Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Metaboliske Glycoengineering Sialic syre ved hjælp af N-acyl-ændret Mannosamines

Published: November 25, 2017 doi: 10.3791/55746
Automatic Translation
1,2, 3
1Max von Pettenkofer-Institut & Genzentrum, Virologie, Nationales Referenzzentrum für Retroviren, Medizinische Fakultät, LMU München, 2Institut für Laboratoriumsmedizin, klinische Chemie und Pathobiochemie, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Institut für Physiologische Chemie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Summary

Sialic syre er en typisk monosakkarid-enhed fundet i glycoconjugates. Det er involveret i et væld af molekylære og cellulære vekselvirkninger. Her vil vi præsentere en metode til at ændre celle overflade sialic syre udtryk ved hjælp af metaboliske glycoengineering med N- acetylmannosamine derivater.

Abstract

Sialic syre (Sia) er en meget vigtig bestanddel af glycoconjugates, som N- og O- glycans eller glycolipider. På grund af dens position på ikke-reducerende termini af oligo - og polysaccharider, såvel som dens unikke kemiske karakteristika, er sialic syre involveret i en lang række forskellige receptor-ligand interaktioner. Ved at ændre udtryk for sialic syre på celleoverfladen, vil sialic syre-afhængige interaktioner derfor blive påvirket. Dette kan være nyttigt at undersøge sialic syre-afhængige interaktioner og har potentiale til at påvirke visse sygdomme på en gavnlig måde. Via metaboliske glycoengineering (MGE), kan udtryk for sialic syre på cellens overflade moduleres. Heri, bliver celler, væv eller endda hele dyr behandlet med C2-modificerede derivater af N- acetylmannosamine (ManNAc). Disse amino sukker er fungere som sialic syre forløber molekyler og derfor metaboliseres til den tilsvarende sialic syre arter og udtrykt på glycoconjugates. Anvende denne metode producerer spændende effekter på forskellige biologiske processer. For eksempel, det kan drastisk at reducere udtryk af polysialic syre (polySia) i behandlede neuronale celler og dermed påvirker neuronal vækst og differentiering. Her, viser vi den kemiske syntese af to af de mest almindelige C2-modificerede N- acylmannosamine derivater, N- propionylmannosamine (ManNProp) og N- butanoylmannosamine (ManNBut), og yderligere viser hvordan disse ikke-naturlige amino sukker kan anvendes i celle kultur eksperimenter. Udtryk i ændrede sialic syre arter er kvantificeret ved højtryksvæskekromatografi (HPLC) og yderligere analyseret via massespektrometri. Effekter på polysialic syre udtryk er belyst via Western blot ved hjælp af en kommercielt tilgængelig polysialic syre antistof.

Introduction

Sialic syre er et monosakkarid, der typisk kan findes på de ikke-reducerende termini af glycoconjugates, som N- og O- glycans eller glycolipider. Blandt alle monosaccharider har sialic syre nogle unikke kemiske egenskaber. Det har en 9 C-atom rygrad, en carboxylic gruppe i stilling, C-1, der er deprotonated og dermed negativt ladede under fysiologiske forhold og en amino funktion i C-5 position. Selv om over 50 naturligt forekommende varianter af sialic syre er blevet karakteriseret til dato1, er den fremherskende form for sialic syre fundet i mennesker N- acetylneuraminic syre (Neu5Ac). Andre pattedyr express også større mængder af N- glycolylneuraminic syre (Neu5Gc)2,3.

På grund af sin udsatte position i glycoconjugates er sialic syre involveret i et utal af receptor-ligand interaktioner, fx hemagglutinin afhængige bindende af influenzavirus til vært celler4. En sialic syre epitop med vigtige biologiske funktioner, især under embryogenese og i nervesystemet, er polysialic syre. Polysialic syre er en polymer af op til 200 alpha 2,8-linked sialic syre. Store protein bærer af polysialic syre er neurale celle vedhæftning molekyle (NCAM). Polysialic syre udtryk modulerer adhesive ejendommen af NCAM, polysialic syre udtryk reducerer friktion og øger plasticitet med nervesystemet5.

Ændringer i udtrykket (poly) sialic syre vil i sidste ende påvirker et væld af forskellige biologiske vekselvirkninger. Dette kan bruges til at studere kendte sialic syre brugerafhængige processer på molekylært niveau, at afdække roman glycoconjugate interaktioner, eller udforske mulige terapeutiske tilgange. Der er forskellige metoder til rådighed som udtryk for sialic syre på cellens overflade kan moduleres, for eksempel behandling med sialic syre specifikke glykosidaser (sialidases), hæmning af enzymer involveret i sialic syre biosyntesen6 ,7,8, eller banke eller ændre udtryk for det centrale enzym sialic syre biosyntesen9.

En anden alsidige metode til at modulere sialic syre udtryk er MGE (også kendt som metaboliske oligosaccharid engineering, MOE). Heri, behandles celler, væv eller selv dyr med ikke-naturlige derivater af ManNAc, der bærer C2-amino ændringer. Der forløber molekyler til sialic syre, efter cellulære optagelse, disse ManNAc-analoger er envejs metaboliseret til ikke-naturlige sialic syre og kan udtrykkes på sialylated glycoconjugates. Celler behandles med ManNAc derivater transporterer alifatiske C2-ændringer, såsom ManNProp eller ManNBut, indarbejde N- propionylneuraminic syre (Neu5Prop) eller N- butanoylneuraminic syre (Neu5But) i deres glycoconjugates10 , 11. ved hjælp af funktionelle grupper introduceret til C2-positionen for ManNAc, kan være koblet forekommende ikke-naturlige sialic syre, fx via Staudinger ligatur eller indeholder alkine cycloaddition, med fluorescerende farvestoffer og derfor visualiseret på celle overflade12.

Udtryk for disse ikke-naturlige sialic syre har spændende effekter på mange biologiske processer, herunder patogen infektioner, vedhæftning og migration af tumorceller, generelle celle vedhæftning, samt vascularization og differentiering (til gennemsyn Se: Wratil et al. 13). interessant, MGE med N-acyl modificerede mannosamines kan også bruges til at blande sig med udtryk af polysialic syre. Polysialic syre er genereret af to forskellige polysialyltransferases (ST8SiaII og ST8SiaIV). Det er blevet påvist, at polysialyltransferase ST8SiaII hæmmes af unaturlige sialic syre prækursorer, såsom ManNProp eller ManNBut14,15. Derudover er det blevet påvist i humane neuroblastoma celler, ManNProp eller ManNBut ansøgning også reducerer sialylation i alt15.

MGE med N-acyl modificerede mannosamines er en nem at anvende metode, der er blevet med held brugt, ikke kun i pattedyr og bakterier cellekultur men også i hele dyr af forskellige arter, som Caenorhabditis elegans16, zebrafisk17, eller mus18,19,20,21. Især ManNAc derivater forsynet med alifatiske ændringer, herunder ManNProp og ManNBut, er negligibly cytotoksisk, selv ved millimolar koncentrationer i cellekulturmedium eller blodplasma. De er desuden relativt nemt at syntetisere.

Her vi give detaljer om hvordan man bruger MGE med N-acetyl ændret mannosamines. Først, den kemiske syntese af to af de mest udbredte ManNAc derivater i dette felt, ManNProp og ManNBut, er forklaret. Næste, vi viser, hvordan MGE kan anvendes i et i vivo eksperiment. Som et eksempel, neuroblastoma cellelinie Kelly blev valgt til at demonstrere nedsat udtryk for polysialic epitop af Western duppes efter behandling med ManNAc derivater. Ikke-naturlige sialic syre på cellens overflade var kvantificeres ved HPLC og yderligere analyseret via massespektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fremstilling af buffere og reagenser

  1. Forberedelse af 3 mM natrium methoxide løsning
    1. Opløse 8,1 mg natrium methoxide i 50 mL methanol (3 mM) i en 100 mL glasflaske med en røre bar. Opbevares ved stuetemperatur (RT) i flere uger.
  2. Forberedelse af Tris-HCl buffer
    1. Kombiner 8.766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl og 146 mg EDTA i en 100 mL glasflaske med en røre bar og opløses i 80 mL vand.
    2. Tilføje natriumhydroxid (1 M, i vand) eller HCl (20% i vand) til omrøring løsningen, mens observere pH med et pH-meter, og justeres til pH 8,0.
    3. Tilføje mængden vand nødvendig for at opnå en endelige rumfang på 100 mL. Filtrer løsning ved hjælp af et 0,22 µm sterile filtersystem.
      Bemærk: 100 mL Tris-HCl buffer indeholder 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl og 5 mM EDTA (pH 8.0). Opløsningen kan opbevares ved 4 ° C i flere uger.
  3. Forberedelse af aprotinin løsning
    1. Opløse 10 mg aprotinin i 1 mL vand (1,54 mM). Alikvot aprotinin løsning i 10 x 1,5 mL-plast rør (100 µL). Opbevares ved-20 ° C i flere uger.
  4. Forberedelse af leupeptin løsning
    1. Opløse 10 mg leupeptin i 2 mL vand (10 mM). Alikvot leupeptin løsning 10 x 1,5 mL-plast rør. Opbevares ved-20 ° C i flere uger.
  5. Forberedelse af phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) løsning
    1. Opløse 34,8 mg PMSF i 2 mL ethanol (100 mM). Alikvot PMSF løsning i 10 x 1,5 mL-plast rør. Opbevares ved-20 ° C i flere uger.
  6. Forberedelse af 1,2-diamino-4,5-methyldioxybenzol-dihydrochlorid (DMB) løsning
    1. Kombiner 15.62 mg DMB, 352 µL β-mercaptoethanol, og 48 µL natrium bisulfite-løsning (39%), og tilføje 9,6 mL vand (6,9 mM DMB, 500 mM β-mercaptoethanol og 0,19% natrium bisulfite). Alikvot DMB løsning i 40 x 1,5 mL-plast rør (250 µL). Opbevares beskyttet mod lys ved-20 ° C i flere uger.
  7. Forberedelse af 1 M trifluoroacetic syre (TFA) løsning
    1. Tilføj 770.3 µL af 100% TFA 9,23 mL vand i en 15 mL plastik rør (1 M). Opbevares ved 4 ° C i flere uger.
  8. Forberedelse af 120 mM TFA løsning
    1. Tilføje 92.4 µL TFA (100%) til 9.91 mL vand (120 mM) i en 15 mL plastik rør. Opbevares ved 4 ° C i flere uger.
  9. Forberedelse af 400 mM natriumhydroxid (NaOH)
    1. 160 mg NaOH i 10 mL vand (400 mM) i en 15 mL plastrør opløses. Opbevares ved 4 ° C i flere uger.
  10. Forberedelse af vestlige skamplet lysisbuffer
    1. Opløse 5.84 g NaCl, 0,1 g Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), 0,1 g CaCl2, 0,95 g MgCl2og 1 g Triton-X100 i 100 mL vand, og ph indstilles til 7,8. Opbevares ved 4 ° C. Tilføj 100 µL af hver protease hæmmer (aprotinin, leupeptin og PMSF) før du bruger lysisbuffer.
  11. Forberedelse af sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) buffer
    1. 0,3 g Tris, 1,5 g glycin og 0,1 g SDS i 100 mL vand opløses og ph indstilles til 7,3. Butik på RT.
  12. Forberedelse af vestlige skamplet buffer
    1. 0,3 g Tris, 1,1 g glycin i 90 mL vand opløses og tilsæt 10 mL ethanol. Butik på RT.
  13. Forberedelse af blokering løsning
    1. Opløse 1 g fedt gratis Mælkeenergi i 25 mL fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Altid forberede friske.

2. Sammenfatning af ManNProp og relaterede N-acyl-ændret Mannosamines

  1. Opløs 431.2 mg mannosamine hydrochlorid i 10 mL 3 mM natrium methoxide løsning i en 50 mL glasflaske med en røre bar.
  2. Cool blanding på isen til 0 ° C. Til opløsningen omrøring tilsættes langsomt dråbevis 210 µL propionyl chlorid (2,4 mmol) eller 248 µL butanoyl chlorid (2,4 mmol) at syntetisere ManNProp eller ManNBut, henholdsvis. Inkuber omrøring blandingen ved 0 ° C til 4 h.
  3. Opløsningen overføres til en 50 mL plastikrør. Stikke 4-8 huller i låget af den plast rør med en tynd nål. Hurtigt fryse løsning ved hjælp af flydende nitrogen og efterfølgende lyophilize (freeze dry) det i 48 timer, eller indtil det er helt tørt.
  4. Bland 350 g silicagel 60 med 750 mL ethanol-acetat/methanol/vand (15:2:1) (dette er en suspension). Fyld en glaskolonne (35 mm diameter og 70 cm længde) med silica gel 60 suspension og vaske kolonnen parat med en ekstra 100 mL ethanol-acetat/methanol/vand (15:2:1) før brug.
  5. Opløses de tørrede produkter fra trin 2.3 (5 g tørret produkt) i 10 mL ethanol-acetat/methanol/vand (15:2:1) og indlæse dem ved hjælp af en pipette på silica gel kolonne. Indsamle 4 mL fraktioner efter 500 mL (for ManNProp). Bemærk: ManNBut vil elueres af kolonnen ca efter 700 mL.
  6. Overføre de eluted brøker til 15 mL plastik rør. Stikke 3-6 huller til låg af plast rør med en tynd nål. Hurtig fryse løsning ved hjælp af flydende nitrogen og efterfølgende lyophilize det indtil det er helt tørt.
    Bemærk: De frysetørrede produkter kan opbevares i flere måneder på RT.
  7. Kontrollere renhed af produkterne af massespektrometri (Se afsnit 9).
    Bemærk: Alternativt renhed kan også kontrolleres af 1H Kernemagnetisk resonans (NMR).

3. cellekultur

  1. Kultur Kelly neuroblastoma celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium indeholdende 10% føtal bovint serum, 100 U penicillin, 100 mg streptomycin, 2 mM L-glutamin indeholdende 5 mM ManNAc, 5 mM ManNProp eller 5 mM ManNBut, ved 37 ° C og 5% CO2.
    Bemærk: Celler dyrkes i medium uden ManNAc eller dets analoger anvendes som en kontrol.
  2. Forud for anvendelsen af mannosamines, frigør Kelly neuroblastoma celler ved inkubere dem i 10 min med trypsin/EDTA (0,25%, 0,02%, i PBS) og tæller ved hjælp af en Neubauer-kammer eller celle counter. Frø celler på definerede tal baseret på størrelsen af tallerken/fad.
    1. For at måle sialic syre monosaccharider, frø 1 x 105 celler i 500 µL medium i en 48-godt vævskultur plade. Analysen af polysialic syrer, frø 1 x 106 celler i 3 mL medium på en 6 cm diameter celle kultur parabol. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2. Erstatte medium hver 24 timer.
      Bemærk: Effekten af MGE stiger med den samlede tid i behandling. For høje metaboliske effektivitet behandling cellerne i 5-7 dage.
  3. Efter behandling, dekanteres medium. Vaske tallerkener/retter med PBS. Frigør cellerne ved inkubere dem i 10 min med trypsin/EDTA (0,25%, 0,02%, i PBS). Neutralisere trypsin ved at tilføje den samme mængde af cellekulturmedium til fritliggende cellerne. Overføre de fritliggende celler til 15 mL plastik rør. Centrifugeres prøver i 3 min. 500 x g og supernatanten.
    1. Tilføj 5 mL PBS og centrifugeres celler (Se trin 3.3). Gentag vask proceduren to gange mere.
      Bemærk: Vasket celle pellet uden supernatanten kan opbevares ved-20 ° C i flere dage. Hvis udtryk af polysialic syre til at blive belyst fortsætte til afsnit 10.

4. celle Lysis til HPLC-analysen

  1. Forberedelse af HPLC lysisbuffer
    1. Kombiner 5 mL Tris-HCl buffer, 5 µL aprotinin løsning, 20 µL leupeptin løsning og 50 µL PMSF løsning.
      Bemærk: 5 mL HPLC lysisbuffer vil indeholde 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 µM aprotinin, 40 µM Leupeptin, og 1 mM PMSF (pH 8.0). Denne buffer bør altid være forberedt friske før celle lysering.
  2. Genopslæmmes indsamlede celle pellets (trin 3.3) hver i 500 µL iskold HPLC-lysisbuffer, og ultra-sonikeres prøverne med en ultra-sonic processor nål tre gange i en periode på 30 s på medium-høj amplituder. Cool prøver på køl i mindst 1 minut mellem cyklusser.

5. adskillelse af membran brøkdel

  1. Centrifugeres mængden celle prøver for 2 h på 20.000 x g og 4 ° C. Adskille supernatanten (cirka 480 µL), der repræsenterer cytosole proteiner i 1,5 mL plasticrør. Bestemme proteinkoncentration af disse fraktioner ved hjælp af fxBradford eller bicinchoninic syre (BCA) assay.
    Bemærk: Proteinkoncentration (ca 1 mg/mL) i de cytosole fraktioner kan senere være relateret til de målte mængder af arternes respekterede sialic syre. Pellet repræsenterer membran brøkdel, som bruges i trin 6.1.

6. sur hydrolyse

Bemærk: Oligo- og polysaccharider i cellemembraner er hydrolyseret til monosakkarider. Yderligere, muligt O-ændringer i monosakkarider er hydrolyseret, så godt. Dette er nødvendigt for kvantitative HPLC-analysen, fordi det overvældende flertal af sialic syre membran brøkdele indgår naturligt i glycoconjugates og eventuelt kan bære O-acetyl eller O- lactolyl ændringer.

  1. Tilsæt 150 µL 1 M TFA-løsning til adskilt membran fraktioner (pellet fra afsnit 5). Inkuber prøver i 4 timer ved 80 ° C under omrystning på 200-600 rpm.
  2. Der centrifugeres prøver for ca. 30 min. på 20.000 x g og 21 ° C ved hjælp af 0,5 mL filter rør med 3 kDa udstødelse membraner, indtil den øverste fase volumen er mindre end 20 µL.
    Bemærk: Dette trin er vigtigt at afhænde højere molekylære debris.
  3. Overføre den nederste fase indeholdende mindre molekyler, herunder arternes sialic syre til 2 mL plasticrør. Stikke 2-4 huller i hætter af plast-rør med en tynd nål. Hurtig fryse prøver ved hjælp af flydende nitrogen og derefter lyophilize dem natten over.
    Bemærk: De tørrede prøver kan opbevares i flere dage på RT. Erstat en cap uden huller til længere opbevaring.

7. fluorescerende mærkning

  1. Re suspendere de tørrede prøver i 10 µL 120 mM TFA løsning og tilsæt 50 µL DMB løsning. Overføre prøver i mørke 1,5 mL rør til at beskytte dem mod ultraviolet lys.
  2. For standarder, opløse 1 µL Neu5Ac (60 ng/mL, i vand) eller 1 µL Neu5Gc (60 ng/mL, i vand) i 10 µL 120 mM TFA løsning i mørke 1,5 mL rør. Tilsæt 50 µL DMB løsning.
  3. Inkuber cellemembranen prøver og standarder for 1,5 h ved 56 ° C beskyttet mod lys. Efter inkubationen tilføje 4 µL 400 mM NaOH løsning til hver prøve at stoppe den mærkning reaktion.

8. HPLC-analysen

Bemærk: Mærket prøver er analyseret på en HPLC system udstyret med en kolonne med C18 RP (110 Å, 3 µm partikelstørrelse, 4.6 x 150 mm), en fluorescens detektor og en brøkdel collector. Opløsningsmidler anvendes er methanol, acetonitril, og vand. Sørg for at degas alle opløsningsmidler før målingerne, hvis HPLC system mangler en intern afgasser.

  1. Indstil temperaturen i kolonnen til 40 ° C og konfigurere fluorescens detektor med 373 nm for excitation og 448 nm for emission, henholdsvis. Injicér 10 µL sample volumen og adskille sonder i 50 min. på 0,5 mL/min. strømningshastighed med methanol/acetonitril/vand (6:8:86) som elueringsvæsken. Massespektrometri analyse, indsamle toppene af interesse.
    Bemærk: Neu5Gc forventes at eluatet efter 6-8 min, Neu5Ac efter 9-12 min, Neu5Prop efter 17-23 min, og Neu5But efter 38-44 min. De fraktionerede prøver kan opbevares i flere timer ved 4 ° C beskyttet mod lys.
  2. Efter måling af hver prøve, vask kolonnen i 7,5 min. på 1,0 mL/min. strømningshastighed (≈ 1,5 kolonne diskenheder) med methanol/acetonitril/vand (6:25:69) og re reagensglasset system for 7,5 min. ved 1,0 mL/min. strømningshastighed med methanol/acetonitril/vand (6:8:86).
  3. Kvantitativ analyse, beregne arealet under kurven for sialic syre toppene af interesse ved hjælp af den driver software af den respektive HPLC-system22.
    Bemærk: Opnåede data kan være relateret til Neu5Ac eller Neu5Gc-standard og de målte protein koncentrationer i de cytosole fraktioner (Se afsnit 5.1).

9. massespektrometri analyse af Sialic syre monosaccharider

Bemærk: HPLC fastholdelse toppene af interesse kan yderligere analyseres af væskekromatografi (LC) electrospray Ionisation massespektrometri (ESI-MS), for at kontrollere de unaturlige sialic syre arter.

  1. For massespektrometri analyse, indsprøjtes 20 µL af indsamlede prøven i en LC/masse selektiv detektor (MSD) system med 79,9% methanol, 20% isopropylalkohol og 0,1% myresyre som elueringsvæsken, 0,5 mL/min. strømningshastighed, 4 kV kapillær spænding og 350 ° C kapillær temperatur 22 , 23.
  2. Evalueringssoftware af de respektive LC/MSD system, Vælg toppen af interesse i den samlede ion kromatogram. Se den løst peak masse spektrum. Vise positiv masse/ladning forholdet mellem 300 og 700.
    Bemærk: DMB mærkning af sialic syre fører til en stigning i 116.2 g/mol molekylvægt. DMB-mærket sialic syre arter har følgende molekylære masserne: DMB-Neu5Ac = 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436.2 g/mol, DMB-Neu5But = 453.2 g/mol. fælles adukter acetonitril, natrium eller isopropylalkohol.

10. Western Blot analyse af Polysialic syre i Kelly Neuroblastoma celler

  1. Forberedelse af cellelysater
    1. Tilføje 1 mL vestlige skamplet lysisbuffer til celle pellets fra trin 3.3 og vortex. Inkuber i 30 min på is. Vortex hvert 5 min. Centrifugeres prøver til 1,5 h på 20.000 x g og 4 ° C. Indsamle supernatanten som indeholder proteiner fra de lysed celler.
    2. Bestemme protein koncentrationen af protein fraktioner, f.eks., Bradford eller BCA assay. Fortynd prøver til en proteinkoncentration af 1,5 µg/µL i lysisbuffer.
    3. Forberede prøverne for SDS-side ved at tilføje 10 µL Laemmli prøvebuffer 90 µL proteinfraktion (1,5 µg/µL) og kog prøven for 5 min24.
  2. Immunoblotting
    1. Bruge 8% SDS-acrylamid geler med 20-30 µL lommer og 0,75 eller 1 mm tykkelse. Kør gelen på 25 mA i 2 timer ved RT.
    2. Fjern forsigtigt dækslet glas fra gel. Skåret ud og kassere den øverste del af gelen indeholder lastning lommer. Placer gel på en nitrocellulose membran (0,2 µm), tidligere gennemblødt i vestlige skamplet buffer. Overføre proteinerne til nitrocellulose efter anbefaling af systemet (f.eks. 250 mA i 1 time ved 4 ° C).
    3. Fjerne nitrocellulose membran fra blotting systemet. Pletten skamplet med Ponceau rød til at visualisere proteinerne. Overføre nitrocellulose membran ind i en plastik kammer og der tilsættes 10 mL blokerende løsning. Inkuber i 1 time på RT eller natten over ved 4 ° C.
    4. Dekanteres blokerende løsningen og tilføje monoklonale anti-polySia 735 antistof (1 µg/mL) i PBS. Inkuber membran for 1 h i RT eller natten over ved 4 ° C. Efter inkubationen vaske membran mindst tre gange for 5 min med PBS.
    5. Tilføje polyklonale anti-mus IgG sekundær antistof (1 µg/mL) koblet til peberrodsperoxidase (HRP) eller en fluorescerende etiket i PBS. Inkuber membran for 1 h på RT. Efter inkubationen vaske membran mindst tre gange for 5 min med PBS.
    6. Overføre membran på en tallerken med en passende imager. Registrere signal ifølge producentens anvisninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HPLC kromatogrammer af fluorescerende mærket Neu5Ac og Neu5Gc standarder er afbildet i figur 2. Ved hjælp af den heri beskrevne metode, eluerer DMB-mærket Neu5Gc typisk mellem 7-9 min eluering tid, og DMB-Neu5Ac mellem 10-12 min. Adskillige mindre toppe i kromatogrammet vises normalt mellem 2-6 min. Disse toppe repræsenterer ureageret DMB og reaktion mellemprodukter25.

Figur 3 viser repræsentative kromatogrammer af cellelysater. Sammenlignet med kromatogrammer af DMB-mærket standarder (figur 2), i disse kromatogrammer adskillige udefineret toppe er synlige. Dette er mest sandsynligt på grund af den interne urenhed af cellelysater og det faktum, at DMB ikke kun reagerer med sialic syre arter, men også med andre α-keto syrer til stede i cellelysater, herunder pyruvat, succinat, og α-ketoglutarat26. Tilstedeværelsen af små mængder af sialic syre forsynet med O-acetyl ændringer, der ikke har været kløvet af eddikesyre hydrolyse kan også blive diskuteret som begrundelse for disse udefinerede toppe23. Kromatogrammer fra mængden ubehandlede celler er sammenlignet med kromatogrammer fra celler, der er tidligere blevet behandlet med ManNAc eller dets analoger. Som vist her, fører behandling med ManNAc ofte til en næsten hele nedbrydning af Neu5Gc på cellens overflade. I kromatogrammer af mængden celler behandles med Neu5Prop eller Neu5But, toppe er synlige, vises ikke i kromatogrammer af ubehandlede celler. Disse toppe (for ManNProp behandlede celler på ca 19 min eluering tid og for ManNBut behandlede celler på 42 min) angiver udseendet af de tilsvarende ikke-naturlige sialic syre, Neu5Prop og Neu5Gc. Som beskrevet i afsnit 8.3 i protokollen, kan HPLC kromatogrammer analyseres med henblik på at kvantificere mængder af de forskellige sialic syre arter i cellelysater.

Det faktum, at forskellige HPLC fastholdelse toppe svarer til visse sialic syre arter blev kontrolleret via massespektrometri. Repræsentant ESI-MS data fra indsamlede HPLC toppene af interesse er afbildet i figur 4: spektret af de indsamlede DMB-Neu5Ac fastholdelse peak i øverste venstre panel, DMB-Neu5Gc i øvre højre panel, og de to ikke-naturlige sialic syre arter, DMB-Neu5Prop og DMB-Neu5But i de lavere venstre og højre paneler. Reaktion med DMB fører til en stigning i 116.2 Da, i forhold til arternes sialic syre, der ikke er mærket med dette farvestof molekylvægt. I massespektre, når vise positiv masse/ladning forholdet mellem de injicerede prøver mellem 300 og 700, er adskillige toppe synlige. Dette skyldes at addukt dannelsen af respekterede DMB-mærket sonden. Udover protonated ion [M + H]+, natrium adukter [M + Na]+ og [M + 2Na-H]+ vises. Som acetonitril (ACN) er til stede under LC analyse, det kan findes som en adduct i de massespektre (vist for DMB-Neu5Gc, figur 4: øverste højre panel). På grund af fragmentering skyldes collisional dekompensation aktiveringer genereret i regionen electronspray transport mellem kapillær og den første hulske, dehydreret sialic syre arter [M + H]+-H2O kan også observeres (vist for DMB-Neu5Ac, figur 4: øverste venstre panel)23,27. I opsætningen LC eluerer DMB-Neu5Gc kort efter den ureageret eller delvis monomers DMB-arter. Derfor kan indsamles DMB-Neu5Gc sonden indeholde urenheder forårsaget af disse reaktion mellemprodukter. Dette tjener som en forklaring til udseendet af udefineret toppe i masse spektrum af DMB-Neu5Gc (figur 4: øverste højre panel).

Behandling af Kelly neuroblastoma celler med ManNProp eller ManNBut fører til nedsat udtryk af polysialic syre på NCAM, som vist med Western blot analyse af cellemembranen fra mængden celler (figur 5). Polysialic syre vises normalt som en smear gør at dens heterogenitet i størrelse og beregning af (≈ 200 kDa). Behandling med ManNAc analoger fører til en reduktion af polysialic syre på celler overflade: jo længere den alifatiske N-acyl sidekæde, jo stærkere reduktion af28.

Figure 1
Figur 1: Det generelle princip om MGE med N-acyl modificeret mannosamines. Efter behandling med N-acyl modificeret mannosamines, disse ManNAc-analoger er unidirectionally metaboliseret (intracellulære metabolisme) til den tilsvarende ikke-naturlige sialic syre. Disse er transporteret til Golgi, overføres til de respektive oligosaccharid acceptor ved sialyltransferases og udtrykkes på celleoverfladen som sialosides (her, et glykoprotein). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative kromatogrammer af DMB-mærket sialic syre standarder. DMB-mærket Neu5Ac (øverste panel) og Neu5Gc (nederste panel) blev analyseret ved HPLC. Fastholdelse gange (stiplet linje) og peak områder af begge sialic syre blev fastsat efter indsprøjtning 10 ng af de respekterede DMB-mærket arter i HPLC-systemet. I de heri viste repræsentative kromatogrammer, DMB-Neu5Gc elueret efter ca en 8 min retentionstid og DMB-Neu5Ac på 11 min, henholdsvis. Adskillige mindre toppe i kromatogrammet vises normalt mellem 2-6 min, der repræsenterer ureageret DMB og reaktion mellemprodukter. En lille brøkdel af DMB-mærket Neu5Ac vises som en mindre urenhed i DMB-Neu5Gc standard (nederste panel). Dette tal er ændret fra reference22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: karakterisering af membran-bundet sialic syre af DMB-HPLC. Celler var kulturperler i fravær (ubehandlet, øverste panel) eller tilstedeværelse med 5 mM ManNAc (andet panel fra toppen), ManNProp (tredje panel fra toppen), eller ManNBut (nederste panel), henholdsvis i 7 dage. Mediet blev ændret hver 24 h. celler blev høstet og membran fraktioner var forberedt, mærket med DMB og analyseret ved HPLC. Ved sammenligning med kromatogrammer af DMB-mærket sialic syre standarder (figur 2), var toppe på retentionstider mellem 8-9 min identificeret som DMB-Neu5Gc og toppe mellem 10-11 min som DMB-Neu5Ac. I forhold til toppene fra indsprøjte DMB-mærket sialic syre standarder, Vis kromatogrammer fra cellelysater yderligere, udefineret toppe. Dette er på grund af den interne urenhed af sonderne og det faktum, at DMB kan reagere med sialic syre til stede i cellelysater, men også med andre α-keto syrer til stede i cellelysater, herunder pyruvat, succinat, og α-ketoglutarat. Toppe, der kun vises i kromatogrammer af prøver fra celler dyrkes i nærværelse af N-acyl modificerede mannosamine analoger angiver den tilsvarende DMB-mærket ikke-naturlige sialic syre. Dette tal er ændret fra reference22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Mass spektre af DMB-mærket sialic syre arter fundet i cellelysater. HPLC fastholdelse toppene af interesse (Se figur 3) blev indsamlet og efterfølgende analyseres af ESI-MS. 20 µL af de indsamlede tilbageholdelser toppe blev sprøjtet ind i LC-MSD systemet. Reaktion med DMB fører til en stigning i 116.2 Da i forhold til den tilsvarende ureageret sialic syre arter molekylvægt. Positiv masse/ladning forholdet spectrograms fra forskellige sialic syre arter er afbildet (DMB-Neu5Ac: øverste venstre panel, DMB-Neu5Gc: øverste højre panel, DMB-Neu5Prop: nederste venstre panel, DMB-Neu5But: nederste højre panel). Grund til at addukt dannelsen er adskillige toppe synlige. Udover protonated ion [M + H]+, natrium adukter [M + Na]+ og [M + 2Na-H]+ vises. Acetonitril, som er til stede under LC analyse, findes også som en adduct (øverste højre panel). Dehydreret DMB-Neu5Ac, der oprettes ved opsplitning i instrument [M + H]+-H2O kan observeres (øverste venstre panel). Indsamlede DMB-Neu5Gc sonden kan indeholde urenheder forårsaget af ureageret DMB, samt reaktion mellemprodukter set som yderligere udefineret toppe (øverste højre panel). ACN, acetonitril; Hansen, brint; Na, natrium. Dette tal er ændret fra reference22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: analyse af polysialylation af NCAM. Kelly neuroblastoma celler blev kulturperler i fravær eller tilstedeværelse af 5 mM ManNAc, ManNProp eller ManNBut i 7 dage. Celler er høstet og proteiner var adskilt på 8% SDS-acrylamid geler og analyseres af vestlige skamplet ved hjælp af monoklonale anti-polySia antistof 735. Bemærk, at polySia vises som en smøre på grund af dens uensartethed i antallet af Sia, hvilket resulterer i forskellige størrelser og gebyrer af polySia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hvis de kemisk syntetiseret ManNAc derivater, ManNProp og ManNBut er analyseret via massespektrometri, skal kun den korrekte masse peak for begge enheder identificeres. Produkterne kan derfor antages for at have en renhed på over 99%. Små mængder af Neu5Gc, som normalt ikke findes i menneskets celler29, registreres i membran brøkdele af de lysed celler. Dette sker sandsynligvis gennem en bjærgning vej, der rekrutterer Neu5Gc fra fostrets bovint serum sialoglycoconjugates i medierne30. Behandling med den naturlige forløber for sialic syre biosyntesen, ManNAc, sænker drastisk udtryk for Neu5Gc epitop på cellens overflade.

Anvendelse af modificerede mannosamines er negligibly giftige for alle celler undersøges hidtil. Celler acceptere øget millimolar sukker koncentrationer inden for det medium, som er nødvendig, da der er ingen specifikke transportvirksomheder for N- acylmannosamines. Det er blevet påvist, at signaltransduktionsveje er aktiveret på begæring af N- acylmannosamines, som kan påvirke celle vækst eller differentiering31,32. Hvorvidt dette skyldes en ændret sialylation mønster eller afspejler direkte virkninger på den modificerede sialylation er ikke kendt hidtil. Vækst af celler i overværelse af C2-modificerede ManNAc-analoger, ManNProp eller ManNBut resulterer i udtryk af ikke-naturlige sialic syre arter transporterer den tilsvarende N-acyl substitution. Den metaboliske effektivitet af to testet N-acyl modificerede mannosamines varierer. Behandling med ManNProp fører som regel til udtryk for de tilsvarende Neu5Prop på cellens overflade og en nedsat udtryk Neu5Ac såvel som Neu5Gc. Andre N-acyl modificerede mannosamine analoger, som N- cyclopropylcarbamyl mannosamine, tendens til at have en endnu højere metaboliske effektivitet22.

Tidligere undersøgelser viste, at sialic prækursorer forstyrre polysialylation. Polysialic syrer udtrykkes næsten udelukkende på NCAM. Interessant, kan NCAM være polysialylated af to særskilte polysialyltransferases udtrykt i Golgi (ST8SiaII og ST8SiaIV). Det viste sig at ManNProp, ManNBut og andre N-acyl-modificerede mannosamines blande sig med polysialylation, og at det er overvejende på grund af interaktion med ST8SiaII14. Denne sialyltransferase er kommet til udtryk under udvikling og er vigtige for udviklingen af hjernen. Interessant nok også mange tumorer fra neuronal oprindelse re express ST8SiaII øge deres malignitet og yderligere gør dem målbart fra immunsystemet33. Derimod fører anvendelsen af ManNAc til en stigning på polySia, da det fører til en stigning af CMP-Neu5Ac, som er det naturlige substratet i begge polysialyltransferases.

MGE er en unik metode at indføre roman sialic syre på proteiner af interesse (f.eks. erythropoietin) og at modulere derved sin funktion. Det kan desuden bruges til at modulere celle overflade glykosylering, som kan være af interesse for mange sygdomme, såsom kræft, da mange cancerceller forsøge at undslippe immunsystemet af udtrykker høje niveauer af sialic syre. Metoden præsenteres her tillader: først, at udføre glycoengineering ved hjælp af cellekulturer, og for det andet, at analysere manipuleret glycans at bevise vellykket glycoengineering. Metoden er meget robust og indtil nu, ingen faldgruber er rapporteret; derimod er metoden blevet udvidet for at indføre kemisk aktive grupper for at udføre Klik-kemi på celler13.

Her præsenterer vi to ManNAc analoger med alifatiske N-acyl side kæde ændringer, der er forholdsvis enkle at syntetisere, selv af laboratorier med mindre udstyr og mindre erfaring i kemisk syntese. Grupper, der er mere fortrolige med organisk kemi kan syntetisere andre ManNAc analoger med mere komplekse strukturer og bruge disse til MGE, herunder den såkaldte 'bioorthogonal' analoger, som kan udnyttes, for eksempel, for at visualisere sialylated GLYCOCONJUGATES. Der er review artikler giver et overblik over N-acetyl-mannosamine derivater, der er blevet syntetiseret til dato13,34. N- azidoacetyl mannosamine (ManNAz), et stof, der bruges ofte til at visualisere sialylated glycans, er kommercielt tilgængelige. På grund af den lave membran permeabilitet af ManNAc analoger, kan det være en fordel at bruge derivater af disse sukkerarter med beskyttede hydroxylgrupper, fx peracetylated ManNAc analoger. Efter indtastning af cytoplasma, er at beskytte grupper kløvet af cytoplasmatisk esteraser, dermed frigøre aktive monosakkarider35,36,37. Dog udsætte peracetylated ManNAc analoger højere cytotoksicitet i forhold til de tilsvarende ubeskyttede derivater.

I dette manuskript valgte vi udødeliggjort neuroblastoma celler til vores eksperimenter med MGE. Generelt, MGE (især med ManNProp og ManNBut) kan anvendes i en bred vifte af cellelinjer, herunder udødeliggjort cellelinjer (Se Wratil et al. 13 for eksempler) og primærelementer38,39. Derudover var MGE med succes udnyttet til at ændre sialylation i vivo i C. elegans40, zebrafisk17,41, mus19,20,42og rotte 43 , 44. behandlingstiden og koncentrationen af ManNAc analoger i MGE eksperimenter kan varieres for at påvirke den metaboliske effektiviteten af denne metode. Fra vores erfaring svarer længere behandling og højere koncentrationer med bedre erstatning af naturligt forekommende sialic syre arter i glycoconjugates af ændrede Neu5R. Hvis meget høje koncentrationer af ManNAc derivater bruges, cytotoksicitet af behandlingen bør evalueres, fx af MTT assay eller resazurin reduktion assay.

I dette manuskript foreslår vi at bruge ultra-sonikering for celle homogenisering. Andre cell lysis metoder blev testet i vores laboratorium, herunder douncing på is (ca. 250 slag) og fransk presse forstyrrelser (10.000 psi, 4 passager), med sammenlignelige resultater med hensyn til mængden af sialic syre fundet i prøverne. Fordelen ved ultra-lyd homogenisering er, at det kræver lidt tid og kræver ingen tilføjelsen af DNAase til prøver før lysering.

Vi fokuserer vores analyse på membran fraktioner i cellelysater, fordi vi ønskede at vise ændringer i sialylation af membran bundet glycoconjugates. Sialic syre derivater og deres koncentrationer kan også måles i cytosol af cellerne, efter membran brøkdel har været adskilt af højhastighedstog centrifugering, ved hjælp af samme metode som beskrevet ovenfor. Koncentrationerne af sialic syre i cytosol er dog op til 100 x lavere sammenlignet med sialic syre udtryk på cellemembranen7. Således større mængder af celler er nødvendige for at generere pålidelige resultater. Puljen af cytosole, aktiveret CMP-sialic syre kan måles indirekte ved at pre behandle cytosole fraktioner i cellelysater med natriumborhydrid forud for hydrolyse7,45. For at hydrolysere sialic syre i glycoconjugates og sialic syre med hydroxyl ændringer, blev cellerne inkuberes med 1 M TFA. Andre sure opløsninger kan anvendes til hydrolyse, så godt, f.eks., 2 M propionsyre, 2 M eddikesyre eller 1 M HCl.

Et muligt forekommende spørgsmål under HPLC-analysen er at toppe af interesse er overlappende med udefineret toppe. Dette er især problematisk, når mængden af sialic syre i en prøve skal beregnes af arealet under kurven for en bestemt peak. For at adskille et højdepunkt på interesse fra en udefineret peak, acetonitril koncentration i HPLC opløsningsmiddel kan justeres (± 3%). Vi foreslår at bruge støt opløsningsmiddel koncentrationer til HPLC-analysen, giver fordelen at udarbejde opløsningsmiddel blandingen før kromatografi. Derfor vores metode kræver kun én HPLC pumpe og er muligt for en lang række forskellige HPLC systemer. Hvis mere end én pumpe er tilgængelige i HPLC system, en isocratic gradient med stigende koncentrationer af acetonitril kan anvendes, fx 4-9% i 35 min.45. Ved hjælp af denne teknik, vil retentionstiden for visse HPLC toppe blive ændret betydeligt. Denne strategi kan også bidrage til at opnå bedre separation af overlappende toppe. Matrix assisted laser desorption ionisering massespektrometri (MALDI-MS) blev oprettet for at kontrollere udtryk for modificeret sialic syre arter til celle overflade45, og dermed tjener som en pendant til de ESI-MS metoden præsenteres her .

På grund af hydrofiliciteten af ManNAc analoger og manglen på specifikke transportvirksomheder for udnyttelsen af disse derivater46, er høje koncentrationer nødvendige i MGE eksperimenter med disse forbindelser. Derfor, i op-skaleret eksperimenter og navnlig i vivo forsøg store mængder af de respektive ManNAc analoger er nødvendige, viser en eventuel begrænsning af denne teknik. På den anden side, afhængigt af de cellelinjer, der anvendes, er en visse minimale antal behandlede celler nødvendige for at opnå pålidelige resultater i HPLC-analysen. Fra vores erfaring er et minimum af omkring 100.000 vedhængende celler eller 150.000 suspension celler (1-2 brønde for en 96-brønd plade med sammenflydende celler) tilstrækkelig. Dette kan blive en flaskehals, hvis analysen er at blive nedprioriteret, for eksempel i screening tilgange.

Med de metoder, der præsenteres i dette håndskrift, kan påvises sialic syre og derivater heraf i cellelysater. Men struktur og sammensætning af glycoconjugates i celler behandles med ManNAc derivater ikke vurderes med de heri beskrevne teknik. Løse strukturen af glycoconjugates, e.g.,N- og O- glycans, generelt kræver større erfaring og en glycomics facilitet47. Til vores viden, hidtil er ingen data tilgængelige på forskellige strukturen af glycoconjugates fra celler, der er blevet behandlet med ManNAc analoger.

Western blot analyse af polysialic syre er en meget hurtig og nem metode. Data, som fremkommer ved denne metode er dog ikke kvantitative, da påvisning bruger antistoffer og chemiluminescence. Derfor er brugen af HPLC metoder en fordel i forhold til Western blotting. Vi foreslår ikke desto mindre, ved hjælp af immunoblotting metoden, da det er let at anvende og kendte til at arbejde meget pålideligt.

Udtryk for sialic syre på cellens overflade kan ændres også efter andre metoder end MGE. Som beskrevet ovenfor, kan celler behandles med sialidase, et enzym, der kløver sialic syre rester fra glycoconjugates i en relativt uspecifik måde. Sialidase behandling inducerer derfor hyposialylation i behandlede celler. Sialidase behandling er desværre en ret begrænset teknik, som det er cytotoksiske, ikke muligt for lang tid behandling og ikke gældende i vivo forsøg. En anden teknik til at fremkalde hyposialylation i celler er ved hjælp af hæmmere af sialic syre biosyntesen. En bred vifte af hæmmere er tilgængelige, enten målrette det vigtigste enzym af sialic syre biosyntesen, UDP -N- acetylglukosamin-2-epimerase /N- acetylmannosamine-kinase (GNE/MNK) eller en gruppe af sialyltransferases6, 7,8,48. En af disse forbindelser, en C3-fluorholdige sialic syre analog, blev vist at sænke udtryk for sialic syre i levende mus49. Dyr behandlet med dette stof, dog viste lever værdiforringelse, irreversibel nyre dysfunktion og manglende trivsel49. Disse resultater bekræfter Neu5Ac afgørende rolle i lever og nyre funktion og yderligere angiver grænserne for sialylation hæmmere for i vivo eksperimenter. En tredje metode til at generere celler med ændrede celle overflade sialylation er ved at forstyrre udtryk for enzymer, der er afgørende for sialic syre biosyntesen. En knock-down af GNE/MNK i udødeliggjort celler, for eksempel, var vist at gengive disse celler hyposialylated 9. Mulighed for at relativt let knock-in og - ud gener i cellulære og i vivo ved hjælp af romanen og godt anerkendte CRISPR-Cas9 teknik kan føre til nye opdagelser vedrørende sialic syre biosyntese og cellens overflade sialylation.

Fordelen ved MGE i forhold til de teknikker, der beskrives her, er, at det er let at anvende og kan tilpasses til et utal af forskellige eksperimenter, fra in vitro- forsøg at celle baseret assays og i vivo eksperimenter. En alternativ metode til måling af udtryk og koncentrationer af forskellige sialic syre arter i celle prøver er af højtydende anion-exchange kromatografi (HPAEC) med pulserende elektrokemisk detektion50. Ved hjælp af denne metode, udtryk for sialic syre måles direkte og ikke efter mærkning med et fluorescerende farvestof. Fordelen ved denne metode er, at det kan udnyttes også til at analysere monosakkarider end sialic syre og derivater heraf i celle - og protein-prøver. Desværre, er følsomheden af HPAEC lavere i forhold til fluorometriske påvisning af DMB-sialic syre. HPAEC er således begrænset til eksperimenter med tilgængeligheden af stor stikprøve beløb51.

De heri beskrevne metoder kan bruges til at afsløre ukendt Karakteristik af glycoconjugates. Et væld af eksempler på brug af MGE at undersøge sialic syre afhængige interaktioner allerede findes13, viser gennemførligheden af denne teknik i forbindelse med en lang række eksperimentelle opsætninger.

I dag, bruges MGE med N- acetylmannosamines primært af forskere inden for glycobiology. Vi håber, at denne teknik vil blive anerkendt af et bredere publikum som et alsidigt værktøj til at ændre glycoconjugates. Andre felter, herunder immunologi, virologi, neurologi eller onkologiske vil gavne ved at tilpasse denne teknik til deres egne formål. Cross-over forskningen kan aktiverer opdagelsen af endnu ukendte områder, og derfor give en bedre forståelse af sundhed og sygdom. I tidlige undersøgelser, for eksempel, blev denne teknik brugt til at producere glykoproteiner med modificerede glykosylering, som senere tjener til i vivo vaccination. I visse tilfælde, behandling med sådanne glycoengineered vacciner føre til produktion af antistoffer, der udsættes avancerede aviditet og toksicitet for de respektive mål52,53. Andre har med held brugt MGE for at udvikle en model for målrettede tumor terapi i mus54. En anden undersøgelse viste, at systemisk i vivo injektion af ManNProp fremmes nerve regenerering55. I forbindelse med polySia, blev det vist, at faldende udtryk for denne epitop i neuroblastoma celler af de metoder, der præsenteres i dette manuskript, øger følsomheden af disse tumorcellerne for stråling eller behandling med anticancermedicin56.

Mængder af sialic syre målt i prøver kan variere afhængigt af metoden bruges til at fjerne de behandlede celler. I dette manuskript, blev inkubation med trypsin brugt Adskil celler. Hvis andre teknikker skal anvendes, som skrabning celler eller lang tid behandling med PBS + EDTA, kan mængder af sialic syre måles i prøverne afvige. Selv tilpasse inkubationstiden med trypsin kan have en indvirkning på sialic syre koncentrationer målt senere. Fra vores erfaring, virkningen af metoden celle udstationering på sialic syre målte mængder er under 15%, men hvis resultater er at være normaliseret og sammenlignet, dette kan blive en vigtig flaskehals. Derudover kan metoden for lysering af celler påvirke resultatet af HPLC-analysen. Dermed, vi anbefale læseren at standardisere celle detachment og lysis i deres eksperimenter.

For at opnå separation af membran-fraktionen i cellelysater, brugte vi centrifugering for 2 h på 20.000 x g og 4 ° C (afsnit 5.1). Andre centrifugering protokoller kan påvirke adskillelse og derfor mængder af sialic syre fundet i prøverne. En kritisk sammensatte inden denne protokol er DMB, fordi det er meget følsomme over for lys og nedbryder over tid. Her anbefalede vi at små alikvoter af DMB-løsning og butik det som lagre på - 20 ° C, beskyttet mod lys (afsnit 1.6.1). Denne måde DMB-løsning kan opbevares i flere uger. Hvis resultaterne fra DMB-HPLC-analysen viser faldende signaler for sialic syre arter eller øge signaler inden for de første 6 min af HPLC måling, bør der repræsenterer DMB og dens reaktionsprodukter, nye DMB-løsning være forberedt. Ikke at fryse og genbrug DMB-løsning efter optøning det. Efter DMB mærkning, bør alle prøverne analyseres straks. Hvis større antal prøver (> 10) skal analyseres, bør disse prøver opdelt i mindre badges og gradvist mærket med DMB. Begge mærkning reaktion tidspunkter såvel som til DMB-mærket sonder bør beskyttes mod lys på alle. Efter eluering, bør DMB-mærket sialic syre arter analyseres straks af ESI-MS. direkte kobling af HPLC med ESI-MS systemet (i en LC-ESI-MS setup) er ikke nødvendig, men kan være en fordel at opnå højere kvalitet af den massespektrometri analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker L. D. Nguyen for korrekturlæsning manuskriptet og for frugtbare drøftelser. Derudover takker vi J. Dernedde og H. G. Nguyen for at hjælpe os forberede video shoot. De fleste scener af videoen blev skudt i laboratorierne i R. Tauber. Vi takker også Max Planck instituttet for kolloider og grænseflader, og for at give os fri adgang til deres massespektrometri facilitet. RH blev støttet af DFG (ProMoAge).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Agilent
ESI-MSD-System Agilent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. , 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).

Tags

Bioteknologi sag 129 Sialic syre polysialic syre højtryksvæskekromatografi cellekultur metaboliske glycoengineering metaboliske oligosaccharid engineering
Metaboliske Glycoengineering Sialic syre ved hjælp af <em>N</em>-acyl-ændret Mannosamines
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wratil, P. R., Horstkorte, R.… More

Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter