Summary
Vi har med succes konverteret standard telomere gentagelse forstærknings protokol (TRAP) assay, der skal anvendes i dråbe digitale polymerase kædereaktioner. Denne nye analyse, kaldet ddTRAP, er mere følsom og kvantitativ, giver mulighed for bedre påvisning og statistisk analyse af telomerase aktivitet inden for forskellige humane celler.
Abstract
Telomere REPEAT-forstærknings protokollen (TRAP) er den mest udbredte analyse til påvisning af telomeraseaktivitet inden for en given prøve. Den polymerasekæde reaktion (PCR)-baserede metode giver mulighed for robuste målinger af enzymaktivitet fra de fleste celle lysater. Den gel-baserede Trap med optælling mærkede primere begrænser prøve gennemløb, og evnen til at detektere forskelle i prøver er begrænset til to gange eller større ændringer i enzymaktivitet. Den dråbe digital TRAP, ddTRAP, er en meget følsom tilgang, der er blevet modificeret fra den traditionelle TRAP-analyse, der gør det muligt for brugeren at udføre en robust analyse på 96 prøver pr. løb og opnå absolut kvantificering af DNA (telomerase forlængelse produkter ) input inden for hver PCR. Derfor overvinder den nyudviklede ddTRAP-analyse begrænsningerne ved den traditionelle gel-baserede TRAP-analyse og giver en mere effektiv, nøjagtig og kvantitativ tilgang til måling af telomeraseaktivitet inden for laboratorie-og kliniske miljøer.
Introduction
Telomeres er dynamiske DNA-protein komplekser i enderne af lineære kromosomer. Human telomerer består af en række 5 '-ttagggn hexameric gentagelser, som varierer i længde mellem 12 – 15 kilo baser (KB) ved fødslen1. Humant telomerase, ribonucleoprotein enzym, der vedligeholder telomerer, blev først identificeret i Hela celle lysaterne (kræft cellelinje)2. Tilsammen spiller telomerer og telomerase en vigtig rolle i et spektrum af biologiske processer som genombeskyttelse, genregulering og kræftcellers udødelighed3,4,5,6.
Human telomerase består primært af to nøglekomponenter, nemlig telomerase reverse transkriptase og telomerase RNA (henholdsvis hTERT og hTERC). Protein-under enheden, hTERT, er den katalytisk aktive reverse transkriptase-komponent i telomeraseenzymet. RNA-skabelonen, hTERC, giver telomerase med skabelonen til at udvide og/eller vedligeholde telomeres. De fleste humane somatiske væv har ingen påviselige telomerase aktivitet. Den manglende evne af DNA-Polymerase til at forlænge slutningen af den halter streng af DNA sammen med manglen på telomerase fører til den progressive forkortelse af telomerer efter hver runde af cellulære division. Disse fænomener fører til telomere forkortelse i de fleste somatiske celler, indtil de når en kritisk forkortet længde, hvor cellerne indtaster en tilstand af replikativ senescens. Det maksimale antal gange en celle kan opdele er dikteret af sin telomere længde og denne blok til fortsat celle division menes at forhindre progression til oncogenesis7. Kræftceller er i stand til at overvinde telomere-induceret replikativ senescens og fortsætte med at formere ved at udnytte telomerase at opretholde deres telomerer. Ca 90% af kræftformer aktivere telomerase, gør telomerase aktivitet kritisk vigtigt i både kræft påvisning og behandling.
Udviklingen af TRAP-analysen i 1990 ' erne var medvirkende til at identificere de nødvendige komponenter af telomeraseenzymet samt til måling af telomerase i en lang række celler og væv, både normale og kræftrelaterede. Den oprindelige gel-baserede PCR-analyse anvendte radioaktivt mærkede DNA-substrater til at detektere telomeraseaktivitet. I 2006 blev analysen tilpasset til en ikke-radioaktiv form ved hjælp af optælling mærket substrater8,9. Ved at bruge optælling mærket substrater, brugere var i stand til at visualisere telomerase udvidelse produkter som bands på en gel ved at udsætte det til den korrekte excitation bølgelængde. Følsomheden af TRAP-analysen og dens evne til at detektere telomeraseaktivitet i rå celle lysater har gjort denne analyse den mest udbredte metode til telomerase aktivitet påvisning. TRAP-analysen har dog begrænsninger. Analysen er gel-baseret, hvilket gør det vanskeligt at udføre de nødvendige replikater i moderat til høj-gennemløb undersøgelser, og dermed korrekt statistisk analyse er sjældent opnået. Desuden er det gel-baserede assay vanskeligt at kvantificere pålideligt på grund af manglende evne til at påvise mindre end to forskelle i telomeraseaktiviteten mellem prøverne. Overvinde disse to begrænsninger er afgørende for enzymatiske aktivitet analyser såsom Trap at flytte til kliniske eller industrielle indstillinger for påvisning af telomerase aktivitet i patientprøver eller Drug Design undersøgelser.
Digital PCR blev oprindeligt udviklet i 1999 som et middel til at omdanne den eksponentielle og analoge karakter af PCR til en lineær og digital assay10. Droplet digital PCR (ddPCR) er den seneste nyskabelse i den oprindelige digitale PCR-metodologi. Droplet digital PCR kom om med fremkomsten af avancerede mikrofluidics og olie-i-vand emulsion kemi til pålideligt generere stabile og lige store dråber. I modsætning til gel-baseret og endda kvantitativ PCR (qPCR) genererer ddPCR absolut kvantificering af input materialet. Nøglen til ddPCR er dannelsen af ~ 20.000 individuelle reaktioner ved at partitionere prøver i dråber. Efter slutpunkt PCR scanner dråbe læseren hver dråbe i en flow-cytometer-lignende mode, tælle, dimensionering, og registrere tilstedeværelsen eller fravær af fluorescens i hver enkelt dråbe (dvs. fravær eller tilstedeværelse af PCR amplikoner i hver dråbe). Derefter, ved hjælp af Poisson ' s fordeling, input molekyler er anslået baseret på forholdet mellem positive dråber til det samlede antal dråber. Dette tal repræsenterer et estimat af antallet af indgangs molekyler i hver PCR. Desuden, ddPCR udføres og analyseres på en 96-brønd plade, som giver brugeren mulighed for at køre mange prøver, samt udføre biologiske og tekniske replikater til korrekt statistisk analyse. Som et resultat, vi har kombineret den kraftige kvantificering og moderat-gennemløb karakter af ddPCR med TRAP-analysen til at udvikle ddTRAP assay11. Denne analyse er designet til brugere til at studere og robust kvantificere absolutte telomerase aktivitet fra biologiske prøver11,12. DdTRAP-følsomheden gør det muligt at kvantificere telomeraseaktivitet fra begrænsede og dyrebare prøver, herunder enkelt celle målinger. Endvidere, brugere kan også studere virkningerne af telomerase manipulationer og/eller narkotika med absolut kvantificering af mindre end to ændringer (~ 50% forskelle). DdTRAP er den naturlige udvikling af TRAP-analysen i den digitale og højere gennemløb karakter af moderne laboratorie eksperimenter og kliniske indstillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargøring og oplagring af buffer
- Forbered 50 mL 1x lager RNase-/DNase-fri NP-40 lysis buffer (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM MgCl2, 1 mm ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA), 1% [Vol/Vol] NP-40, 10% [Vol/Vol] glycerol, 150 mm NaCl, 5 mm β-mercaptoethanol og 0,1 mm 4- benzensulfonylfluoridhydrochlorid (AEBSF)). Denne buffer kan aliciteres og opbevares ved-20 °C til fremtidig brug. Undgå frost/optønings cyklusser for at opnå optimal lysis af cellerne.
- Forbered 50 mL 10x Stock RNase-/DNase-free TRAP-forlænger buffer (200 mM Tris-HCl [pH 8,0], 15 mM MgCl2, 630 mm kcl, 0,5% [Vol/Vol] mellem 20 og 10 mm ethylenglycol-bis (β-aminoethylether)-N, n, n ′, n′-tetraeddikesyre (EGTA)). Denne buffer kan aliciteres i 1 mL-aliquoter og opbevares ved-20 °C til fremtidig brug.
2. celle lysis
-
Klargøring af cellerne
- Optø en frossen alikvot NP-40 lysis buffer. Når optøet, placere lysis buffer på is. Tilsæt phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF proteasehæmmer) til NP-40 lysis buffer for at nå en endelig koncentration på 0,2 mM.
Bemærk: dette skal gøres umiddelbart før lyserende af cellerne. - Fjern eventuel overskydende væske fra de indsamlede celle pellets for at sikre en tør celle pellet. Bemærk, at celle pellets, uanset om de er frisk opsamlet eller tidligere frosset (-80 °C eller flash frosset i væske N2), ikke må indeholde rester fra tidligere centrifugationer, da disse opløsninger kan forstyrre downstream-procedurerne.
- Vokse, indsamle og fryse både telomerase-positive og telomerase-negative cellelinjer (BJ fibroblaster, IMR-90 eller U2OS) for at bruge dem som positive og negative kontroller. Brug nye kontrol lysater, hver gang analysen udføres for at sikre analysens reproducerbarhed.
Bemærk: det tilrådes, at en stor kultur af telomerase-negative celler dyrkes og aliciteres før frysning for at fjerne eventuelle væv-kultur-relaterede artefakter, der kan indføres under den langsigtede kultur af cellelinjer for at hjælpe med at sikre reproducerbare resultater af den negative kontrolprøve. - Placer celle pillerne på is. Hvis cellerne var frosne, så lad dem tø op på is.
Bemærk: typiske celle pellet størrelser for ddTRAP er mellem 500.000 og 1.000.000 celler. Mindre celle pellets kan også anvendes, hvis det er nødvendigt, men celletallet skal/ideelt bør være kendt. DdTRAP kan også udføres baseret på protein input ved hjælp af en BCA protein assay (input normalt er 1 μg).
- Optø en frossen alikvot NP-40 lysis buffer. Når optøet, placere lysis buffer på is. Tilsæt phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF proteasehæmmer) til NP-40 lysis buffer for at nå en endelig koncentration på 0,2 mM.
-
Lysing af cellerne
- Lysere cellerne i NP-40 lysis buffer. Opretholde en celle ækvivalens på 25.000 celler/μL buffer. For eksempel, lyse en pellet (indeholdende 1.000.000 celler) i 40 μL af NP-40 lysis buffer. Forsigtigt pipetere lyden op og ned for at bryde åbne cellerne. Prøv at undgå at lave bobler.
- Lad cellerne lyse på is i 30 min. Sørg for forsigtigt at vortex lysatet for at forhindre klynger af cellerester fra formning. Dette kan gøres hver 10 min og er beregnet til at holde lysatet en homogeniseret blanding.
- Fortynde celle lysatet (25.000 celler/μL) 1:20 i NP-40 lysis buffer, hvilket gør den nye celle ækvivalens 1.250 celler/μL. For eksempel fortyndes 5 μL celle lyat til 95 μL lysis buffer.
3. telomerase forlængelse reaktion
- Forbered en masterblanding (tabel 1) til telomeraseforlængelses reaktionen (pr. reaktion).
Bemærk: det er bedst at tilberede udvidelses reaktions masterblandingen under celle lysis og opbevare den på is.- Pipet 48 μL af forlænger Master blandes i hvert PCR-rør.
- Der tilsættes 2 μL fortyndet (1.250 celler/μL) lyat til forlængelses reaktionen. Det totale volumen bør nu være 50 μL med en endelig celle ækvivalens på 50 celler/μL.
- Udfør telomeraseforlængelses reaktionen (tabel 2).
- Opbevar telomeraseforlænger produkter ved 4 °C i op til 3-5 dage. Det er dog optimalt at bruge forlænger produkterne inden for de første 24 timer.
4. opsætning af droplet digital PCR
- Forbered en masterblanding (tabel 3) til ddtrap (pr. reaktion).
Bemærk: når reagenserne er ved stuetemperatur, må du ikke anbringe dem eller masterblandingen på is. Placering af blandingen på is kan øge viskositeten og føre til dårlig dråbedannelse. DNA-Polymerase i ddPCR supermix er en varm start og skal være stabil ved stuetemperatur. DdPCR supermix kan opbevares ved 4 °C efter en Initial tø fra-20 °C.- Pipet 19,8 μL af ddPCR Master blandes i hvert PCR-rør.
- Der tilsættes 2,2 μL af forlængelses reaktionen til hvert rør. Bemærk, at den totale volumen nu skal være 22 μL.
Bemærk: den totale mængde prøve, der skal bruges til en ddTRAP, er 20 μL (celle ækvivalens af 100 celler). Den ekstra volumen er en forholdsregel for pipet fejl eller prøve tab.
- Opsætning af dråbe genererings patronen.
Bemærk: patronen indeholder tre forskellige kolonner af brønde, der er mærket.- 20 μL af reaktionen, der er fremstillet i henhold til trin 4.1.2, i prøvebrønden (midt brønd) indlæses i cylinderampullen. Undgå bobler ved Pipettering af prøven.
Bemærk: Hvis der er bobler, skal du forsigtigt tappe på siden af cylinderampullen, så disse bobler kommer til toppen af opløsningen. - Ilæg 70 μL dråbe generationsolie i olie brønden (venstre brønd).
Bemærk: for at undgå kontaminering skal du strengt anvende et separat sæt pipetter og spidser til ddpcr-dråbe-generations trin. Rækkefølgen for indlæsning af patronen er vigtig. Prøven skal indlæses før Ilægning af olie, da olien er tungere og vil fylde de mikrofluidiske kamre og føre til dårlig dråbedannelse. Det mindste antal prøver, der kan køres, er otte. Alle huller i cylinderampullen skal være lastet med prøven, da enhver Tom brønd vil føre til standsning i dråbe dannelsen fra dråbe generatoren. Hvis der ikke findes tilstrækkelige prøver til at indlæse alle otte brønde i en cylinderampul, kan der indlæses 20 μL ddTRAP-masterblanding (trin 4,1) i de resterende patroner. - Fastgør Gummiringen på plads ved at tøjpe den til enderne af patronen.
Bemærk: manglen eller ukorrekt placering af pakningen vil forhindre generatoren i at generere dråber. - Anbring den ilagte og monterede cylinderampul i dråbe generatoren.
Bemærk: patronen genkendes af en magnet i generatoren, som informerer brugeren, når patronen er placeret korrekt.
- 20 μL af reaktionen, der er fremstillet i henhold til trin 4.1.2, i prøvebrønden (midt brønd) indlæses i cylinderampullen. Undgå bobler ved Pipettering af prøven.
- Fjern patronen, når dråberne er genereret, og cyklussen er færdig (~ 60 – 90 s).
- Fjern forsigtigt pakningen fra cylinderampullen. Pipet de nyligt genererede dråber (højre brønd), ved hjælp af en multikanalpipette, i en 96-brønd PCR-plade.
Bemærk: den omtrentlige volumen for den nyligt genererede dråbe emulsion skal være 40 – 43 μL. - Varme forsegle pladen med aluminiumsfolie PCR-plade tætninger, når alle prøverne er lagt i 96-brønd pladen for at forhindre fordampning under PCR-trinene.
- Fjern forsigtigt pakningen fra cylinderampullen. Pipet de nyligt genererede dråber (højre brønd), ved hjælp af en multikanalpipette, i en 96-brønd PCR-plade.
- Læg 96-brønd pladen i termocycleren, og Udfør følgende PCR-reaktion (tabel 4).
Bemærk: alle rampe hastigheder mellem temperatur trinene skal indstilles til 2,5 °C/s for at opvarme Reaktionerne korrekt.
5. påvisning af telomeraseforlænger produkter
- Læg 96-brønd pladen i dråbe læseren.
Bemærk: Sørg for at orientere pladen korrekt, så a1 -prøven matcher med holderen.- Åbn den software, der er forbundet med dråbe læseren. Dobbeltklik på den første brønd a1 for at åbne prøve/brønd Editor skærmen.
- Klik på eksperiment , og vælg ABS i rullemenuen.
Bemærk: eksperimentet definerer den type analyse, der skal anvendes (dvs. absolut kvantificering eller genkopitalassay). ABS står for absolut kvantificering. - Vælg QX200 ddPCR Evagreen supermix for at sikre, at den korrekte detektionsmetode anvendes af læseren. Klik på Anvend i nederste højre side af brønden Editor skærmen for at gemme de brugerdefinerede indstillinger til alle de fremhævede brønde.
Bemærk: supermix definerer den type PCR mix og detekterings kemi, som læseren vil læse. - Klik på Target i brønden Editor skærmen af softwaren for at definere prøven.
- Definer eksempel typen ved at klikke på rullemenuen mål og vælge enten Ukendt, Referenceeller NTC (ingen skabelon kontrol).
Bemærk: Ukendt ville henvise til en eksperimentel prøve, Reference kunne være en kontrolprøve af kendt telomerase aktivitet, og en NTC er en kritisk kontrol for bestemmelse af assay gyldighed med hensyn til kontaminering og baggrunds signalet. - Mærk alle eksemplerne i afsnittet eksempel navn , og klik på Anvend for at sikre, at de fremhævede brønde redigeres korrekt.
- Klik på Kør for at køre/læse pladen. Vælg enten kolonner eller rækker i skærmbilledet Indstillinger for løb , når du bliver bedt om at informere maskinen om den retning, som pladen skal læses i.
6. data analyse
- Bestem antallet af accepterede dråber for hver prøve ved at klikke på de enkelte brønde. Dobbeltklik på de enkelte brønde eller kolonne-/rækkeoverskrifter for at få vist og analysere eksempeldataene.
Bemærk: de vigtigste kriterier for, hvorvidt analysen af en bestemt prøve skal fortsættes eller ej, er antallet af "accepterede dråber". For ddTRAP er prøver med 10.000 eller flere accepterede dråber gyldige til yderligere analyse. Data kan leveres til brugeren i mange formater, herunder en. csv-tabel,. jpg-billeder, histogrammer osv. Der er mange ressourcer til rådighed til dybtgående analyse af ddpcr data, herunder ddtrap11,13. Disse ressourcer indeholder en vejledning til analyse af ddtrap-data, fra valg af tærskelværdier11,13 til valg af prøver til yderligere analyse11,13, identificering af falske positiver og negativer13, og generel fejlfinding13. - Fremhæv brøndene, der repræsenterer prøve replikater og NTC-prøver. Analyser prøverne i forhold til enten NTC eller negative kontrollinjer, såsom BJ-celler (som anført ovenfor i trin 2.1.2).
- Indstil manuelt tærsklen for prøverne ved at klikke på ikonet for at indstille tærskler nederst til venstre på skærmen. Indstil tærskler for hver enkelt brønd eller for flere brønde ad gangen (anbefales).
Bemærk: Hvis der registreres en baggrund i NTC, kan den trækkes fra alle de andre prøver for at "normalisere" signalet og sikre, at kun det sande positive signal analyseres. NTC-værdier er typisk i intervallet 0,2 – 1 molekyle/μL for NP-40 lysis buffer-systemet. Andre buffer systemer og komponenter skal afprøves (f. eks. CHAPS-buffere).
- Indstil manuelt tærsklen for prøverne ved at klikke på ikonet for at indstille tærskler nederst til venstre på skærmen. Indstil tærskler for hver enkelt brønd eller for flere brønde ad gangen (anbefales).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af ddTRAP blev telomeraseaktiviteten målt i et celle panel bestående af følgende cellelinjer (figur 1): ikke-småcellet lungecancer (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 og H2887), småcellet lungecancer (H82 og SHP77) og telomerase-negative fibroblaster (BJ). 1.000.000 celle pellets blev lyseret i np-40 buffer, og telomerase forlængelses reaktioner blev udført i biologiske triplicater. En fælles og stærkt anbefalet negativ kontrol er "NTC", no-Template kontrol. Denne prøve genereres ved at tilsætte NP-40 lysis buffer (2 μL) til telomeraseforlængelses reaktionen og fortsætte med forlængelses produkterne på samme måde som andre prøver, der indeholder faktisk celle lyat. Dette eksempel gør det muligt for brugeren at trække baggrunds signalet, hvis nogen, for bedre at kvantificere telomeraseaktiviteten. Selv om det ikke er vist i denne figur, er det også muligt at varme inaktivere lysatet ved 95 ° C i 5 min før telomerase forlængelse reaktion som en anden negativ kontrol. Denne negative kontrol foretrækkes, hvis celle/prøve forekomst ikke er et problem.
Ved at måle fluorescens intensiteten af hver enkelt dråbe i dråbe emulsionen var dråbe læseren i stand til at anslå koncentrationen af input molekyler (molekyler/mikroliter) ved hjælp af Poisson-fordelingen (figur 1a). I tilfælde af ddTRAP, disse input molekyler var telomerase forlængelse produkter. Mekanismen i ddTRAP-analysen var som følger: telomerase forlængede TS-substratet. Disse udvidede substrater fungerede som PCR-skabelonerne i ddPCR. Kvantificering af PCR-forstærkede substrater gav en repræsentation af telomeraseenzymatisk aktivitet inden for en given cellelinje. Hver dråbe blev plottet som vist i figur 1a. Fastsættelse af tærsklen for en ddTRAP kan være subjektiv; men med den korrekte negative kontrol, kan brugeren nemt gøre det. I eksemplet vist i figur 1ablev der fastsat en tærskel for alle tre biologiske REPLIKATER for SHP77, H2887 og NTC. Positive dråber havde en fluorescens intensitet omkring 6.000 fluorescens amplitude (FA) og dannede en klar population i toppen og adskilt fra negative dråber omkring 1.100 FA. Derfor kan tærsklen sættes til ~ 2.000 FA i dette eksperiment.
Når dataene blev indsamlet og eksporteret, var det muligt at beregne det samlede antal telomeraseforlængelses produkter pr. celle ækvivalent mellem alle prøverne (figur 1b). Signalet fra alle brønden var en absolut koncentration (molekyler/mikroliter). Ved at multiplicere koncentrationen med 20 (indgangs volumen af prøven til ddPCR-patroner) kan brugeren opnå det totale antal molekyler. Dette nummer kan derefter divideres med den kendte celle ækvivalent (i vores præstation af ddTRAP, vi brugte 100 celler). Denne endelige værdi er i enhederne af telomerase-udvidelses produkter pr. celle ækvivalent som vist på y-aksen.
Figur 1: Telomeraseaktivitet i et lungecancer panel. A) 1d-amplitude af dråbe fluorescens intensitet (Fluorescens amplitude) for SHP77, H2887 og NTC. Brønde til SHP77, H2887 og NTC blev valgt, og en manuel tærskel blev fastsat til 2.000 FA. (B) telomeraseaktiviteten blev anslået ud fra den målte koncentration af de nukleinsyrer, der blev påvist efter PCR og afbildet med henblik på at sammenligne telomeraseaktivitet i lungecancer linjer. FA = fluorescens amplitude enheder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målingen af telomerase aktivitet er afgørende for en overflod af forskningsemner, herunder, men ikke begrænset til, kræft, telomere biologi, aldring, regenerativ medicin, og struktur-baseret Drug design. Telomerase RNPs er lav rigelige, selv i kræftceller, hvilket gør påvisning og undersøgelse af dette enzym udfordrende. I dette papir, beskrev vi trin-for-trin procedurer for den nyudviklede ddTRAP analyse til robust kvantificere telomerase aktivitet i celler. Ved at kombinere den traditionelle telomerase forlængelse reaktion med ddPCR, vi var i stand til kvantitativt detektere telomerase aktivitet (telomerase-udvidede produkter) i lungekræft celler.
DdTRAP-analysen er baseret på samme teori som TRAP-analysen. Celle lysater opnås ved lyserende celler i en nonioniske rengøringsmiddel (NP-40) lysis buffer til at opretholde enzymaktivitet og derefter anvendes til at udføre en telomerase forlængelse reaktion af "TS" substrat/primer. Det nye ved ddtrap er afhængig af dannelsen af dråber før PCR. Opdelingen af prøven i dråber gør det muligt for analysen at opnå absolut kvantificering af telomeraseaktivitet pr. celle.
Telomeraseaktivitet blev målt i lungecancer cellelinjer ved hjælp af ddTRAP. En af de vigtigste begrænsninger i den gel-baserede TRAP-analyse er antallet af prøver, der kan behandles ad gangen. De fleste gel kamme kan kun rumme op til 20 brønde/prøver. I modsætning hertil kan ddTRAP køre op til 96 prøver ad gangen, hvilket øger antallet af prøver, der kan behandles på én gang. Vi har analyseret telomeraseaktivitet i otte cellelinjer. Vigtigst af alt, vi kørte hver telomerase forlængelse reaktion i biologiske triplicates for i alt 24 forlængelse reaktioner. Derefter var vi i stand til at køre hver udvidelses reaktion som tre tekniske replikater til PCR for i alt 72 prøver på ddPCR-pladen. Desuden giver ddTRAP-analysen reproducerbare resultater med et interday CV (variationskoefficient) på 5,1% for 100-celle ækvivalenter og et intradagcv på 8,61% for 100 celle ækvivalenter. Interday og intradag repræsenterer biologiske replikater køre på to forskellige plader eller samme plade, henholdsvis på Hela celle lysaterne11. Hvis 72 prøver blev behandlet i den traditionelle TRAP eller andre gel-baserede assay, ville det kræve meget mere hands-on tid. Dette fører til højere omkostninger af reagenser, mere værdifuld tid, der kræves af medarbejdere/studerende/praktikanter, en højere gel-til-gel variabilitet, og en manglende reproducerbarhed mellem brugere og laboratorier. Evnen til pålideligt og nemt at køre replikater i ddtrap er en dramatisk forbedring i forhold til gel-baserede analyser og tillader mange flere prøver, der skal behandles effektivt, hvilket hjælper i den statistiske analyse af data.
Endelig giver mindre variation mellem prøverne generelt i ddTRAP og muligheden for at udføre de nødvendige replikater mulighed for, at brugerne kan observere mindre end dobbelte ændringer mellem prøverne. Den største begrænsning af de fleste gel-baserede analyser er manglen på korrekt kvantificering. Her, ved hjælp af ddTRAP, kan vi opdage de subtile forskelle mellem de forskellige lungekræft linjer. De subtile forskelle kan være afgørende, når det kommer til at sammenligne lægemidler rettet mod telomerase aktivitet og beslutte, om ikke at bevæge sig fremad med små molekyler forbindelser fra høj-gennemløb skærme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende finansieringskilder fra de nationale sundhedsinstitutter (NIH) (NIC-r00-CA197672-01A1). Små celle lungecancer linjer (SHP77 og H82) var en generøs gave fra DRs. John Minna og ADI Gazdar fra UT Southwestern Medical Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAse free |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAse free |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAse free |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Ultrapure Glycerol | Invitrogen | 15514011 | RNAse/DNAse free |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Thermo Scientific | 36978 | Powder |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Nuclease Free H20 | Ambion | AM9932 | RNAse/DNAse free |
| 2.5 mM dNTP mix | Thermo Scientific | R72501 | 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | RNAse/DNAse free |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 | RNAse/DNAse free |
| Telomerase Substrate (TS) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' |
| ACX (Revers) Primer | Integrated DNA Technology (IDT) | Custom Primer (HPLC Purified) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3' |
| Thin walled (250 ul) PCR grade tubes | USA Scientific | 1402-2900 | strips, plates, tubes etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable foil heat seal | Bio Rad | 1814040 | |
| Droplet generator cartidges (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Droplet generator oil | Bio Rad | 1863005 | |
| Droplet generator gasket | Bio Rad | 1863009 | |
| 96-well Thermocycler T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software | Bio Rad | 1864001 and 1864003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | |
| Nuclease Free Filtered Pipette Tips | Thermo Scientific | 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul |
References
- Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell. 59 (3), 521-529 (1989).
- de Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Role of telomeres and telomerase in cancer. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 349-353 (2011).
- Kim, W., Shay, J. W. Long-range telomere regulation of gene expression: Telomere looping and telomere position effect over long distances (TPE-OLD). Differentiation. 99, 1-9 (2018).
- Robin, J. D., et al. Telomere position effect: regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances. Genes Development. 28 (22), 2464-2476 (2014).
- Shay, J. W., Wright, W. E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase. Carcinogenesis. 26 (5), 867-874 (2005).
- Norton, J. C., Holt, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Enhanced detection of human telomerase activity. DNA Cell Biology. 17 (3), 217-219 (1998).
- Herbert, B. S., Hochreiter, A. E., Wright, W. E., Shay, J. W. Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol. Nature Protocols. 1 (3), 1583-1590 (2006).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Research. 42 (13), e104 (2014).
- Huang, E. E., et al. The Maintenance of Telomere Length in CD28+ T Cells During T Lymphocyte Stimulation. Scientific Reports. 7 (1), 6785 (2017).
- Ludlow, A. T., Shelton, D., Wright, W. E., Shay, J. W. ddTRAP: A Method for Sensitive and Precise Quantification of Telomerase Activity. Methods Molecular Biology. 1768, 513-529 (2018).
