Summary
Biz başarıyla standart telomer tekrar amplifikasyon Protokolü (Trap) tahlil damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonları istihdam edilecek dönüştürülür. Bu yeni tahlil, ddTRAP denilen, daha hassas ve niceliksel, daha iyi algılama ve çeşitli insan hücreleri içinde telomeraz aktivite istatistiksel analiz için izin.
Abstract
Telomer tekrar amplifikasyon Protokolü (TRAP), verilen bir örnek içinde telomeraz etkinliğini algılamak için en yaygın olarak kullanılan tahlil olduğunu. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı yöntem en hücre Lysates enzim aktivitesinin sağlam ölçümleri için izin verir. Floresan etiketli astar ile jel tabanlı TRAP örnek verimi sınırlar ve numuneler farklılıkları tespit yeteneği enzim aktivitesinde iki kat veya daha büyük değişiklikler ile sınırlıdır. Damlacık dijital tuzak, ddtrap, geleneksel Trap tahlil değiştirilmiş bir son derece hassas bir yaklaşımdır, kullanıcının çalıştırmak başına 96 örnekleri üzerinde sağlam bir analiz yapmak ve DNA mutlak kantifikasyon elde sağlayan (telomeraz uzatma ürünleri ) her PCR içinde giriş. Bu nedenle, yeni geliştirilen ddTRAP tahlil geleneksel jel tabanlı TRAP tahlil sınırlamaları üstesinden gelir ve laboratuar ve klinik ayarları içinde telomeraz etkinliğini ölçmek için daha verimli, doğru ve nicel bir yaklaşım sağlar.
Introduction
Telomerler Doğrusal kromozomların ucunda Dinamik DNA-protein kompleksler. İnsan telomerleri bir dizi oluşur 5 '-TTAGGGn hexameric tekrarlar arasında uzunluğu değişmektedir 12 – 15 kiloüsler (KB) Doğum1. İnsan telomeraz, telomerleri tutan Ribonükleoprotein enzim, ilk hela hücresi endoglikozidazları (kanser hücresi hattı)2tespit edildi. Birlikte, telomerler ve telomeraz genom koruması, gen düzenlemesi ve kanser hücresi ölümsüzlüğü3,4,5,6gibi biyolojik süreçlerin bir spektrumunda önemli bir rol oynamaktadır.
İnsan telomeraz öncelikle iki anahtar bileşenden oluşur, yani telomeraz ters transkriptaz ve telomeraz RNA (hTERT ve hterc, sırasıyla). Protein subunit, hTERT, telomeraz enziminin katalytik olarak aktif ters transcriptaz bileşenidir. RNA şablonu olan hTERC, telomerleri uzatmak ve/veya sürdürmek için şablonla telomeraz sağlar. Çoğu insan somatik dokularda algılanamayan telomeraz aktivitesi vardır. DNA polimeraz, telomeraz eksikliği ile birlikte DNA 'nın gecikme ipliğinin sonunu uzatmak için yetersizlik hücresel bölme her turda sonra telomerlerin ilerici kısaltma yol açar. Bu olayların en somatik hücrelerde kısaltılması telomer neden onlar bir kritik kısaltılmış uzunluğa ulaşıncaya kadar, bu nedenle hücreler çoğaltarak bir devlet girin. Bir hücrenin bölünebilir maksimum sayısı onun telomer uzunluğu tarafından dikte edilir ve bu blok devam hücre bölünmesi için onkatıltı ilerlemesi önlemek için düşünülmektedir7. Kanser hücreleri telomer kaynaklı çoğaltıcı yaşlanma aşmak ve telomerler korumak için telomeraz kullanarak Proliferasyona devam edebiliyoruz. Kanserlerin yaklaşık% 90 ' i telomeraz etkinleþtirmek, hem kanser tespiti hem de tedavisinde telomeraz aktivitesini eleştirel olarak önemli hale getirmektedir.
1990 ' lardaki TRAP tahlili 'nin geliştirilmesi, telomeraz enziminin gerekli bileşenlerinin tanımlanması ve hem normal hem de kanserli geniş bir hücre ve dokularda telomeraz ölçümü için de yararlı oldu. Orijinal jel tabanlı PCR tahlil telomeraz etkinliğini algılamak için radyoaktif etiketli DNA substratlar kullandı. 2006 yılında, tahlil floresan etiketli substratlar kullanarak radyoaktif olmayan bir forma adapte edildi8,9. Floresan etiketli substratlar kullanarak, kullanıcılar doğru uyarılma dalga boyu açığa tarafından bir jel bantları olarak telomeraz uzatma ürünleri görselleştirmek başardık. Trap tahlil ve ham hücre endoglikozidazları içinde telomeraz etkinliğini algılamak için yeteneğini hassasiyeti bu tahlil telomeraz aktivite algılama için en yaygın kullanılan yöntemi yaptı. Ancak, TRAP tahlil sınırlamaları vardır. Tahlil jel tabanlı, zor orta yüksek verimlilik çalışmaları için gerekli çoğaltır gerçekleştirmek için yapma, ve böylece, uygun istatistiksel analiz nadiren elde edilir. Ayrıca, jel bazlı tahlil, numuneler arasında telomeraz aktivitesinde iki kat farklılıkları daha az tespit edilememesi nedeniyle güvenilir bir şekilde ölçmek zordur. Bu iki sınırlamaların üstesinden gelmek, hasta örneklerinde veya ilaç tasarım çalışmalarında telomeraz aktivitesinin algılanması için klinik veya endüstri ayarlarına geçmek için TRAP gibi enzimatik aktivite açısından önemlidir.
Dijital PCR başlangıçta bir doğrusal ve dijital tahlil10içine PCR üstel ve analog doğası dönüştürmek için bir araç olarak 1999 yılında geliştirilmiştir. Droplet dijital PCR (ddPCR) orijinal dijital PCR metodolojisi en son yenilik. Damlacık dijital PCR, güvenilir ve eşit boyutta damlacıklar oluşturmak için gelişmiş mikrofluidikler ve yağ-in-su emülsiyon Kimya gelişiyle ilgili olarak geldi. Jel bazlı ve hatta nicel PCR (qPCR) ' den farklı olarak, ddPCR giriş malzemesinin mutlak ölçülmesini üretir. DdPCR anahtarı nesil olduğunu ~ 20.000 bireysel reaksiyonlar örnekleri damlacıklar bölümleme tarafından. Son nokta PCR aşağıdaki, damlacık okuyucu her damlacık bir akış-cytometer benzeri moda, sayma, boyutlandırma, ve (yani, yok veya her damlalar içinde PCR amplikonlar varlığı) floresans varlığı veya yokluğu kayıt tarar. Sonra, Poisson dağıtımı kullanarak, giriş molekülleri damlacıklar toplam sayısına pozitif damlacıklar oranına göre tahmin edilir. Bu sayı, her PCR 'de giriş moleküllerinin sayısını tahmin eder. Ayrıca, ddPCR, kullanıcının birçok numuneyi çalıştırmasına izin veren ve uygun istatistiksel analizler için biyolojik ve teknik çoğaltır gerçekleştiren bir 96-Well plaka üzerinde gerçekleştirilir ve analiz edilir. Sonuç olarak, biz ddtrap tahlil11geliştirmek için tuzak tahlil ile ddpcr güçlü kantifikasyon ve orta verim doğası kombine ettik. Bu tahlil, kullanıcıların biyolojik örneklerden mutlak telomeraz etkinliğini incelemek ve sağlamlaştırmak için tasarlanmıştır11,12. DdTRAP hassasiyeti, tek hücreli ölçümler dahil olmak üzere sınırlı ve değerli örneklerden telomeraz aktivitesinin ölçülmesini sağlar. Ayrıca, kullanıcılar aynı zamanda telomeraz manipülasyonları ve/veya ilaçlar (~ 50% farklılıklar) iki kat değişikliklerden daha az mutlak kantifikasyon etkileri araştırabilirsiniz. DdTRAP modern laboratuar deneyleri ve klinik ayarları dijital ve daha yüksek verim doğası içine TRAP tahlil doğal evriminin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tampon hazırlama ve depolama
- Hazırlamak 50 mL 1x stok RNase-/DNase-ücretsiz NP-40 liziz tampon (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM MgCl2, 1 mm ethylenediaminetetraasetic ASIT (EDTA), 1% [Vol/Vol] NP-40, 10% [Vol/Vol] gliserol, 150 mm NaCl, 5 mm β-mercaptoetanol, ve 0,1 mm 4- benzenesulfonil fluorid hidroklorür (AEBSF)). Bu tampon, gelecekteki kullanım için-20 °C ' de saklanır. Hücrelerin optimum liziz elde etmek için dondurmak/çözülme döngüleri kaçının.
- Hazırlamak 50 mL 10X stok RNase-/DNase-serbest tuzak uzatma tampon (200 mM Tris-HCl [pH 8,0], 15 mM MgCl2, 630 mm kcl, 0,5% [Vol/Vol] Tween 20, ve 10 mm etilen glikol-bis (β-aminoetil eter)-N, N, n ′, n′-Tetraacetic ASIT (egta)). Bu tampon, 1 ml 'lik plakaya 'a aktarılabilir ve gelecekteki kullanım için-20 °c ' de saklanır.
2. hücre lizis
-
Hücrelerin hazırlanması
- NP-40 liziz tamponunun dondurulmuş bir ayini çözün. Bir kez çözülür, buz üzerinde liziz tampon yerleştirin. 0,2 mM son konsantrasyon ulaşmak için NP-40 lizis tampona phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF proteaz inhibitörü) ekleyin.
Not: Bu hücrelerin parçalanması hemen önce yapılmalıdır. - Kuru bir hücre Pellet sağlamak için toplanan hücre pelletinden herhangi bir aşırı sıvı çıkarın. Hücre peletleri, taze toplanan veya daha önce dondurulmuş olup olmadığını unutmayın (-80 °C veya sıvı N2dondurulmuş flaş), bu çözümler aşağı işlemleri etkileyebilir gibi önceki santrifüjlerden kalan çözümleri içermemelidir.
- Hem telomeraz pozitif hem de telomeraz negatif hücre çizgilerini (BJ fibroblastlar, ıMR-90 veya U2OS) olumlu ve olumsuz kontroller olarak kullanmak için büyütün, toplayın ve dondurur. Yeni kontrol endoglikozidazları assay tahlil reproducibility sağlamak için gerçekleştirilen her zaman kullanın.
Not: Bu telomeraz-negatif hücrelerin büyük bir kültür yetiştirilen ve herhangi bir doku-kültür ile ilgili yapıları kaldırmak için dondurmadan önce, yeniden oluşturulabilir sonuçları sağlamak için hücre hatları uzun vadeli kültürü sırasında tanıtılan olabilir tavsiye edilir negatif denetim örneği. - Hücre peletini buzun üzerine yerleştirin. Hücreler dondurulduysa, buzda kısaca çözülmelerine izin verin.
Not: ddtrap için tipik hücre Pelet boyutları 500.000 ve 1.000.000 hücreleri arasındadır. Gerekirse daha küçük hücreli peleler de kullanılabilir, ancak hücre numarası/ideal bilinen olmalıdır. DdTRAP Ayrıca bir BCA protein tahlil kullanarak protein girişine dayalı yapılabilir (giriş genellikle 1 μg).
- NP-40 liziz tamponunun dondurulmuş bir ayini çözün. Bir kez çözülür, buz üzerinde liziz tampon yerleştirin. 0,2 mM son konsantrasyon ulaşmak için NP-40 lizis tampona phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF proteaz inhibitörü) ekleyin.
-
Hücrelerin lysing
- NP-40 liziz tamponunun hücrelerinde Lyse. Hücre eşdeğerliği korumak 25.000 Cells/μL arabellek. Örneğin, 40 μL NP-40 liziz tampon içinde (1.000.000 hücre içeren) bir Pelet Lyse. Hücreleri açmak için yavaşça yukarı ve aşağı lysate pipet. Kabarcıklar yapmaktan kaçınmaya çalışın.
- Hücrelerin 30 dakika boyunca buzun üzerine girmesine izin verin. hücre enkaz kümeleri şekillendirme önlemek için yavaşça lysate Vortex emin olun. Bu her 10 dakika yapılabilir ve lysate homojenize karışımı tutmak içindir.
- Hücre lysate seyreltmek (25.000 Cells/μL) 1:20 NP-40 liziz tampon, yeni hücre eşdeğerlik yapmak 1.250 Cells/μL. Örneğin, 5 μL hücre lysate 95 μL liziz tamponunu seyreltir.
3. Telomerase uzatma reaksiyonu
- Telomeraz uzatma reaksiyonu için (reaksiyon başına) bir ana karışımı (Tablo 1) hazırlayın.
Not: hücre lizis sırasında uzatma reaksiyon ana karışımı hazırlamak ve buz üzerinde saklamak için en iyisidir.- Her PCR tüpüne pipet 48 μL uzatma ana karışımı.
- Uzatma reaksiyonu için 2 μL seyreltilmiş (1.250 Cells/μL) lysate ekleyin. Toplam birim şimdi 50 μL 50 Cells/μL son hücre eşdeğerliği ile olmalıdır.
- Telomeraz uzatma reaksiyonu gerçekleştirin (Tablo 2).
- Telomeraz uzatma ürünlerini 3 – 5 güne kadar 4 °C ' de saklayın; Ancak, ilk 24 h içinde uzatma ürünleri kullanmak için optimum olduğunu.
4. damlacık dijital PCR kurulum
- DdTRAP (reaksiyon başına) için bir ana karışımı (Tablo 3) hazırlayın.
Not: reaktifler oda sıcaklığında olduğunda, onları veya ana karışımı buzun üzerine koymayın. Karışımı buzun üzerine yerleştirmek viskozitesi artırabilir ve kötü damlacık oluşumuna yol açabilir. Ddpcr süper karışımı DNA polimeraz sıcak bir başlangıç ve oda sıcaklığında kararlı olmalıdır. DdPCR supermix-20 °C ' den itibaren ilk çözülme sonrasında 4 °C ' de depolanabilir.- Pipet 19,8 her PCR tüpüne ddPCR ana karışımı μL.
- Her tüpe uzatma reaksiyonu 2,2 μL ekleyin. Toplam birimin Şimdi 22 μL olması gerektiğini unutmayın.
Not: bir ddTRAP için gereken toplam örnek miktarı 20 μL 'dir (100 hücrelerinin hücre eşdeğerliği). Ekstra Hacim, pipet hatası veya numune kaybı için bir önlemdir.
- Damlacık nesil kartuşunu ayarlayın.
Not: kartuş, etiketli kuyuların üç farklı sütununu içerir.- Adım 4.1.2 'ye göre hazırlanan reaksiyonda 20 μL yükü, Kartuştaki örnek kuyu (orta kuyu) içine takın. Numuneyi pipetleme yaparken baloncuklar kaçının.
Not: kabarcıklar varsa, bu kabarcıklar çözümün en üstüne gelmek için hafifçe kartuşun tarafına dokunun. - Yük 70 yağ kuyusu (sol iyi) içine damlacık nesil yağ μL.
Not: kirlenme önlemek için, kesinlikle ayrı bir pipet seti ve ddPCR damlacık oluşturma adımları için ipuçları kullanın. Kartuş yükleme sırası önemlidir. Yağ daha ağır ve mikrofluidik odaları dolduracak ve yoksul damlacık oluşumuna yol açacak şekilde yağ yüklemeden önce örnek yüklenmesi gerekir. Çalıştırılabilir numunelerin en az sayısı sekiz ' dir. Herhangi bir boş iyi damlacık jeneratörden damlacık nesil durdurucuya yol açacaktır gibi kartuşun tüm kuyuları örnek ile yüklü olmalıdır. Bir kartuşun içinde sekiz kuyunun tümünü yüklemek için yeterli numune yoksa, kalan kartuşlara 20 μL ddTRAP ana karışımı (adım 4,1) yüklenebilir. - Kartuşun uçlarını kullanarak conta yerine sabitleyin.
Not: contaların eksikliği veya uygunsuz yerleşimi, jeneratörü damlacıklar üreterek engelleyecektir. - Yüklü ve montajlı kartuşu damlacık jeneratörü içine yerleştirin.
Not: kartuş, kartuşun düzgün yerleştirildiği zaman kullanıcıyı bilgilendirecek olan jeneratör içinde bir mıknatıs tarafından tanınır.
- Adım 4.1.2 'ye göre hazırlanan reaksiyonda 20 μL yükü, Kartuştaki örnek kuyu (orta kuyu) içine takın. Numuneyi pipetleme yaparken baloncuklar kaçının.
- Damlacıklar oluşturulduğunda ve döngü tamamlandığında kartuşu çıkarın (~ 60 – 90 s).
- Contayı yavaşça kartuştan çıkarın. Yeni oluşturulan damlacıkları (sağ iyi), çok kanallı pipet kullanarak, 96-Well PCR plakasına takın.
Not: yeni oluşturulan damlacık emülsiyonu için yaklaşık hacim 40 – 43 μL olmalıdır. - Isı mühür plaka ile alüminyum folyo PCR plaka mühürler bir kez tüm örnekleri yüklenir 96-Well plaka amacıyla buharlaşma önlemek için PCR adımları.
- Contayı yavaşça kartuştan çıkarın. Yeni oluşturulan damlacıkları (sağ iyi), çok kanallı pipet kullanarak, 96-Well PCR plakasına takın.
- 96-kuyu plakasını termocyceye yükleyin ve aşağıdaki PCR reaksiyonu (Tablo 4) gerçekleştirin.
Not: reaksiyonları düzgün bir şekilde ısıtabilmek için sıcaklık adımları arasındaki tüm rampa oranları 2,5 °C/s 'ye ayarlanmalıdır.
5. telomeraz uzatma ürünlerinin tespiti
- 96-kuyu plakasını damlacık okuyucuya yükleyin.
Not: plakayı doğru şekilde yönlendirdiğinizden emin olun, böylece a1 örneği tutucu ile eşleşir.- Damlacık okuyucusu ile ilişkili yazılımı açın. Örnek/iyi düzenleyici ekranını açmak için ilk iyi a1 'i çift tıklatın.
- Deneme 'yi tıklayın ve açılır menüden ABS 'i seçin.
Not: deney (yani, mutlak kantifikasyon veya gen kopya numarası assay) kullanılacak tahlil türünü tanımlar. ABS mutlak quantification anlamına gelir. - Seçin QX200 ddPCR Evagreen Supermix doğru algılama yöntemi okuyucu tarafından istihdam edilmesini sağlamak için. Kullanıcı tanımlı ayarları tüm vurgulanan kuyulara kaydetmek için iyi düzenleyici ekranının sağ alt tarafındaki Uygula 'yı tıklayın.
Not: Supermıx , okuyucu tarafından okunacak PCR karışımı ve algılama kimyası türünü tanımlar. - Örnek tanımlamak için yazılımın iyi düzenleyici ekranında hedef tıklayın.
- Hedef açılır menüsünü tıklatarak ve Bilinmeyen, başvuruveya NTC (şablon denetimi yok) seçeneğini belirleyerek örnek türünü tanımlayın.
Not: Bilinmeyen deneysel bir örnek başvuracak, referans bilinen telomeraz aktivitesinin bir denetim örneği olabilir, ve bir NTC kirlilik açısından tahlil geçerliliği belirlenmesi için kritik bir kontrol ve arka plan sinyali. - Örnek ad bölümündeki tüm örnekleri etiketleyin ve vurgulanan kuyuların uygun şekilde düzenlendiğinden emin olmak için Uygula 'ya tıklayın.
- Çalıştır/plaka okumak için Çalıştır ' ı tıklatın. Makineyi, plakanın okunması gereken oryantasyon hakkında bilgilendirmesi istendiğinde, çalışma seçenekleri ekranında sütun veya Satırlar seçin.
6. veri analizi
- Bireysel kuyuları tıklayarak her örnek için kabul edilen damlacıklar sayısını belirleyin. Örnek verileri görüntülemek ve çözümlemek için bireysel kuyuları veya sütun/satır başlıklarını çift tıklatın.
Not: belirli bir numunenin analizine devam edip etmeyeceğini gösteren en önemli kriterler "kabul edilen damlacıklar" sayısıdır. DdTRAP için, 10.000 veya daha fazla kabul edilen damlacıkları olan örnekler daha fazla analiz için geçerlidir. Veriler,. csv tablosu,. jpg görüntüleri, histogramlar vb. gibi birçok formatta kullanıcıya sağlanabilir. Ddpcr verilerinin derinlemesine analizi için kullanılabilen birçok kaynak vardır, bu da dahil olmak üzere svtrap11,13. Bu kaynaklar, daha fazla analiz için11,13, yanlış pozitif ve negatifleri tanımlamak için örnekleri seçmek için11,13 eşikleri seçerek ddtrap verileri analiz etmek için bir kılavuz sunuyor13, ve Genel sorun giderme13. - Örnek çoğaltır ve NTC örneklerini temsil eden kuyuları vurgulayın. Numuneleri NTC veya BJ hücreleri gibi negatif denetim çizgileriyle karşılaştırıldığında analiz edin (adım 2.1.2 ' de yukarıda listelendiği gibi).
- Ekranın sol alt tarafındaki eşikleri ayarlamak için simgeyi tıklatarak örneklerin eşiğini el ile ayarlayın. Her biri için ya da aynı anda birden fazla kuyu için eşikleri ayarlayın (önerilir).
Not: NTC 'de arka plan algılandığında, sinyalin ' normalleştirmek ' için diğer tüm örneklerden çıkarılır ve sadece gerçek pozitif sinyalin analiz edilmesini sağlayabilirsiniz. NTC değerleri genellikle NP-40 liziz tampon sistemi için 0.2 – 1 molekül/μL aralığıdır. Diğer arabellek sistemleri ve bileşenleri (örneğin, CHAPS arabellekleri) test edilmesi gerekir.
- Ekranın sol alt tarafındaki eşikleri ayarlamak için simgeyi tıklatarak örneklerin eşiğini el ile ayarlayın. Her biri için ya da aynı anda birden fazla kuyu için eşikleri ayarlayın (önerilir).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DdTRAP kullanarak, telomeraz aktivite aşağıdaki hücre hatları oluşan bir hücre panelinde ölçüldü (Şekil 1): küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (H2882, H1299, Calu6, H920, A549, ve H2887), küçük hücreli akciğer kanseri (H82 ve SHP77), ve telomeraz-negatif fibroblastlar (BJ). 1.000.000 hücre granül NP-40 tampon içinde lysed ve telomeraz uzatma reaksiyonları biyolojik triplicates yapılmıştır. Ortak ve son derece önerilen negatif denetim "NTC", şablon yok denetimidir. Bu örnek, telomeraz uzatma reaksiyonuna NP-40 liziz tamponu (2 μL) ekleyerek ve uzatma ürünlerini gerçek hücre lysate içeren diğer örneklere özdeş bir şekilde devam ederek üretilir. Bu örnek, kullanıcının telomeraz aktivitesini daha iyi ölçmek için, varsa arka plan sinyalini çıkarmasına olanak sağlar. Bu rakam gösterilmese de, diğer negatif kontrol olarak telomeraz uzatma reaksiyonuna 5 dakika önce 95 ° C 'de lysate 'nin devre dışı ısı mümkündür. Hücre/örnek bolluk bir sorun değilse, bu negatif denetim tercih edilir.
Damlacık emülsiyonunda her bir damlacının floresan yoğunluğunu ölçerek, damlacık okuyucu Poisson dağılımı kullanarak giriş moleküllerinin (moleküller/microliter) konsantrasyonunu tahmin edebildi (Şekil 1a). DdTRAP durumunda, bu giriş molekülleri telomeraz uzatma ürünleridir. Ddtrap tahlil mekanizması aşağıdaki gibidir: telomeraz TS substrat genişletilmiş. Bu genişletilmiş substratlar ddPCR PCR şablonları olarak hareket. PCR-amplifikatörleşmiş substratın ölçülmesini, belirli bir hücre hattında telomeraz enzimatik aktivitesinin bir gösterimi sağlandı. Her damlacık Şekil 1a'da gösterildiği gibi çizilmiş. Bir ddTRAP için eşik ayarı subjektif olabilir; Ancak, uygun negatif denetimler ile Kullanıcı kolayca bunu yapabilirsiniz. Şekil 1a'da gösterilen örnekte, SHP77, H2887 ve NTC için üç biyolojik çoğaltır için bir eşik ayarlandı. Pozitif damlacıklar 6.000 floresan genliği (FA) etrafında floresan yoğunluğu vardı ve üst ve 1.100 FA civarında negatif damlacıklar ayrı açık bir nüfus oluşturdu. Bu nedenle, eşik Bu denemede ~ 2.000 FA ayarlanabilir.
Veriler toplanan ve ihraç edildikten sonra, tüm örnekler arasında hücre başına eşdeğer toplam telomeraz uzatma ürünlerini hesaplamak mümkün oldu (Şekil 1B). Her kuyunda bulunan sinyal mutlak bir konsantrasyondu (moleküller/microliter). Konsantrasyonu 20 (ddPCR kartuşlarına numunenin giriş hacmi) tarafından çarpılarak, Kullanıcı moleküllerin toplam sayısını elde edebilirsiniz. Bu sayı daha sonra bilinen hücre eşdeğer ayrılabilir (ddTRAP bizim performansımızda, biz 100 hücre kullanılır). Bu son değer, yekseninde gösterildiği gibi hücre başına eşdeğer telomeraz uzatma ürünlerinin ünitelerinde yer almaktadır.
Şekil 1: bir akciğer kanseri panelinde Telomerase aktivitesi. (A) SHP77, H2887 ve NTC için damlacık floresan yoğunluğunun (floresan genliği) 1D genliği. Wells SHP77, H2887 ve NTC seçildi ve el ile eşik 2.000 FA ayarlandı. (B) telomeraz aktivitesi, PCR 'nin ardından algılanan nükrenik asitlerin ölçülen konsantrasyonlarından tahmin edildi ve akciğer kanseri hatlarında telomeraz aktivitesini karşılaştırmak için çizilmiş. FA = floresan amplitüd üniteleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Telomeraz aktivitesinin ölçümü, kanser, telomer biyolojisi, yaşlanma, rejeneratif tıp ve yapı bazlı ilaç tasarımı dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, araştırma konularının bir bolluk için önemlidir. Telomeraz RNPs düşük bol, kanser hücrelerinde bile, algılama ve bu enzim zorlu çalışma yapma. Bu yazıda, yeni geliştirilen ddTRAP tahlili için adım adım prosedürleri, hücrelerde telomeraz aktivitesini sağlam bir şekilde ölçmek için tarif ettik. Geleneksel telomeraz uzatma reaksiyonunu ddPCR ile birleştirerek, akciğer kanseri hücrelerinde telomeraz aktivitesini (telomeraz genişletilmiş ürünler) nicaliksel olarak tespit edebildik.
DdTRAP tahlil TRAP tahlil olarak aynı teoriye dayanır. Hücre endoglikozidazları enzim aktivitesini korumak ve daha sonra "TS" substrat/astar bir telomeraz uzatma reaksiyonu gerçekleştirmek için kullanılan bir Noniyonik deterjan (NP-40) liziz tampon hücrelerinde parçalanması tarafından elde edilir. DdTRAP yenilik PCR önce damlacıklar oluşumuna dayanır. Numunenin damlacıklar halinde bölümleme, hücre başına telomeraz aktivitesinin mutlak ölçülmesini elde etmek için tahlil sağlar.
Telomeraz aktivitesi, ddTRAP kullanarak akciğer kanseri hücre hatlarında ölçülmüştür. Jel tabanlı TRAP tahlil önemli sınırlamalarından biri bir defada işlenebilir numunelerin sayısıdır. Çoğu jel tarak sadece 20 kuyu/numune kadar barındırabilir. Buna karşılık, ddTRAP 96 örnekleri bir defada, önemli ölçüde aynı anda işlenen örnekleri sayısını artırarak çalıştırabilirsiniz. Sekiz hücreli hatlarda telomeraz aktivitesini tespit ettik. En önemlisi, biz toplam 24 uzatma reaksiyonları için biyolojik Çoğalt her telomeraz uzatma reaksiyonu koştu. Daha sonra her uzatma reaksiyonu ddPCR plaka üzerinde toplam 72 numuneler için PCR için üç teknik çoğaltır olarak çalıştırmak başardık. Ayrıca, ddtrap tahlil bir ara CV ile tekrarlanabilir sonuçlar sağlar (varyasyon katsayısı) 100 hücre eşdeğerleri için% 5,1 ve bir gün içi CV 8,61% için 100 hücre eşdeğerleri. Ara ve gün içi, Hela hücresi endoglikozidazları11' de sırasıyla iki farklı plaka veya aynı plaka üzerinde çalışan biyolojik çoğaltır temsil eder. Eğer 72 numuneler geleneksel TRAP veya başka bir jel tabanlı tahlil işlenmiş ise, çok daha fazla el zamanı gerektirir. Bu, reaktiflerin daha yüksek maliyetlerine, çalışanlardan/öğrencilerimizden/stajyerlerden, daha yüksek bir jel-jel değişkenliğine ve kullanıcılar ile laboratuvarlar arasında yeniden Üretilebilirlik olmaması gereken daha değerli zamanlara yol açar. Güvenilir ve kolay bir şekilde ddTRAP çoğaltır çalıştırmak için yeteneği jel tabanlı bilgiler üzerinde dramatik bir gelişme ve çok daha fazla numune verimli işlenmesini sağlar, hangi veri istatistiksel analiz AIDS.
Son olarak, ddTRAP genel olarak örnekleri arasında daha az değişkenlik ve gerekli çoğaltır gerçekleştirme imkanı kullanıcıların örnekleri arasında iki kat daha az değişiklikleri gözlemlemek sağlar. En fazla jel bazlı ölçümlere ilişkin önemli sınırlama, uygun miktarın olmaması. Burada, ddTRAP kullanarak, biz çeşitli akciğer kanseri hatları arasında ince farklar tespit edebilirsiniz. İnce farklılıklar, telomeraz aktivitesini hedefleyen ilaçların karşılaştırılması ve yüksek verimlilik ekranlarından küçük molekül bileşikleri ile ileriye doğru hareket edip etmediği konusunda karar verirken önemli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar Sağlık Ulusal Enstitüleri (NıH) (CCI-R00-CA197672-01A1) fon kaynaklarını kabul etmek istiyorum. Küçük hücreli akciğer kanseri hatları (SHP77 ve H82), UT Southwestern Tıp Merkezi 'nden DRS. John Minna ve adi Gazdar 'dan cömert bir hediyeydi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
References
- Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
