför visualiseras på cell surface12.

Uttrycket av dessa icke-naturlig sialic syror har spännande effekter på många biologiska processer, inklusive patogen infektioner, adhesion och migration av tumörceller, allmänna celladhesion, samt vaskularisering och differentiering (för granskning Se: Wratil et al. 13). intressant, MGE med N-acyl modified mannosamines kan också användas för att störa uttrycket av polysialic syra. Polysialic syra genereras av två olika polysialyltransferases (ST8SiaII och ST8SiaIV). Det har visats, att polysialyltransferase ST8SiaII hämmas av onaturliga sialic acid prekursorer, såsom ManNProp eller ManNBut14,15. Dessutom har det visats i mänskliga neuroblastomceller att ManNProp eller ManNBut ansökan också minskar sialylation i totalt15.

MGE med N-acyl modified mannosamines är lätt att tillämpa metod som har använts framgångsrikt, inte bara i däggdjurs- och bakterier cellkultur men också i hela djur av olika arter, såsom Caenorhabditis elegans16, Zebrafiskar17eller möss18,19,20,21. Särskilt ManNAc derivat med alifatiska ändringar, inklusive ManNProp och ManNBut, är negligibly cytotoxiska, även vid millimolar koncentrationer i cellodlingsmedium eller blodplasma. Vidare är de relativt lätt att syntetisera.

Här, vi ger detaljer om hur du använder MGE med N-acetyl modified mannosamines. Först, den kemiska syntesen av två av de mest använda ManNAc derivat i området, ManNProp och ManNBut, förklaras. Nästa, vi visar hur MGE kan tillämpas i ett in-vivo -experiment. Som ett exempel, den neuroblastom cellinje Kelly valdes att visa minskad uttryck för den polysialic epitop av Western blot efter behandling med ManNAc derivat. Icke-naturlig sialic syror på cellytan var kvantifieras genom HPLC och ytterligare analyseras via masspektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av buffertar och reagenser

  1. Beredning av 3 mM natrium methoxide lösning
    1. Lös upp 8,1 mg natrium methoxide i 50 mL metanol (3 mM) i en 100 mL glasflaska med uppståndelse bar. Förvara i rumstemperatur (RT) i flera veckor.
  2. Beredning av Tris-HCl buffert
    1. Kombinera 8.766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl och 146 mg EDTA i en 100 mL glasflaska med en uppståndelse bar och lös i 80 mL vatten.
    2. Lägg till natriumhydroxid (1 M, i vatten) eller HCl (20%, i vatten) till omrörning lösningen, medan du observerar pH med pH-mätare, och justera pH till 8.0.
    3. Lägga till volymen vatten som behövs för att uppnå en slutlig volym av 100 mL. Filtrera lösningen med en 0,22 µm sterila filtersystem.
      Obs: 100 mL Tris / HCl buffert innehåller 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl och 5 mM EDTA (pH 8,0). Lösningen kan förvaras vid 4 ° C i flera veckor.
  3. Beredning av aprotinin lösning
    1. Lös 10 mg aprotinin i 1 mL vatten (1.54 mM). Alikvot aprotinin lösningen till 10 x 1,5 mL-plast-rör (100 µL varje). Förvaras vid-20 ° C under flera veckor.
  4. Beredning av leupeptin lösning
    1. Lös 10 mg leupeptin i 2 mL vatten (10 mM). Alikvot leupeptin lösningen 10 x 1,5 mL-plast-rör. Förvaras vid-20 ° C under flera veckor.
  5. Beredning av phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF) lösning
    1. Lös 34,8 mg PMSF i 2 mL etanol (100 mM). Alikvot PMSF lösningen i 10 x 1,5 mL-plast-rör. Förvaras vid-20 ° C under flera veckor.
  6. Beredning av 1,2-diamino-4,5-methyldioxybenzol-dihydroklorid (DMB) lösning
    1. Kombinera 15.62 mg DMB, 352 µL β-merkaptoetanol och 48 µL natrium bisulfite-lösning (39%), och tillsätt 9,6 mL vatten (6.9 mM DMB, 500 mM β-merkaptoetanol och 0,19% natrium bisulfite). Alikvot DMB lösningen i 40 x 1,5 mL-plast-rör (250 µL varje). Förvaras skyddat från ljus vid-20 ° C under flera veckor.
  7. Beredning av 1 M trifluorättiksyra (TFA) syra lösning
    1. Tillsätt 770.3 µL av 100% TFA till 9.23 mL vatten i en 15 mL plaströr (1 M). Förvaras vid 4 ° C i flera veckor.
  8. Beredning av 120 mM TFA lösning
    1. Lägga till 92,4 µL TFA (100%) 9.91 mL vatten (120 mM) i ett 15 mL plaströr. Förvaras vid 4 ° C i flera veckor.
  9. Beredning av lösning av natriumhydroxid (NaOH) 400 mM
    1. Lös upp 160 mg NaOH i 10 mL vatten (400 mM) i ett 15 mL plaströr. Förvaras vid 4 ° C i flera veckor.
  10. Beredning av Western blot lyseringsbuffert
    1. Lös upp 5,84 g NaCl, 0,1 g Tris (hydroxymetyl)-aminomethan (Tris), 0,1 g CaCl2, 0,95 g MgCl2och 1 g Triton-X100 i 100 mL vatten och justera pH till 7,8. Förvaras vid 4 ° C. Tillsätt 100 µL av varje proteashämmare (aprotinin, leupeptin och PMSF) innan du använder lyseringsbuffert.
  11. Beredning av sodium dodecyl sulfate Polyakrylamidgelen elektrofores (SDS-PAGE) buffert
    1. Lös upp 0,3 g Tris, 1,5 g glycin och 0,1 g SDS i 100 mL vatten och justera pH till 7,3. Butiken på RT.
  12. Beredning av Western blot buffert
    1. Lös upp 0,3 g Tris, 1,1 g glycin i 90 mL vatten och tillsätt 10 mL etanol. Butiken på RT.
  13. Beredning av blockering lösning
    1. Lös 1 g fettfri mjölk makten i 25 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Alltid förbereda färska.

2. Sammanfattning av ManNProp och relaterade N-acyl-modified Mannosamines

  1. Lös 431,2 mg mannosamine hydrochloride i 10 mL 3 mM natrium methoxide lösning i en 50 mL glasflaska med en uppståndelse bar.
  2. Cool blandningen på is till 0 ° C. Till omrörning lösningen, Tillsätt långsamt droppvis 210 µL propionyl klorid (2,4 mmol) eller 248 µL butanoyl klorid (2,4 mmol) att syntetisera ManNProp eller ManNBut, respektive. Inkubera omrörning blandningen vid 0 ° C i 4 h.
  3. Över lösningen till en 50 mL plaströr. Små 4-8 hål i locket av plast röret med en tunn nål. Snabbt frysa lösningen med flytande kväve och därefter lyophilize (frysa torr) det för 48 h eller tills det har torkat helt.
  4. Blanda 350 g kiselgel 60 med 750 mL etyl-acetat/metanol/vatten (15:2:1) (detta är en suspension). Fyll en glaskolonn (35 mm i diameter och 70 cm längd) med kiselgel 60 fjädring och tvätta kolumnen beredda med en ytterligare 100 mL etyl-acetat/metanol/vatten (15:2:1) före användning.
  5. Lös upp de torkade produkterna från steg 2,3 (5 g torkade produkt) i 10 mL etyl-acetat/metanol/vatten (15:2:1) och ladda dem med pipett på kiseldioxid gel kolumn. Samla 4 mL fraktioner efter 500 mL (för ManNProp). Obs: ManNBut kommer att eluera från kolumnen ungefärligt efter 700 mL.
  6. Över de eluerade fraktionerna till 15 mL plaströr. Sticka 3-6 hål i locket av plast röret med en tunn nål. Rapid frysa lösningen med flytande kväve och därefter lyophilize det tills det har torkat helt.
    Obs: De frystorkade produkterna kan lagras i flera månader på RT.
  7. Kontrollera renheten av produkterna genom masspektrometri (se avsnitt 9).
    Obs: Alternativt renhet kan även verifieras av 1H kärnmagnetisk resonans (NMR).

3. cellkultur

  1. Kultur Kelly neuroblastomceller i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium innehållande 10% fetalt bovint serum, 100 U penicillin, streptomycin 100 mg, 2 mM L-glutamin innehållande 5 mM ManNAc, 5 mM ManNProp eller 5 mM ManNBut, vid 37 ° C och 5% CO2.
    Obs: Celler odlade i medium utan ManNAc eller dess analoger används som en kontroll.
  2. Före applicering av mannosamines, lossa Kelly neuroblastomceller genom inkubering i 10 min med trypsin/EDTA (0,25%, 0,02%, i PBS) och räkna med en Neubauer-kammare eller cell räknare. Utsäde cellerna på definierade siffror baserat på storleken på plattan/skålen.
    1. För att mäta sialic acid monosackarider, utsäde 1 x 105 celler i 500 µL medium till en 48-väl vävnadsodling platta. För analys av polysialic syror, utsäde 1 x 106 celler i 3 mL medium på en 6 cm diameter cell kultur maträtt. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2. Ersätta mediet varje 24 h.
      Obs: Effekten av MGE ökar med den totala tiden för behandling. För hög metabolisk effektivitet behandla cellerna för 5-7 dagar.
  3. Efter behandling, Dekantera medium. Diska tallrikar/med PBS. Lossa cellerna genom inkubering i 10 min med trypsin/EDTA (0,25%, 0,02%, i PBS). Neutralisera trypsin genom att lägga till samma volym av cellodlingsmedium fristående cellerna. Över de fristående cellerna till 15 mL plaströr. Centrifugera proverna för 3 min vid 500 x g och kasta bort supernatanten.
    1. Tillsätt 5 mL PBS och centrifugera celler (se steg 3.3). Upprepa förfarandet för tvätt två gånger.
      Obs: Tvättade cellpelleten utan supernatanten kan förvaras vid-20 ° C i flera dagar. Om uttrycket av polysialic syra är att belysas vidare till 10.

4. cell Lysis för HPLC analys

  1. Beredning av HPLC lyseringsbuffert
    1. Kombinera 5 mL Tris / HCl buffert, 5 µL aprotinin lösning, 20 µL leupeptin lösning och 50 µL PMSF lösning.
      Obs: 5 mL HPLC lyseringsbuffert kommer att innehålla 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 µM aprotinin, 40 µM Leupeptin, och 1 mM PMSF (pH 8,0). Denna buffert bör alltid vara beredda färska före cellys.
  2. Återsuspendering insamlade cell pellets (steg 3.3) varje i 500 µL iskall HPLC-lyseringsbuffert och ultra-Sonikera prover med en ultra sonic processor nål tre gånger under en period av 30 s vid medelhög amplituder. Cool proverna på is för minst 1 min mellan cyklerna.

5. separation i bråket som membran

  1. Centrifugera lyserat cell proverna för 2 h 20 000 x g och 4 ° C. Separat supernatanten (cirka 480 µL), som representerar cytosoliska proteiner, i 1,5 mL plaströr. Bestämma proteinkoncentration av dessa fraktioner som använder, t.ex., Bradford eller bicinchoninic syra (BCA) analysen.
    Obs: Protein koncentrationen (cirka 1 mg/mL) av de cytosoliska fraktionerna kan senare vara relaterat till de uppmätta mängderna av de respektera sialic acid arterna. Pelleten representerar membran fraktionen, som används i steg 6.1.

6. sur hydrolys

Obs: Oligo- och polysackarider i cellmembranen är hydrolyserat till monosackarider. Dessutom möjligt O-ändringar i monosackarider är hydrolyserat, liksom. Detta är nödvändigt för kvantitativa HPLC analys, eftersom den överväldigande majoriteten av sialic syror i membran fraktioner ingår naturligt i Glykokonjugat och kan eventuellt bära O-acetyl eller O- lactolyl ändringar.

  1. Tillsätt 150 µL 1 M TFA-lösning till separerade membran fraktioner (pellets från avsnitt 5). Inkubera proverna för 4 h vid 80 ° C med skakningar vid 200-600 rpm.
  2. Centrifugera proverna för ca 30 min vid 20 000 x g och 21 ° C med 0,5 mL filter tubes med 3 kDa utslagning membran, tills den övre fas volymen är mindre än 20 µL.
    Obs: Detta steg är viktigt att förfoga över högre molekylär skräp.
  3. Överföra den lägsta fasen som innehåller mindre molekyler, inbegripet de sialic acid arterna i 2 mL plaströr. Peta 2-4 hål i mössor av plaströren med en tunn nål. Rapid frysa proverna med hjälp av flytande kväve och sedan lyophilize dem över natten.
    Obs: De torkade proverna kan förvaras i flera dagar på RT. Ersätt en mössa utan hål för längre lagring.

7. fluorescerande märkning

  1. Återsuspendering de torkade proverna i 10 µL 120 mM TFA lösning och tillsätt 50 µL DMB lösning. Över prover till mörka 1,5 mL tuber till skydda dem från ultraviolett ljus.
  2. För standarder, lös 1 µL Neu5Ac (60 ng/mL, i vatten) eller 1 µL Neu5Gc (60 ng/mL, i vatten) i 10 µL 120 mM TFA lösning i mörka 1,5 mL rör. Tillsätt 50 µL DMB lösning.
  3. Inkubera cellmembranet proverna och standarderna för 1,5 h vid 56 ° C skyddas från ljus. Efter inkubation, tillsätt 4 µL 400 mM NaOH-lösning till varje prov att stoppa märkning reaktionen.

8. HPLC-analysen

Obs: Märkt prover analyseras på en HPLC system utrustade med en C18 RP kolumn (110 Å, 3 µm partikelstorlek, 4.6 x 150 mm), en fluorescensdetektor, och en bråkdel samlare. De lösningsmedel som används är metanol, acetonitril och vatten. Se till att lufta alla lösningsmedel innan mätningar, om HPLC systemet saknar en inre degasser.

  1. Temperaturen i kolumnen till 40 ° C och konfigurerar fluorescens detektorn med 373 nm för magnetisering och 448 nm för utsläpp, respektive. Injicera 10 µL provtagningsvolym och separat sonderna för 50 min på 0,5 mL/min flöde med metanol/acetonitril/vatten (6:8:86) som eluenten. För masspektrometri analys, samla in topparna av intresse.
    Obs: Neu5Gc förväntas eluatet efter 6-8 min, Neu5Ac efter 9-12 min, Neu5Prop efter 17-23 min och Neu5But efter 38-44 min. De fraktionerade proverna kan lagras i flera timmar vid 4 ° C skyddas från ljus.
  2. Efter mätning av varje prov, Tvätta kolonnen för 7,5 min på 1,0 mL/min flödet (≈ 1,5 kolumn volymer) med metanol och acetonitril/vatten (6:25:69) och åter jämvikta systemet för 7,5 min vid flödet 1,0 mL/min med metanol och acetonitril/vatten (6:8:86).
  3. Beräkna arean under kurvan för de sialic acid peaks sevärdheter med hjälp av operativa programvara av respektive HPLC-system22för kvantitativ analys.
    Obs: Uppgifterna kan relateras till Neu5Ac eller Neu5Gc standard och uppmätta protein koncentrationerna i cytosoliskt fraktioner (se avsnitt 5.1).

9. masspektrometri analys av Sialic Acid monosackarider

Obs: HPLC retention toppar av intresse kan ytterligare analyseras genom vätskekromatografi (LC) elektrospray-jonisering masspektrometri (ESI-MS), för att kontrollera de onaturliga sialic acid arterna.

  1. För masspektrometri analys, injicera 20 µL av insamlade prov i ett LC/massa selektiv detektor (MSD) system med 79,9% metanol och 20% isopropylalkohol 0,1% myrsyra som eluent, 0,5 mL/min flöde, 4 kV kapillär spänning och 350 ° C kapillär temperatur 22 , 23.
  2. Välj topp sevärdheter i totala ion kromatogrammet i programvaran utvärdering av respektive LC/MSD system. Visa massa spectrumen av löst toppen. Visa positiv massa/laddning förhållandet mellan 300 och 700.
    Obs: DMB märkning av sialic syror leder till en ökning av det molekylära samlas av 116,2 g/mol. DMB-märkt sialic acid arter har det följande molekylära samlas: DMB-Neu5Ac = 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436.2 g/mol, DMB-Neu5But = 453.2 g/mol. Common addukter är acetonitril, natrium eller isopropylalkohol.

10. Western Blot analys av Polysialic syra i Kelly neuroblastomceller

  1. Beredning av cell lysates
    1. Lägga till 1 mL Western blot lyseringsbuffert cell pellets från steg 3.3 och vortex. Inkubera i 30 min på is. Vortex var 5 minut. Centrifugera proverna för 1,5 h 20 000 x g och 4 ° C. Samla in supernatanten innehållande proteiner från lyserat cellerna.
    2. Att bestämma proteinkoncentration protein fraktioner, t.ex., Bradford eller BCA analysen. Späd ut proverna till en proteinkoncentration av 1,5 µg/µL i lyseringsbuffert.
    3. Bereda proverna för SDS-sidan genom att lägga till 10 µL Laemmli prov buffert 90 µL proteinfraktion (1,5 µg/µL) och koka 5 min24provet.
  2. Immunoblotting
    1. Använd 8% SDS-akrylamid geler med 20-30 µL fickor och 0,75 eller 1 mm tjocklek. Kör gelen vid 25 mA för 2 h på RT.
    2. Ta försiktigt bort locket glas från gelen. Klipp ut och kassera den övre delen av gel som innehåller lastning fickorna. Placera gelen på ett nitrocellulosa membran (0,2 µm), tidigare indränkt i Western blot buffert. Överföra proteinerna till nitrocellulosa enligt rekommendation av systemet (t.ex. 250 mA för 1 h vid 4 ° C).
    3. Ta bort nitrocellulosa membranet från blotting systemet. Fläcken blot med Ponceau röda att visualisera proteinerna. Överför nitrocellulosa membranet in i en plast kammare och tillsätt 10 mL blockerar lösning. Inkubera i 1 h på RT eller över natten vid 4 ° C.
    4. Dekantera den blockerande lösningen och tillsätt monoklonala anti-polySia 735 antikropp (1 µg/mL) i PBS. Inkubera membranet för 1 h på RT eller över natten vid 4 ° C. Efter inkubation, tvätta membranet minst tre gånger för 5 min med PBS.
    5. Lägg till polyklonala antimus IgG sekundär antikropp (1 µg/mL) kopplas till pepparrotsperoxidas (HRP) eller en fluorescerande etikett i PBS. Inkubera membranet för 1 h på RT. Efter inkubation, tvätta membranet minst tre gånger för 5 min med PBS.
    6. Överföra membranet på en tallrik av en lämplig imager. Detektera signalen enligt tillverkarens anvisningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HPLC kromatogram av den fluorescerande märkt Neu5Ac och Neu5Gc standarder avbildas i figur 2. Häri beskrivna metoden, eluerar DMB-märkt Neu5Gc vanligtvis mellan 7-9 min eluering tid och DMB-Neu5Ac mellan 10-12 min. Flera mindre toppar i kromatogrammet visas vanligtvis mellan 2-6 min. Dessa toppar representerar oreagerad DMB och reaktion intermediärer25.

Figur 3 visar representativa kromatogram av cell lysates. Jämfört med kromatogram av DMB-märkt standarder (figur 2), i dessa kromatogram flera odefinierade toppar är synliga. Detta är troligtvis på grund av inre föroreningar av cell lysates och det faktum att DMB inte bara reagerar med sialic acid arter, men också med andra α-keto syror som finns i cellen lysates, inklusive pyruvat, succinat och α-ketoglutarat26. Förekomsten av små mängder av sialic syror med O-acetyl-ändringar som inte har varit klyvs av ättiksyra hydrolys kan också diskuteras som en orsak till dessa odefinierade toppar23. Kromatogram från lyserat obehandlad celler jämförs med kromatogram från celler som tidigare har behandlats med ManNAc eller dess analoger. Såsom visas här, leder behandling med ManNAc ofta till en nästan hela utarmning av Neu5Gc på cellytan. I kromatogrammen lyserat celler behandlas med Neu5Prop eller Neu5But, topparna är synlig som inte visas i kromatogram av obehandlade celler. Dessa toppar (för ManNProp celler vid ungefär 19 min eluering och för ManNBut behandlade celler på 42 min) visar utseendet på de motsvarande icke-naturlig sialic syrorna, Neu5Prop och Neu5Gc. Som beskrivs i avsnitt 8.3 i protokollet, kan de HPLC kromatogram analyseras för att kvantifiera beloppen för de olika sialic acid arterna i den cellen lysates.

Det faktum att distinkt HPLC retention toppar motsvarar vissa sialic acid arter kontrollerades via masspektrometri. Representant ESI-MS data från insamlade HPLC toppar av intresse avbildas i figur 4: spectrumen av insamlade DMB-Neu5Ac lagring toppen i den övre vänstra panelen, DMB-Neu5Gc i den övre högra panelen och de två icke-naturlig sialic acid-arterna, DMB-Neu5Prop och DMB-Neu5But i nedre vänstra och högra panelerna. Reaktionen med DMB leder till en ökning av det molekylära samlas av 116,2 Da, jämfört med de sialic acid-arter som inte är märkta med denna färg. Masspektrum, när de visar förhållandet positiv massa/laddning av de injicerade proverna mellan 300 och 700, syns flera toppar. Detta beror på addukt bildandet av respekterade DMB-märkt sonden. Förutom den protonerade Jon [M + H]+, natrium addukter [M + Na]+ och [M + 2Na-H]+ visas. Acetonitril (ACN) är närvarande under LC analysen, det kan hittas som en addukt i masspektra (visas för DMB-Neu5Gc, figur 4: övre högra panelen). På grund av splittringen orsakad av lett dekompensation aktiveringar genereras i regionen electronspray transport mellan kapillären och den första skimmern, uttorkad sialic acid arter [M + H]+-H2O kan också observeras (visas för DMB-Neu5Ac, figur 4: övre vänstra panelen)23,27. I LC setup eluerar DMB-Neu5Gc strax efter de oreagerad eller delvis reagerad DMB-arterna. Därför kan insamlade DMB-Neu5Gc sonden innehålla föroreningar som orsakas av dessa reaktion intermediärer. Detta fungerar som en förklaring till uppkomsten av odefinierad toppar i massa spectrumen av DMB-Neu5Gc (figur 4: övre högra panelen).

Behandling av Kelly neuroblastomceller med ManNProp eller ManNBut leder till minskat uttryck av polysialic syra NCAM, som visas genom Western blot analys av cellmembranet från lyserat celler (figur 5). Polysialic syra visas normalt som ett utstryk gör att dess heterogenitet i storlek och laddning av (≈ 200 kDa). Behandling med ManNAc analoger leder till en minskning av polysialic syra på celler ytan: ju längre de alifatiska N-acyl sidokedjan, ju starkare den reducering28.

Figure 1
Figur 1: Den allmänna principen om MGE med N-acyl modified mannosamines. Efter behandling med N-acyl modifierade mannosamines, dessa ManNAc analoger är unidirectionally metaboliseras (intracellulär metabolism) till motsvarande icke-naturlig sialic syror. Dessa transporteras till Golgi, överförs till den respektive oligosackarid acceptorn av sialyltransferases, och uttrycks på cellytan som sialosides (här, ett glykoprotein). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativa kromatogram av DMB-märkt sialic acid standarder. DMB-märkt Neu5Ac (övre panelen) och Neu5Gc (nedre panelen) analyserades genom HPLC. Retention gånger (streckade linjer) och peak områden av båda sialic syror bestämdes efter injicera 10 ng av respekterade DMB-märkta arter in i HPLC-systemet. I de häri visas representativa kromatogram, DMB-Neu5Gc elueras efter cirka en 8 minuters retentionstiden och DMB-Neu5Ac på 11 min, respektive. Flera mindre toppar i kromatogrammet visas vanligtvis mellan 2-6 min, som representerar oreagerad DMB och reaktion intermediärer. En bråkdel av DMB-märkt Neu5Ac visas som en mindre förorening i standarden DMB-Neu5Gc (nedre panelen). Denna siffra är modifierad från referens22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: karakterisering av membran-bundna sialic syror av DMB-HPLC. Celler odlades i frånvaron (obehandlad, övre panelen) eller närvaron med 5 mM ManNAc (andra panel uppifrån), ManNProp (tredje panel uppifrån), eller ManNBut (lägre panel), respektive i 7 dagar. Medium bytte varje 24 h. celler skördats och membran bråk var beredd, märkt med DMB och analyseras genom HPLC. Jämförelse med kromatogram av DMB-märkt sialic acid standarder (figur 2) identifierades toppar på retentionstider mellan 8-9 min DMB-Neu5Gc och toppar mellan 10-11 min som DMB-Neu5Ac. Kromatogram från cell lysates jämfört med de toppar som erhållits från injicera DMB-märkt sialic acid standarder, och visa ytterligare odefinierad toppar. Detta beror på den interna orenhet sonderna, samt till det faktum att DMB kan reagerar inte bara med sialic acid närvarande i den cellen lysates, men också med andra α-keto syror som finns i cellen lysates, inklusive pyruvat, succinat och α-ketoglutarat. Toppar som endast visas i kromatogram av prover från celler odlade i närvaro av N-acyl modified mannosamine analoger ange motsvarande DMB-märkt icke naturliga sialic syror. Denna siffra är modifierad från referens22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: massa spektra av DMB-märkt sialic acid arter Funna i cellen lysates. HPLC retention toppar av intresse (se figur 3) samlades in och därefter analyseras av ESI-MS. 20 µL av de insamlade källskatter toppar skulle injiceras i LC-MSD systemet. Reaktion med DMB leder till en ökning av det molekylära samlas av 116,2 Da jämfört med motsvarande arter av oreagerad sialic acid. De positiva massa/laddning baserat spektrogram erhålls från olika sialic acid arter skildras (DMB-Neu5Ac: övre vänstra panelen, DMB-Neu5Gc: övre högra panelen, DMB-Neu5Prop: nedre vänstra panelen, DMB-Neu5But: nedre högra panelen). På grund av för att addukt bildandet är flera toppar synliga. Förutom den protonerade Jon [M + H]+, natrium addukter [M + Na]+ och [M + 2Na-H]+ visas. Acetonitril, som är närvarande under LC analysen, kan också hittas som en addukt (övre högra panelen). Uttorkad DMB-Neu5Ac, som genereras av fragmentering i instrumentet [M + H]+-H2O kan observeras (övre vänstra panelen). Insamlade DMB-Neu5Gc sonden kan innehålla föroreningar som orsakas av oreagerad DMB, liksom reaktion intermediärer ses som ytterligare odefinierad toppar (övre högra panelen). ACN, acetonitril; H, väte; Na, natrium. Denna siffra är modifierad från referens22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: analys av polysialylation av NCAM. Kelly neuroblastomceller odlades i frånvaro eller närvaro av 5 mM ManNAc, ManNProp eller ManNBut i 7 dagar. Celler skördats och proteiner skildes på 8% SDS-akrylamid geler och analyseras av Western blot med monoklonala anti-polySia antikroppen 735. Observera att polySia visas som ett utstryk på grund av dess heterogenitet i antal Sia, vilket resulterar i olika storlekar och avgifterna för polySia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Om kemiskt syntetiserade ManNAc derivat, ManNProp och ManNBut analyseras via masspektrometri, bör bara de rätta massa peak för båda exemplaren identifieras. Produkterna kan därför antas ha en renhetsgrad på 99%. Små mängder Neu5Gc, som normalt inte finns i mänskliga celler29, upptäcks i membran fraktioner av lyserat cellerna. Detta sker sannolikt genom en bärgning gångstig som rekryterar Neu5Gc från fetalt bovint serum sialoglycoconjugates i media30. Behandling med naturlig föregångare av sialic acid biosyntes, ManNAc, sänker drastiskt uttryckt av den Neu5Gc epitop på cellytan.

Tillämpningen av modifierade mannosamines är negligibly giftigt för alla celler undersökas så långt. Celler acceptera ökad millimolar socker koncentrationer inom mediet, vilket är nödvändigt, eftersom det finns inga specifika transportörer för N- acylmannosamines. Det har visats att cellsmedierade reaktioner aktiveras vid ansökan av N- acylmannosamines, som skulle kunna påverka cell tillväxt eller differentiering31,32. Huruvida detta beror på ett ändrat sialylation mönster eller återspeglar direkta effekter på den modifierade sialylation är inte känt hittills. Tillväxt av celler i närvaro av de C2-modifierat ManNAc analoger, ManNProp eller ManNBut resulterar i uttrycket av icke naturliga sialic acid arter bär motsvarande N-acyl substitution. Metabolisk effektivitet av två testade N-acyl modified mannosamines varierar. Behandling med ManNProp leder oftast till uttryck för den motsvarande Neu5Prop på cellytan och ett minskat uttryck av Neu5Ac samt Neu5Gc. Andra N-acyl modified mannosamine analoger, som N- cyclopropylcarbamyl mannosamine, tenderar att ha en ännu högre metabolisk effektivitet22.

Tidigare studier visade att sialic prekursorer stör polysialylation. Polysialic syror uttrycks nästan uteslutande på NCAM. Intressant, kan NCAM vara polysialylated av två distinkta polysialyltransferases uttryckt i Golgi (ST8SiaII och ST8SiaIV). Det visade sig att ManNProp, ManNBut och andra N-acyl-modifierade mannosamines störa polysialylation och att detta är huvudsakligen på grund av interaktion med ST8SiaII14. Denna sialyltransferase uttrycks under utveckling och är viktigt för utvecklingen av hjärnan. Intressant också, många tumörer från neuronala ursprung åter uttrycka ST8SiaII ökar deras malignitet och ytterligare göra dem omätbara från immunsystemet33. Däremot leder tillämpningen av ManNAc till en ökning av polySia, eftersom det leder till en ökning av CMP-Neu5Ac, vilket är naturligt substrat för båda polysialyltransferases.

MGE är en unik metod att införa roman sialic syror på proteiner av intresse (t.ex. erytropoietin) och därigenom modulera dess funktion. Dessutom kan det användas för att modulera cell surface glycosylation, som kan vara av intresse för många sjukdomar, såsom cancer, eftersom många cancerceller försöker undkomma immunförsvaret genom uttrycker höga nivåer av sialic acid. Metoden presenteras här tillåter: först, att utföra glycoengineering med hjälp av cellkulturer och andra, att analysera konstruerad glycans att bevisa framgångsrika glycoengineering. Metoden är mycket robust och hittills redovisas inga fallgropar; Däremot har metoden utökats för att införa kemiska aktiva grupper utför klick-kemi på celler13.

Här presenterar vi två ManNAc analoger med alifatiska N-acyl side chain modifieringar som är comparably enkla att syntetisera, ens av laboratorier med mindre utrustning och mindre erfarenhet av kemisk syntes. Grupper som är mer bekant för organisk kemi kunde syntetisera andra ManNAc analoger med mer komplexa strukturer och använda dessa för MGE, inklusive de så kallade 'bioorthogonal' analoger, som kan utnyttjas, till exempel för att visualisera sialylated Glykokonjugat. Det finns översiktsartiklar som ger en översikt av N-acetyl-mannosamine derivat som har syntetiserats hittills13,34. N- azidoacetyl mannosamine (ManNAz), ett ämne som ofta används för att visualisera sialylated glycans, är kommersiellt tillgängliga. På grund av låg membran genomträngligheten av ManNAc analoger, kan det vara fördelaktigt att använda derivat av dessa sockerarter med skyddade hydroxyl-grupper, t.ex., peracetylated ManNAc analoger. Efter inresan cytoplasman, klyvs skydda grupperna av cytoplasmisk esteraser, frigjort de aktiva monosackarider35,36,37. Dock exponera peracetylated ManNAc analoger högre cytotoxicitet jämfört med motsvarande oskyddade derivat.

I detta manuskript valde vi förevigade neuroblastomceller för våra experiment med MGE. Allmänhet, MGE (särskilt med ManNProp och ManNBut) kan användas i en mängd olika cellinjer, inklusive förevigade cellinjer (se Wratil et al. 13 för exempel) och primärceller38,39. MGE utnyttjades dessutom framgångsrikt för att förändra sialylation i vivo i C. elegans40, zebrafiskar17,41, mus19,20,42och råtta 43 , 44. behandlingstiden och koncentrationen av de ManNAc analoger i MGE experiment kan varieras för att påverka denna metod metabolisk effektivitet. Från vår erfarenhet motsvarar längre behandling och högre koncentrationer bättre ersättning av de naturligt förekommande sialic acid arterna i Glykokonjugat av modifierad Neu5R. Om mycket höga koncentrationer av ManNAc derivat skall användas, cytotoxiciteten hos behandling bör utvärderas, exempelvis genom MTT analysen eller resazurin minskning analysen.

I detta manuskript föreslår vi att du använder ultra-ultraljudsbehandling för cell homogenisering. Andra cell lysis metoder prövades i vårt laboratorium, inklusive douncing på is (ca 250 linjer) och franska pressen störningar (10.000 psi, 4 passager), med jämförbara resultat om mängden sialic acid upptäckts i proven. Fördelen med Ultra ljud homogenisering är att den behöver lite tid och kräver inte tillägg av DNAase till proverna före lysis.

Vår analys fokuserade vi på membran fraktioner av cellen lysates, eftersom vi ville visa förändringar i sialylation hos membranet bunden Glykokonjugat. Sialic acid derivat och deras koncentrationer kan också mätas i cytosolen av celler, efter den membran-fraktionen har skilts av höghastighetståg centrifugering, med samma metod som beskrivs ovan. Koncentrationerna av sialic acid i cytosolen är dock upp till 100 x lägre jämfört med sialic acid uttryck på cellmembran7. Således behövs större mängder av celler för att generera tillförlitliga resultat. Poolen av cytosoliska, aktiverade CMP-sialic acid kan mätas indirekt genom förbehandling av de cytosoliska fraktionerna av cell lysates med natriumborhydrid före hydrolys7,45. För att hydrolysera sialic acid i Glykokonjugat och sialic acid med hydroxyl ändringar, inkuberades cellerna med 1 M TFA. Andra sura lösningar kan användas för hydrolys, samt, t.ex., 2 M propionsyra, 2 M ättiksyra eller 1 M HCl.

En möjlig stött fråga under HPLC-analysen är att topparna av intresse överlappande med odefinierad toppar. Detta är särskilt problematiskt när mängden sialic syra i ett prov beräknas genom arean under kurvan för en viss topp. För att skilja en topp sevärdheter från en odefinierad peak, acetonitril koncentrationen i HPLC vätskan kan justeras (± 3%). Vi föreslår att du använder stadig koncentrationen av lösningsmedel för HPLC analys, vilket ger fördelen att förbereda lösningsmedel blandningen innan kromatografi. Därför vår metod kräver bara en pump för HPLC och är möjligt för en rad olika HPLC system. Om mer än en pump är tillgängliga i HPLC-systemet, en Isokratisk lutning med ökande koncentrationer av acetonitril kan tillämpas, t.ex., 4-9% i 35 min45. Genom att använda denna teknik, kommer retentionstiden för vissa HPLC toppar att ändras betydligt. Denna strategi kan också bidra till bättre separation av överlappande toppar. Matrix-assisted laser desorption jonisering masspektrometri (MALDI-MS) inrättades framgångsrikt kontrollera uttrycket av modifierad sialic acid arter på cell surface45och därmed tjänar som en motsvarighet till ESI-MS-metoden presenteras här .

Tack vare hydrophilicitet av ManNAc analoger och bristen på specifika transportörer för upptaget av dessa derivat46behövs höga koncentrationer i MGE experiment med dessa föreningar. Upp-skalas experiment, och särskilt i in-vivo studier är därför stora mängder av de respektive ManNAc analoger nödvändiga visar en möjlig begränsning av denna teknik. Däremot, beroende på de cell-linjer som används, är ett visst minimalt antal behandlade cellerna nödvändigt att få tillförlitliga resultat i HPLC-analysen. Från vår erfarenhet räcker minst cirka 100.000 vidhäftande celler eller 150.000 suspension celler (1-2 brunnar i en plattan med 96 brunnar med konfluenta celler). Detta kan bli en flaskhals, om analysen är att ändras storleken, till exempel i screening metoder.

Med de metoder som presenteras i detta manuskript, kan sialic acid och dess derivat upptäckas i cellen lysates. Dock kan inte struktur och sammansättning av Glykokonjugat i celler behandlas med ManNAc derivat bedömas med häri beskrivna tekniken. Att lösa struktur Glykokonjugat, e.g.,N- och O- glycans, kräver i allmänhet större erfarenhet och en glycomics anläggning47. Till vår kunskap, hittills finns inga data tillgängliga på den distinkta strukturen av Glykokonjugat från celler som har behandlats med ManNAc analoger.

Western blot analys av polysialic syra är en mycket snabb och enkel metod. Data som erhålls med denna metod är dock inte kvantitativa, eftersom upptäckt använder antikroppar och chemiluminescence. HPLC-metoder är därför en fördel över Western blotting. Vi föreslår dock metoden immunoblotting, eftersom det är lätt att applicera och kända fungerar mycket tillförlitligt.

Uttrycket av sialic acid på cellytan kan ändras också genom andra metoder än MGE. Som beskrivits ovan, kan celler behandlas med sialidase, ett enzym som klyver sialic acid rester från Glykokonjugat i ett relativt ospecifikt sätt. Sialidase behandling inducerar följaktligen hyposialylation i behandlade cellerna. Sialidase behandling är tyvärr en ganska begränsad teknik, eftersom det är cytotoxiska, inte genomförbart för lång tid behandling och inte är tillämpliga i in-vivo -experiment. En annan teknik att inducera hyposialylation i cellerna är med hjälp av hämmare av sialic acid biosyntes. En mängd hämmare finns som antingen rikta det nyckel-enzymet av sialic acid biosyntes, de UDP -N- acetylglukosamin-2-epimerase /N- acetylmannosamine-Kinas (GNE/MNK) eller gruppen av sialyltransferases6, 7,8,48. En av dessa föreningar, en C3-fluorerade sialic acid analoga, visades att sänka uttrycket av sialic acid i levande möss49. Djur som behandlats med detta ämne, dock visade nedsatt leverfunktion, irreversibel njursvikt och underlåtenhet att blomstra49. Dessa resultat bekräftar den avgörande rollen som Neu5Ac i lever och njure funktion och dessutom anges gränserna för sialylation-hämmare för i vivo experiment. En tredje metod att generera celler med förändrad cell surface sialylation är genom att störa uttrycket av enzymer som är avgörande för sialic acid biosyntes. En knock-down av den GNE/MNK i förevigade celler, till exempel visades att återge dessa celler hyposialylated 9. Möjlighet att relativt enkelt inpressning och - gener i mobilnät och i vivo med romanen och väl erkända CRISPR-Cas9-teknik kan leda till nya upptäckter rörande sialic acid biosyntes och cell surface sialylation.

Fördelen med MGE jämfört med de tekniker som beskrivs här, är att det är lätt att applicera och anpassningsbar till en myriad av olika experiment, från in vitro- studier till cell baserat analyser och i vivo experiment. En alternativ metod för att mäta uttryck och koncentrationer av olika sialic acid arter i cellprover är av högpresterande anjon-exchange kromatografi (HPAEC) med pulsad elektrokemisk detektion50. Med hjälp av denna metod, ett uttryck för sialic acid mäts direkt och inte efter märkning med ett fluorescerande färgämne. Fördelen med denna metod är att det kan utnyttjas också för att analysera monosackarider än sialic acid och dess derivat i cell - och protein-prover. Tyvärr är känsligheten hos HPAEC lägre jämfört med fluorometric detektion av DMB-sialic acid. HPAEC är således begränsad till experiment med tillgången på stora prov belopp51.

De häri beskrivna metoderna kan användas för att avslöja okända egenskaper av Glykokonjugat. En mängd exempel på användning av MGE att undersöka sialic acid beroende interaktioner redan finns13, visar genomförbarheten av denna teknik i samband med ett brett utbud av försöksuppställningar.

MGE med N- acetylmannosamines används numera främst av forskare inom glycobiology. Vi hoppas att denna teknik kommer att erkännas av en bredare publik som ett mångsidigt verktyg för att ändra Glykokonjugat. Andra områden, inklusive immunologi, virologi, neurologi eller onkologi gynnas genom att anpassa denna teknik för sina egna syften. Sådan cross-over-forskning kan möjliggöra upptäckten av ännu outforskade områden, och därför ge en bättre förståelse av hälsa och sjukdom. I tidiga studier, till exempel användes denna teknik att producera glykoproteiner med modifierade glycosylation, som senare serven för i vivo vaccination. I vissa fall kan behandling med sådana glykomodifierad vacciner leda till produktion av antikroppar som exponerade avancerade aviditet och toxicitet för respektive mål52,53. Andra har framgångsrikt använt MGE för att utveckla en modell för riktade tumör terapi i möss54. En annan studie visade att systemisk i vivo injektion av ManNProp främjas nerv regenerering55. När det gäller polySia visades det att minskar uttrycket av denna epitop i neuroblastomceller av de metoder som presenteras i detta manuskript, ökar känsligheten av dessa tumörceller för strålning eller behandling med cytostatika56.

Mängder sialic acid mätt inom prover kan variera beroende på vilken metod som används för att lossa de behandlade cellerna. I detta manuskript användes inkubation med trypsin att lossa cellerna. Om andra tekniker är att användas, såsom skrapning cellerna eller långvariga behandling med PBS + EDTA, skilja mängder sialic acid mätt i proverna. Även anpassa inkubationstiden med trypsin kan ha en inverkan på sialic acid koncentrationerna mäts senare. Från vår erfarenhet, effekterna av metoden cell lösgörande på mängder sialic acid mätt är under 15%, men om resultaten ska normaliseras och jämförs, detta kan bli en viktig flaskhals. Dessutom kan metoden för Lysering av cellerna påverka resultatet av HPLC-analysen. Således rekommenderar vi läsaren att standardisera cell lösgörande och lysis i sina experiment.

För att uppnå separation i bråk som membranet i cellen lysates, använde vi centrifugering för 2 h vid 20 000 x g och 4 ° C (se avsnitt 5.1). Andra centrifugering protokoll kan påverka separation och därför mängder sialic acid upptäckts i proven. En kritisk förening inom detta protokoll är DMB, eftersom det är mycket känsliga för ljus och försämras med tiden. Här rekommenderar vi att små alikvoter av DMB-lösningen och lagra det som bestånd vid - 20 ° C, skyddas från ljus (avsnitt 1.6.1). Detta sätt DMB-lösningen kan förvaras i flera veckor. Om resultaten från DMB-HPLC-analysen visar minska signaler för sialic acid arter eller öka signaler inom de första 6 min av HPLC mätningen, bör som representerar DMB och dess reaktionsprodukter, ny DMB-lösning förberedas. Inte frysas på nytt och återanvändning DMB-lösning efter upptining det. Efter DMB märkning, bör alla prover analyseras omedelbart. Om ett större antal prover (> 10) skall analyseras, bör dessa prover vara uppdelad i mindre märken och gradvis märkt med DMB. Båda märkning reaktionen gånger samt DMB-märkt sonderna ska skyddas från ljus på alla. Efter eluering, bör DMB-märkt sialic acid arten analyseras omedelbart av ESI-MS. direkt koppling av HPLC med systemets ESI-MS (i en LC-ESI-MS setup) är inte nödvändigt, men kan vara fördelaktigt att uppnå högre kvalitet på masspektrometri analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar L. D. Nguyen för korrekturläsning manuskriptet och för givande diskussioner. Dessutom tackar vi J. Dernedde och H. G. Nguyen för att hjälpa oss förbereda video shoot. De flesta scener av videon sköts i laboratorierna i R. Tauber. Vi tackar också Max Planck-institutet för kolloider och gränssnitt, och för att ge oss fri tillgång till deras masspektrometri anläggning. RH stöddes av DFGEN (ProMoAge).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Agilent
ESI-MSD-System Agilent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. , 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).

Tags

Bioteknik frågan 129 Sialic acid polysialic acid vätskekromatografi cellodling metaboliska glycoengineering metaboliska oligosackarid engineering
Metaboliska Glycoengineering av Sialic Acid använder <em>N</em>-acyl-modified Mannosamines
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wratil, P. R., Horstkorte, R.… More

Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter