Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

شريحة موائع دقيقة بسيطة للنمو على المدى الطويل وتصوير Caenorhabditis elegans

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63136
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,5, 2
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

Summary

يصف البروتوكول تصميما بسيطا لرقاقة الموائع الدقيقة ومنهجية التصنيع الدقيق المستخدمة لزراعة C. elegans في وجود إمدادات غذائية مستمرة لمدة تصل إلى 36 ساعة. يتيح جهاز النمو والتصوير أيضا تصويرا متقطعا عالي الدقة طويل المدى للعمليات الخلوية وشبه الخلوية أثناء التطوير لعدة أيام.

Abstract

أثبت Caenorhabditis elegans (C. elegans) أنه نظام نموذجي قيم لدراسة العمليات البيولوجية التنموية والخلوية. غالبا ما يتطلب فهم هذه العمليات البيولوجية تصويرا طويل الأمد ومتكررا لنفس الحيوان. أوقات التعافي الطويلة المرتبطة بطرق التثبيت التقليدية التي تتم على منصات أجار لها آثار ضارة على صحة الحيوان مما يجعل من غير المناسب تصوير نفس الحيوان بشكل متكرر على مدى فترات طويلة من الزمن. تصف هذه الورقة تصميم رقاقة الموائع الدقيقة ، وطريقة التصنيع ، وبروتوكول زراعة C. elegans على الرقاقة ، وثلاثة أمثلة للتصوير طويل المدى لدراسة العمليات التنموية في الحيوانات الفردية. الرقاقة ، المصنعة من polydimethylsiloxane والمستعبدين على غطاء زجاجي ، تشل حركة الحيوانات على ركيزة زجاجية باستخدام غشاء مرن ينحرف باستخدام غاز النيتروجين. يتيح التثبيت الكامل ل C. elegans تصويرا قويا بفاصل زمني للأحداث الخلوية وشبه الخلوية بطريقة خالية من التخدير. تسمح هندسة القناة ذات المقطع العرضي الكبير للحيوان بالتحرك بحرية داخل غشاءين معزولين مغلقين جزئيا مما يسمح بالنمو في القناة مع إمدادات غذائية مستمرة. باستخدام هذه الشريحة البسيطة ، يمكن إجراء تصوير الظواهر التنموية مثل نمو العملية العصبية ، وتطور الفرج ، والتشجير المتغصن في الخلايا العصبية الحسية PVD ، حيث ينمو الحيوان داخل القناة. تعمل رقاقة النمو والتصوير على المدى الطويل بخط ضغط واحد ، ولا توجد صمامات خارجية ، ومستهلكات سائلة غير مكلفة ، وتستخدم بروتوكولات معالجة الديدان القياسية التي يمكن تكييفها بسهولة من قبل المختبرات الأخرى باستخدام C. elegans.

Introduction

أثبت Caenorhabditis elegans أنه كائن نموذجي قوي لدراسة بيولوجيا الخلية والشيخوخة وبيولوجيا التنمية وبيولوجيا الأعصاب. أدت مزايا مثل جسمها الشفاف ، ودورة حياتها القصيرة ، وسهولة الصيانة ، وعدد محدد من الخلايا ، والتماثل مع العديد من الجينات البشرية ، وعلم الوراثة المدروس جيدا إلى أن تصبح C. elegans نموذجا شائعا لكل من اكتشافات البيولوجيا الأساسية والبحوث التطبيقية 1,2. يمكن أن يكون فهم العمليات البيولوجية والتنموية للخلية من الملاحظة المتكررة طويلة المدى للحيوانات الفردية مفيدا. تقليديا ، يتم تخدير C. elegans على منصات أجار وتصويرها تحت المجهر. الآثار الضارة للتخدير على صحة الحيوانات تحد من استخدام الحيوانات المخدرة للتصوير المتقطع على المدى الطويل والمتكرر لنفس الحيوان 3,4. تتيح التطورات الحديثة في تقنيات الموائع الدقيقة وتكييفها مع الاصطياد الخالي من التخدير ل C. elegans مع مخاطر صحية ضئيلة التصوير عالي الدقة لنفس الحيوان على مدى فترة زمنية قصيرة وطويلة.

تم تصميم رقائق الموائع الدقيقة لفحص C. elegans'5 عالي الإنتاجية6،7،8 ، ومحاصرة وتوزيع9 ، وفحص المخدرات 10،11 ، وتحفيز الخلايا العصبية مع تصوير عالي الدقة 12 ، وتصوير عالي الدقة للحيوان 12،13،14. كما تم تطوير صفائح الموائع الدقيقة الرقيقة للغاية للتثبيت على الشرائح15. تم إجراء دراسات طويلة الأجل على C. elegans باستخدام صور منخفضة الدقة للحيوانات التي تنمو في الثقافة السائلة لمراقبة النمو وديناميكيات الكالسيوم وتأثيرات الدواء على سلوكها16،17،18،19 ، وطول عمرها ، والشيخوخة20. تم إجراء دراسات طويلة الأجل باستخدام الفحص المجهري عالي الدقة لتقييم التطور المشبكي21 ، وتجديد الخلايا العصبية 22 ، وإضافة الميتوكوندريا23. تم إجراء تصوير عالي الدقة على المدى الطويل وتتبع مصير الخلية والتمايز في أجهزة متعددة القنوات24,25. تحدث العديد من الأحداث الخلوية وشبه الخلوية على مدى نطاقات زمنية لعدة ساعات وتتطلب محاصرة نفس الفرد في نقاط زمنية مختلفة أثناء تطورها لتوصيف جميع الخطوات الوسيطة في العملية لفهم الديناميات الخلوية في الجسم الحي. لتصوير العملية البيولوجية مثل تكوين الأعضاء ، وتطور الخلايا العصبية ، وهجرة الخلايا ، يحتاج الحيوان إلى تجميد الحركة في نفس الاتجاه في نقاط زمنية متعددة. لقد نشرنا سابقا بروتوكولا للتصوير عالي الدقة ل C. elegans لأكثر من 36 ساعة لتحديد مكان إضافة الميتوكوندريا على طول الخلايا العصبية المستقبلة لمستقبلات اللمس (TRNs)23.

تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإنشاء منهجية قائمة على الموائع الدقيقة للتصوير المتكرر عالي الدقة. هذا الجهاز ، مع قناة تدفق واحدة ، هو الأنسب للتصوير المتكرر لحيوان واحد لكل جهاز. لتحسين الإنتاجية وتصوير العديد من الحيوانات في وقت واحد ، يمكن توصيل أجهزة متعددة بنفس خط الضغط ولكن مع موصلات ثلاثية منفصلة تتحكم في واحد في كل جهاز. التصميم مفيد للدراسات التي تتطلب صورا ذات فاصل زمني عالية الدقة مثل عمليات النمو بعد الجنين ، وهجرة الخلايا ، ونقل العضيات ، ودراسات التعبير الجيني ، وما إلى ذلك. يمكن أن تكون التكنولوجيا مقيدة لبعض التطبيقات مثل دراسات العمر والشيخوخة التي تتطلب نموا متوازيا وتصويرا للعديد من الحيوانات في المرحلة المتأخرة. تم استخدام المطاط الصناعي Polydimethylsiloxane (PDMS) لتصنيع هذا الجهاز بسبب ثباته الحيوي 26 ، والتوافق الحيوي 27،28 ، ونفاذية الغاز 29،30 ، ومعامل المرونة القابل للضبط 31. يسمح هذا الجهاز المكون من طبقتين بنمو الحيوانات ذات الإمدادات الغذائية المستمرة في قناة الموائع الدقيقة ومحاصرة C. elegans الفردية عبر ضغط غشاء PDMS باستخدام غاز النيتروجين. هذا الجهاز هو امتداد للجهاز المنشور سابقا مع ميزة زراعة وتصوير نفس الحيوان في القناة الدقيقة تحت إمدادات غذائية مستمرة3. تتيح شبكة غشاء العزل الإضافية وغشاء الاصطياد بعرض 2 مم تثبيت الحيوانات النامية بكفاءة. تم استخدام الجهاز لمراقبة تطور الخلايا العصبية ، وتطور الفرج ، والتشجير الشجيري في الخلايا العصبية الحسية PVD. تنمو الحيوانات دون آثار صحية ضارة في الجهاز ويمكن تجميدها بشكل متكرر لتسهيل تصوير الأحداث دون الخلوية في نفس الحيوان أثناء تطوره.

ينقسم البروتوكول بأكمله إلى خمسة أجزاء. يصف الجزء 1 تصنيع الجهاز لشريحة النمو والتصوير. يصف الجزء 2 كيفية إعداد نظام ضغط لانحراف غشاء PDMS لشل حركة وعزل C. elegans الفردية. يصف الجزء 3 كيفية مزامنة C. elegans على لوحة وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) لتصوير الجهاز. يصف الجزء 4 كيفية تحميل واحد في الجهاز وتنمية الحيوان داخل جهاز الموائع الدقيقة لعدة أيام. يصف الجزء 5 كيفية شل حركة فردي في نقاط زمنية متعددة ، والتقاط صور عالية الدقة باستخدام أهداف مختلفة ، وتحليل الصور باستخدام فيجي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصنيع جهاز النمو والتصوير

  1. تصنيع قوالب SU8
    1. أنماط التصميم 1 (طبقة التدفق) و 2 (طبقة التحكم) باستخدام أشكال مستطيلة في برنامج معالجة النصوص (أو برنامج CAD للتصميم بمساعدة الكمبيوتر) وطباعة الأقنعة الضوئية بمساعدة راسمة ليزر بحد أدنى لحجم الميزة 8 ميكرومتر على فيلم قائم على البوليستر (الشكل 1).
    2. قطع رقائق السيليكون في قطع 2.5 سم × 2.5 سم وتنظيفها بنسبة 20٪ KOH لمدة 1 دقيقة. شطف الرقائق في الماء منزوع الأيونات (DI). استخدم رقاقة واحدة لكل من التدفق وطبقة التحكم.
      تحذير: KOH مادة أكالة ويجب التعامل معها بحذر.
    3. جفف القطع بغاز النيتروجين المضغوط 14 رطل / بوصة مربعة متبوعا بالجفاف على طبق ساخن عند 120 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. قبل المتابعة إلى الخطوة التالية ، قم بتبريد القطعتين إلى درجة حرارة الغرفة.
    4. خذ إحدى قطع السيليكون وضعها على ظرف طلاء الدوران وقم بتشغيل المكنسة الكهربائية لتثبيت الرقاقة في مكانها. على قطعة السيليكون ، ضع ~ 20 ميكرولتر من سداسي ميثيل ديسيلان (HMDS) وقم بتغطيته باستخدام طبقة الدوران عند 500 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) لمدة 5 ثوان متبوعة ب 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
      تنبيه: يجب تنفيذ هذه الخطوة في الضوء الأصفر. لا تستخدم الضوء الأبيض في الغرفة.
    5. للحصول على سمك موحد مقاوم للضوء يبلغ ~ 40 ميكرومتر (خاص بطبقة التدفق ؛ مناسب لتصوير اليرقات المبكرة من المرحلة 1 إلى المرحلة 3 (L1 - L3)) ، قم بتغطية رقاقة السيليكون ب ~ 1.5 مل من مقاومة الضوء السلبية -1 باستخدام طبقة تدور عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان متبوعة ب 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
    6. كرر الخطوتين 1.1.4 و 1.1.5 مع الرقاقة الثانية للحصول على سمك موحد مقاوم للضوء يبلغ ~ 40 ميكرومتر خاص بطبقة التحكم.
    7. بدلا من ذلك ، لزيادة سمك طبقة التدفق إلى ~ 80 ميكرومتر للحيوانات الأكبر سنا ، قم بتغطية رقائق السيليكون ب ~ 1.5 مل من المقاومة الضوئية السلبية -2 باستخدام طبقة الدوران عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان متبوعة ب 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. هذه السماكة مناسبة لمرحلة L3 للحيوانات البالغة.
      تنبيه: أمسك رقائق السيليكون من جوانبها لتجنب أي ضرر للطبقات المطلية بالدوران. أبق الأضواء البيضاء مطفأة أثناء هذه الخطوة.
    8. تخبز قطع السيليكون المطلية بالمقاومة للضوء (لطبقات التدفق والتحكم) على طبق ساخن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة تليها 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تبريد القطع المخبوزة إلى درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن تخزين قطع السيليكون المخبوزة لمدة يوم واحد قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. تخزينها في الظلام ولا تعرض للضوء الأبيض.
    9. ضع قطع السيليكون المخبوزة ناعما في مرحلة التعرض لمصباح الأشعة فوق البنفسجية مع السطح المطلي بمقاومة الضوء الذي يواجه مصباح الأشعة فوق البنفسجية. قم بتعريض القطعتين بشكل منفصل للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 ثانية ، باستخدام مصباح 200 واط ، من خلال قناع ضوئي بأنماط 1 و 2 للحصول على طبقات التدفق والتحكم ، على التوالي.
      تنبيه: ارتد نظارات واقية وتجنب التعرض المباشر للأشعة فوق البنفسجية. لا تقم بتشغيل الضوء الأبيض في الغرفة خلال هذه المرحلة.
    10. تخبز قطعتا السيليكون المكشوفتان بطبقة مغلفة متجهة لأعلى ، عند 65 درجة مئوية تليها 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 10 دقائق على التوالي. قم بتبريد القطع إلى درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
    11. قم بتطوير الأنماط عن طريق نقع قطع السيليكون في محلول المطور المقاوم للضوء (تخفيف 1: 3 للمطور في الأيزوبروبانول) لمدة 20 دقيقة. بمجرد أن يصبح النمط مرئيا ، اشطف القطع بكحول أيزو بروبيل النقي (IPA) وجففها برفق باستخدام غاز النيتروجين (14 رطل / بوصة مربعة).
      تنبيه: استخدم بيئة جيدة التهوية لهذه المعالجة الكيميائية لتجنب التعرض البشري. استخدم الضوء الأبيض فقط بعد تطوير الميزات وشطفها باستخدام IPA.
    12. احتفظ بقطع السيليكون في مجفف مع توجيه السطح المطلي لأعلى. قم بتعريض القطع لأبخرة السيلان عن طريق سكب 50 ميكرولتر من ثلاثي كلورو النقي (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silane على كوب بلاستيكي صغير أو شريحة زجاجية. ضع الكوب / الشريحة داخل مجفف واحتضانها لمدة 2 ساعة.
      تنبيه: تجنب التعرض المباشر لبخار السيلان. استخدم دائما غرفة محكمة الغلق لمعالجة بخار السيلان.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين قطع السيليكون المطورة لمدة 1-2 أيام قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
  2. تصنيع رقاقة PDMS
    1. اصنع PDMS في كوب بلاستيكي عن طريق خلط قاعدة المطاط الصناعي مع عامل المعالجة بنسبة 10: 1. اخلطي المحتويات جيدا عن طريق التحريك المستمر لمدة 3 دقائق. سيخلق الخلط الكثير من فقاعات الهواء في مزيج PDMS.
    2. قم بإزالة غاز PDMS المزيج في مجفف لمدة 30 دقيقة لإزالة جميع فقاعات الهواء.
      تنبيه: تأكد من إزالة فقاعات الهواء من مزيج PDMS قبل سكبها على الميزات لأن الفقاعات يمكن أن تسبب أجهزة معيبة وغير وظيفية.
    3. ضع رقائق السيليكون مع طبقة التحكم (النمط 2) في طبق بتري. صب برفق طبقة خلط PDMS بسمك 5 مم على قطعة السيليكون لتجنب أي تشكيل فقاعة.
    4. قم بإزالة مزيج PDMS في مجفف لإزالة الفقاعات الإضافية التي تتشكل أثناء عملية صب PDMS.
    5. ضع رقاقة السيليكون مع طبقة التدفق (النمط 1) على ظرف الدوار مع تطبيق ضغط فراغ 200-500 mTorr لتثبيت الرقاقة. صب ~ 1 مل من PDMS على رقاقة السيليكون وقم بتغطيتها باستخدام طبقة تدور عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان متبوعة ب 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية للحصول على طبقة سميكة ~ 80 ميكرومتر.
    6. اخبز رقاقتي السيليكون مع PDMS المطلي بالدوران وطبقات PDMS المصبوبة عند 50 درجة مئوية في فرن حراري بالهواء الساخن لمدة 6 ساعات. بعد الخبز ، انتظر حتى تبرد القطع في درجة حرارة الغرفة.
    7. اقطع طبقة PDMS بسمك 5 مم من قطعة السيليكون حول طبقة التحكم (النمط 2) باستخدام شفرة حادة وقشرها من ركيزة السيليكون.
    8. قم بثقب فتحتين بقطر ~ 1 مم باستخدام مثقاب هاريس في خزان كتلة PDMS لتوصيل قناة التثبيت ومداخل قناة العزل بخطوط الغاز لانحرافات غشاء PDMS.
    9. ضع قطعة السيليكون مع طبقة PDMS المطلية بالدوران على النمط 1 (طبقة التدفق) ، مع توجيه السطح المطلي ب PDMS لأعلى ، على صينية بلاستيكية. احتفظ بكتلة PDMS المثقوبة بالنمط 2 (طبقة التحكم) على الدرج بحيث يكون الجانب المصبوب متجها لأعلى.
    10. احتفظ بالدرج البلاستيكي داخل منظف البلازما وعرض سطحي PDMS لبلازما هواء 18 واط لمدة 2 دقيقة تحت فراغ منخفض (200-600 mTorr). ضع الفراغ حتى تتحول الغرفة إلى اللون البنفسجي الفاتح. نفذ هذه الخطوة تحت الإضاءة المنخفضة لرؤية تغير لون البلازما.
    11. أخرج الكتلتين المعالجتين بالبلازما واربط الكتل برفق عن طريق الضغط على الأسطح المعالجة بالبلازما للنمطين 1 و 2 معا. تخبز الأنماط المستعبدة عند 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في فرن حراري بالهواء الساخن.
    12. أخرج الجهاز المستعبدين من الفرن. اقطع الجهاز المستعبدين من رقاقة السيليكون بالنمط 1 والنمط 2 ، وقم بعمل ثقوب في خزانات مدخل ومخرج طبقة التدفق باستخدام أداة ثقب Harris.
    13. ضع كتلة PDMS المستعبدة بحيث تكون طبقة التدفق متجهة لأعلى على صينية بلاستيكية. احتفظ بغطاء زجاجي نظيف (# 1.5) على نفس الدرج. تعريض الكتل وغطاء الزجاج إلى 18 واط بلازما الهواء لمدة 2 دقيقة. اضبط ضغط الفراغ لرؤية غرفة بنفسجية.
      ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة في الإضاءة المنخفضة لرؤية تغير لون البلازما. لتنظيف غطاء الزجاج ، اغسله باستخدام IPA وجففه باستخدام غاز النيتروجين عند 14 رطل / بوصة مربعة.
    14. ضع كتلة PDMS المكشوفة للبلازما فوق غطاء الزجاج واخبز الهيكل المستعبدين في فرن على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. قم بتخزين الجهاز في غرفة نظيفة لأي تجربة مستقبلية.

2. PDMS غشاء فتيلة

  1. خذ الجهاز وضعه على مجهر مجسم وقم بتوصيل الأنابيب. قم بتوصيل الأنبوب المرن الصغير (القطر الداخلي ~ 5 مم ، القطر الخارجي ~ 8 مم) بخط غاز النيتروجين المضغوط في أحد طرفيه. قم بتوصيل موصل ثلاثي الاتجاهات على الطرف الآخر. سيتم توصيل الأنابيب 1 و 2 من الموصلات ثلاثية الاتجاهات بالمصيدة والأغشية العازلة ، على التوالي.
  2. قم بتوصيل أنبوبين مرنين صغيرين (القطر الداخلي ~ 1.6 مم ، القطر الخارجي ~ 5 مم) بمنفذي مخرج محبس ثلاثي الاتجاهات. قم بتوصيل الطرف الآخر من الأنبوبين بإبرة بطول 8 مم 18 جم.
  3. املأ طبقة التدفق بمخزن M9 باستخدام ماصة صغيرة عبر منفذ المدخل. املأ كلا الأنبوبين بماء DI من خلال النهاية المتصلة بالإبرة. أدخل الإبرتين في الثقوب المثقوبة ، وربط غشاء العزل والحصار ، على التوالي.
  4. افتح منظم غاز النيتروجين عند 14 رطل / بوصة مربعة وقم بتدوير الصمام ثلاثي الاتجاهات من الأنبوب 1 لدفع الماء إلى الجهاز عبر قنوات الموائع الدقيقة في طبقات التحكم وهي أغشية المصيدة والعزل.
  5. انتظر حتى يملأ الماء القناة دون وجود أي قطرة هواء في كلتا القناتين. بمجرد ملء القنوات بالكامل بالماء ، تعتبر القنوات جاهزة.
  6. حرر الضغط باستخدام محبس ثلاثي الاتجاهات بمجرد ملء القنوات بالماء وتجهيزها. يمكن أن يؤدي التحضير إلى فقاعات في طبقة التدفق ، وإزالة الفقاعات عن طريق تدفق وسائط إضافية عبر قناة التدفق.

3. C. صيانة وتزامن ايليجانس

ملاحظة: سلالات C. elegans: استخدمت الدراسة الجينات المحورة التالية PS3239 (dpy-20 (e1282) syIs49 IV [MH86p (dpy-20 (+) + pJB100 (ZMP-1::GFP)]) لتطور الفرج 32 ، jsIs609 (mec7p :: MLS (إشارة توطين مصفوفة الميتوكوندريا) ::GFP) 33 لتطوير الخلايا العصبية المستقبلة لمستقبلات اللمس (TRN) وتصوير نقل الميتوكوندريا ، و wdIs51 (F49H12.4::GFP + unc-119 (+)) لتتبع تطور PVD 34. تم اتباع بروتوكول الاستزراع والصيانة القياسي C. elegans 35.

  1. تنمو C. elegans على وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) لوحات بتري مع E. coli OP50 كمصدر للغذاء عند 22 درجة مئوية. حافظ على سلالات C. elegans عن طريق نقل عدد قليل من الخنثى بشكل متكرر أو تقطيع كمية صغيرة من الآجار مع عدد قليل من الحيوانات إلى صفيحة NGM جديدة مع عشب OP50.
  2. بعد 3-5 أيام ، تحقق من لوحة NGM لنمو الحيوانات وبيض C. elegans. اجمع وانقل ما يقرب من 30 بيضة من طبق إلى طبق NGM طازج مع عشب OP50.
  3. لمزامنة الحيوانات للتصوير ، انقل جميع البيض غير المفقس من الطبق كل 2 ساعة إلى طبق طازج واحتفظ به عند 22 درجة مئوية. سوف يفقس ما يقرب من 15-20 بيضة على كل طبق.
  4. اختر الحيوانات بين 14-16 ساعة و 28-30 ساعة بعد الفقس لمراحل اليرقات 2 (L2) واليرقات 3 (L3) ، على التوالي. نقل الحيوانات إلى جهاز الموائع الدقيقة للتصوير. أضف الإمدادات الغذائية كما هو موضح في القسم التالي للحفاظ على الحيوان داخل الجهاز للنمو على المدى الطويل وتجارب التصوير.

4. نمو C. elegans داخل جهاز النمو والتصوير الموائع الدقيقة

  1. قم بتركيب جهاز موائع دقيقة للنمو والتصوير على مجهر مقلوب وعرض النمط 2 ، بعد توصيل أغشية العزل وغشاء التثبيت ، بتكبير منخفض (4x أو 10x). تأكد من ملء القنوات بالماء المقطر النظيف.
  2. تحضير محلول جديد سعة 1 لتر من وسط S باستخدام 10 مل من 1 M سترات البوتاسيوم درجة الحموضة 6.0 ، 10 مل من محلول المعادن النزرة ، 3 مل من 1 M CaCl2 ، 3 مل من 1 M MgSO4. تحضير الحل في ظل ظروف معقمة. لا الأوتوكلاف المتوسطة S.
  3. املأ قناة التدفق بوسائط النمو (S المتوسطة) قبل 10 دقائق من التجربة. تجنب أي فقاعات هواء في قناة التدفق. تدفق وسيط إضافي إذا لزم الأمر لإزالة فقاعات الهواء.
  4. اختر حيوانا واحدا من مرحلة النمو المطلوبة من لوحة NGM في 10 ميكرولتر من وسط S باستخدام ماصة دقيقة وادفع الحيوان إلى قناة التدفق عبر فتحة المدخل.
  5. راقب موضع الحيوان في قناة التدفق باستخدام هدف تكبير منخفض. تدفق وسيط إضافي عبر المدخل أو المخرج لدفع الحيوان ووضعه داخل قناة التدفق المقيدة بين غشاءي العزل.
  6. افتح المحبس ثلاثي الاتجاهات لتطبيق ضغط 14 رطل لكل بوصة مربعة في قنوات العزل وادفع الأغشية لأسفل في قناة التدفق.
    ملاحظة: يغلق الغشاء جزئيا قناة التدفق ويقيد حركة الحيوانات إلى المنطقة الواقعة بين غشاءي العزل.
  7. استخدم مستعمرة واحدة من E. coli OP50 من صفيحة مخططة لتلقيح 250 مل من مرق L (2.5 جم باكتو تريبتون ، 1.25 جم خميرة باكتو ، 1.25 جم كلوريد الصوديوم في H2O). تنمو الثقافة الملقحة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
  8. حاصل 500 ميكرولتر من ثقافة OP50 في أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 1.5 مل وتخزين المخزون والقسمة لمدة أسبوعين عند 4 درجات مئوية.
  9. قم بتقطيع ثقافة OP50 عن طريق الطرد المركزي بمعدل 1.3 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإذابة الحبيبات ب 1 مل من وسط S الطازج (تخفيف 0.5x) وقم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 أيام. استخدم OP50 المخفف لتغذية C. elegans داخل أجهزة الموائع الدقيقة.
  10. اترك قطرة من وسط S أعلى خزانات المدخل والمخرج لتقليل تبخر الوسط S في قناة التدفق.
  11. خذ محلول OP50 المخفف في ماصة دقيقة 10 ميكرولتر. قم بإزالة الطرف الصغير المملوء بمحلول OP50 من الماصة واضغط على الطرف في خزان المدخل. ثم ضع طرف ماصة صغير آخر مع 10 ميكرولتر من محلول الطعام وأدخله في خزان المخرج.
  12. أغلق رأس الطرف بالضغط باستخدام إصبع لضمان استمرارية المحاليل الغذائية دون أي فجوة هوائية. قم بتغيير طرف الماصة الدقيقة بمحلول OP50 كل يوم لا يزيد عمره عن 3-4 أيام.
  13. املأ 20-30 ميكرولتر إضافية من محلول الطعام في كلا النصيحتين. أضف أو أزل محلول الطعام من وإلى طرف الماصة الدقيقة لضبط التدرج لدفع الحيوان في قناة التدفق ولضبط موضع الحيوان تحت غشاء الاصطياد للتصوير.
  14. راقب تدفق البكتيريا للتأكد من استمراره عبر أغشية العزل المغلقة جزئيا في قناة التدفق باستخدام صور المجال الساطع.
    ملاحظة: في حالة عدم تدفق البكتيريا ، قد تأكل الحيوانات البكتيريا المتاحة في قناة التدفق بين غشاءي العزل. في حالة عدم وجود بكتيريا أو عدم وجود تدفق في القناة ، استبدل طرفي الماصة الدقيقة عند المدخل والمخرج بأطراف ماصة جديدة مملوءة بإمدادات غذائية طازجة.

5. C. تجميد ايليجانس والتصوير

  1. C. تجميد elegans تحت غشاء الاصطياد
    1. حدد موقع واحد في قناة النمو بتكبير منخفض. اضبط ارتفاعات محلول الطعام في طرفي الماصة الدقيقة المتصلين بخزانات المدخل والمخرج. ادفع الحيوان في الاتجاه المطلوب باستخدام اختلافات الضغط الهيدروستاتيكي في قناة التدفق.
    2. ضع الحيوان في مركز غشاء الاصطياد وراقب سلوك السباحة باستخدام هدف تكبير منخفض (4x).
    3. أدر المحبس ثلاثي الاتجاهات لزيادة الضغط في قناة المصيدة ببطء. شل حركة الحيوان تحت غشاء المصيدة في وضع مستقيم على طول الجدار الحدودي لقناة النمو.
      تنبيه: تجنب محاصرة الحيوان عبر قناة التدفق في وضع الانحناء Z أو U. يؤدي هذا إلى ضغط جسم الحيوان بضغط أكبر ويسبب ضررا دائما لصحته.
  2. تصوير C. elegans وإطلاقها من الغشاء
    1. احمل الجهاز وقم بتحميله على مرحلة المجهر. قم بإعداد مجهر مقلوب في إعدادات التصوير المطلوبة مع جميع المكونات البصرية الضرورية (الهدف ، ومصدر الضوء ، ومرشحات التألق ، وكاشف) للمجال الساطع عالي الدقة ، أو تباين التصوير التفاضلي (DIC) ، أو التصوير الفلوري (الشكل التكميلي 1).
    2. احصل على صورة مضان بفاصل زمني واحد أو عدة صور لالتقاط الأحداث الخلوية وشبه الخلوية.
    3. الحصول على صور مضان للخلايا العصبية C. elegans كدالة لتطورها باستخدام هدف 60x ، 1.4 فتحة عددية (NA) ، ليزر بطول موجة 488 نانومتر مع طاقة ليزر 7٪ -10٪ ، كاميرا CCD ، على مجهر قرص دوار. قم بإجراء تصوير الفاصل الزمني باستخدام البرنامج المزود بالمجهر واحصل على صور بسرعة 4 إطارات في الثانية (الشكل التكميلي 1).
    4. بعد الحصول على الصور ، حرر ضغط الاصطياد وراقب حركة الحيوان بتكبير منخفض - 4x و 10x. حافظ على تقييد الحيوان داخل المنطقة المحددة عن طريق عزل الأغشية (أبقى أقل من 14 رطل / بوصة مربعة طوال التجربة).
    5. اضبط حجم محلول الطعام في طرفي الماصة الدقيقة لمواصلة تدفق الطعام البطيء المدفوع بالجاذبية في قناة النمو. يتم الحصول على تدفق الطعام هذا عن طريق ضبط مستويات المحاليل الغذائية في الماصات الدقيقة عند المدخل والمخرج (عادة فرق الارتفاع 1-5 مم).
    6. تصور التدفق تحت مجال ساطع من نمط تدفق البكتيريا في قناة النمو.
      ملاحظة: في حالة عدم وجود تدفق ، يأكل الحيوان بكتيريا OP50 المتاحة ، وتظهر القناة واضحة ، ويتضور الحيوان جوعا على مدى بضع ساعات. عادة ما يصاب الحيوان الجائع بتألق ذاتي عالي ، يمكن ملاحظته بسهولة عند الحصول على صور مضان بفاصل زمني. مثل هذه الأحداث لها آثار ضارة على فسيولوجيا الحيوان وتم تجنبها في التجارب.
    7. كرر الخطوات 5.2.1-5.2.3 بعد فاصل زمني محدد مسبقا للحصول على صور مضان / مدينة دبي للإنترنت / المجال الساطع لنفس الفرد في نقاط زمنية متعددة.
    8. بعد الحصول على الصور في نقاط زمنية متعددة مرغوبة من نفس الحيوان الفردي ، حرر ضغط العزل والمحاصرة. اغسل القناة بمخزن M9 وادفع الحيوان عبر خزان المدخل. استرجع الحيوان من الخزان وضع الحيوان على طبق NGM جديد لمزيد من المراقبة الصحية.
    9. اغسل القناة بالمخزن المؤقت M9 عدة مرات لإزالة البكتيريا. شطف قناة التدفق مع 70 ٪ من الكحول الإيثيلي (المخفف في الماء المقطر). جفف القنوات عن طريق دفع الهواء باستخدام حقنة. قم بتخزين الجهاز في مكان جاف خال من الغبار للاستخدام المتكرر في المستقبل.
  3. تحليل الصور والإحصاءات
    1. استخدم برنامج FIJI ImageJ لتحليل الصور. افتح صور tiff لصور الفاصل الزمني PVD من wdIs51 في فيجي ImageJ. استخرج أفضل المستويات من مكدس طائرات z التي تعرض العمليات الأساسية عن طريق تحديد علامة التبويب صورة > مكدسات > مشروع Z.
    2. افحص سلسلة الصور بأكملها وابحث عن إطارات صور محددة تغطي بنجاح العمليات العصبية بأكملها باستخدام أقسام متداخلة من إطارات صور الحيوانات. حدد المكون الإضافي > تحليل عداد الخلايا > من شريط أدوات فيجي. سيؤدي ذلك إلى فتح نافذة لترقيم الفروع المختلفة والاحتفاظ بعدد كل خلية عصبية مختارة.
    3. حدد تهيئة عدادات > > Type1، ثم حدد الفروع الثانوية. ثم حدد النوع 2 ووضع علامة رباعي ، انقر فوق النتائج نافذة تعرض أعداد جميع الفروع (الشكل التكميلي 2). ستعرض هذه الطريقة الفروع التي تم حسابها بالفعل.
    4. افتح الصورة المتداخلة التالية وعد الفروع المتبقية. ستمنع هذه العملية العد المزدوج وتضمن حساب كل عملية. تحديد وحساب العدد الإجمالي للفروع الأولية الموجودة في المراحل اليرقية المبكرة من C. elegans. إجراء تحليل مماثل للصور للعمليات الثانوية والرباعية في الحيوانات الأكبر سنا.
      ملاحظة: يظهر البالغون العديد من العمليات التي تعصب عضلات جدار الجسم ويمكن أن يكون من الصعب عدها. تأكد من حساب كل عملية مرة واحدة فقط.
    5. احسب المسافة بين أجسام خلايا PVD في wdIs51 عن طريق رسم خط مجزأ من جسم خلية PVD (CB) إلى PVC CB. بالنسبة لحيوانات المرحلة 4 (L4) ، تكون أجسام الخلايا متباعدة وليست في نفس الإطار عند تصويرها بهدف 60x.
    6. حدد الصور المتداخلة من المكدس لتغطية طول الحيوان بالكامل من الرأس إلى الذيل باستخدام علامة تبويب الصورة > مشروع Stacks > Z من ImageJ. ارسم خطوطا مجزأة على طول العملية العصبية بين PVD و PVC CBs.
    7. قم بقياس أطوال كل الخطوط المجزأة باستخدام ImageJ > تحليل > قياس. أضف أطوال جميع الأجزاء لحساب المسافة الإجمالية بين PVD و PVC CBs لكل نقطة زمنية.
    8. بالنسبة لطول الخلايا العصبية ل TRNs في jsIs609 ، قم بتحميل الصور في فيجي. ارسم خطا مجزأ على طول الأنابيب الدقيقة الجانبية الخلفية (PLMs ؛ مرئية مع GFP القابل للذوبان) من جسم الخلية إلى النقطه الوسطى للميتوكوندريون الأول. احسب طول الخط لقيمة المسافة الأولى.
    9. ارسم خطا مجزأ من مركز الميتوكوندريا الأول إلى الثاني. كرر هذه العملية لكل زوج من الميتوكوندريا حتى نهاية طول العملية العصبية. أضف كل الأطوال لحساب إجمالي طول العملية العصبية.
    10. لتحليل نسب الخلية ، قم بتحميل جميع صور الفرج في فيجي واستخرج أفضل صورة تركيز للخلايا من صور الفاصل الزمني لطائرات z المتعددة.
    11. تمثيل البيانات كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (SEM). احسب الدلالة الإحصائية باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه لأكثر من عينتين أو اختبار t لعينتين لزوج من العينات. تشير إلى الأهمية بالقيمة p < 0.05 (*) ، والقيمة p < 0.005 (**) ، والقيمة p > 0.05 (ns ، ليست مهمة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

توصيف الجهاز: يتكون جهاز النمو والتصوير من طبقتين PDMS مرتبطتين معا (الشكل 1) باستخدام رابطة بلازما لا رجعة فيها. تسمح لنا طبقة التدفق (النمط 1) التي يبلغ طولها 10 مم وارتفاعها 40 ميكرومتر أو 80 ميكرومتر بزراعة الحيوان في الثقافة السائلة (الشكل 1 أ). تحتوي طبقة الاصطياد (النمط 2) على غشاء بعرض 2 مم (الشكل 1B) لشل حركة الحيوان للتصوير عالي الدقة. يخلق قناع طبقة الاصطياد أيضا زوجا من أغشية العزل لتقييد حركة الحيوانات داخل قسم من قناة التدفق بين نقاط زمنية متتالية للتصوير. تم تكييف غشاء الملاءمة للجهاز من جهاز التصوير السابق3. يتضمن الجهاز الحالي (الشكل 1C ، L) إضافة غشاء عزل وزيادة في عرض غشاء الاصطياد إلى 2 مم من أجل التثبيت الفعال لنفس الحيوان عبر نقاط زمنية متعددة.

لاختبار الجهاز ، تم ملء الماء المقطر النظيف في قنوات الموائع الدقيقة التي تربط أغشية الاصطياد (الشكل 1D ، E ، والشكل التكميلي 3) وضغطه باستخدام غاز النيتروجين 14 رطل لكل بوصة مربعة ، ويستخدم أيضا لمحاصرة تحت غشاء PDMS بسمك 2 مم (الشكل 1H ، K ، L). تم اختيار واحد من لوحة NGM باستخدام ماصة دقيقة وتحميلها في قناة التدفق (الشكل 1F). امتلأت قناة النمو بالبكتيريا المعاد تعليقها في وسائط S (الشكل 1F ، G ، I ، J). تم الحفاظ على تدفق مستمر طوال مدة التصوير عن طريق ضبط ارتفاعات الوسائط في أطراف الماصة المتصلة بمدخل ومخرج الجهاز أثناء مراقبة الحيوان في قناة التدفق بين غشائي العزل. تم ملء محلول OP50 الطازج في أطراف الماصة الدقيقة يوميا لضمان مصدر غذائي صحي للحيوان داخل القناة الدقيقة. يضمن مصدر الغذاء الطازج ومواد PDMS القابلة للنفاذ للغاز إمدادا كافيا بالأكسجين داخل القناة الدقيقة30,29. تم تتبع نمو الحيوانات في الجهاز باستخدام علامات أو علامات خاصة بالخلية تظهر نسب الخلية أو أنماط التعبير الخلوي المتغيرة أثناء التطور. تم تجميد الحيوانات تحت غشاء الاصطياد باستخدام غاز النيتروجين 14 رطل لكل بوصة مربعة وعقد الديدان في وضع مستقيم على طول جدار القناة. نما الحيوان بشكل أبطأ داخل قناة الموائع الدقيقة مقارنة بلوحة NGM23.

دراسة نسب الخلايا باستخدام جهاز التصوير طويل المدى: لتقييم تطور C. elegans داخل جهاز الموائع الدقيقة ، قمنا بتنمية سلالة PS3239 (ZMP-1::GFP)32 مع إمدادات غذائية ثابتة لتتبع تطور الفرج في نقاط زمنية مختلفة من نموها. يرمز ZMP-1 لميتالوبروتياز الزنك ويعبر في خلية المرساة في المرحلة L3 ، وفي خلايا vulD و vulE في المرحلة L4 ، وفي vulA في اليوم الأول (1D) الحيوانات البالغة (الشكل 2A). تمثل التغيرات في نمط التعبير مثالا على تنظيم الجينات الزمنية حيث يتم التعبير عن نفس الجين في خلايا مختلفة في مراحل مختلفة من التطور. لمراقبة تطور الفرج ، تم تجميد الحيوان أولا ثم تم تصوير منطقة الفرج عبر مستويات z متعددة كل 8-10 ساعات من L3 فصاعدا حتى مراحل البلوغ. يتم التعبير عن ZMP-1::GFP في خلايا فرجية مختلفة وفقا لمرحلة النمو (الشكل 2 ب). تظهر صور التألق عالية الدقة لخلايا الفرج من الحيوانات التي تنمو داخل جهاز الموائع الدقيقة نموا طبيعيا للفرج وتعبير ZMP-1::GFP وتوطينه مشابه للتقارير السابقة32.

تتبع تطور الخلايا العصبية باستخدام جهاز النمو والتصوير على المدى الطويل: لإثبات استخدام الجهاز للتصوير دون الخلوي من فردي ، تم رصد تطور اثنين من الخلايا العصبية الحسية الميكانيكية PVD و TRNs. تم استخدام سلالة NC1686 التي تعبر عن wdIs51 التي تعبر عن GFP في الخلايا العصبية PVD34,36. تظهر كل خلية عصبية PVD بنية تغصنية متفرعة تشبه الشمعدان تتكون من عمليات أولية (PP) وثانوية (SP) وثلاثية (TP) ورباعية (QP) عند L2 (14-16 ساعة) ، أواخر L2 (20-22 ساعة) ، L3 (24-26 ساعة) ، و L4 (36-42 ساعة) مراحل تنموية ، على التوالي (الشكل 3). جسم خلية PVD موجود خلف الفرج. يرسل محورا عصبيا واحدا وعمليتين تغصنيتين أساسيتين تؤديان إلى ظهور SP و TP ، مما يؤدي بدوره إلى ظهور فروع تغصنية QP تعصب عضلات جدار الجسم. تظهر المراحل المتأخرة L3 و L4 تشجيرا عاليا37,34. قمنا بزراعة NC1686 مفردة داخل جهاز الموائع الدقيقة وأطعمناها باستمرار بالطعام البكتيري. تم تجميد الحيوانات خلال مرحلة L2 حتى 1D من التطور وتم تصوير الخلايا العصبية PVD بشكل متكرر كل 8-12 ساعة باستخدام هدف زيت 60x و 1.3 NA لحساب عدد فروع SP و TP و QP في ثلاثة أبعاد. زاد مدى التفرع أثناء التطوير كما هو موضح في الشكل 3 ب. زادت أعداد SP و QP في مراحل مختلفة من تطور الدودة مع تقدم العمر (الشكل 4 أ) كما شوهد في الدراسات السابقة37. أظهرت L2 10 ± 3.8 (ن = 9) SPS ولكن لا يوجد QP ، عند قياسها باستخدام الجهاز (الشكل 4A). وضعنا C. elegans في قطرة من 3 mM ليفاميزول ، وهو مخدر يسبب تقلص عضلات جدار الجسم والشلل ، لتقليل الآثار الضارة على نقل العضيات مع تقليل حركات الحيوانات والتسبب في شلل كاف ، مطلوب للتصوير عالي الدقة 3,4. لم تكن قيم SP (4 ± 1.6 ، n = 25 ، p = 0.15) مختلفة بشكل كبير عند قياسها من الحيوانات ذات المراحل المماثلة التي نمت على ألواح NGM وتم تصويرها باستخدام 3 mM levamisole على شريحة أجار (الشكل 4B). تشير البيانات إلى أن تثبيت الجهاز يتيح تصويرا عالي الدقة للبنى العصبية المعقدة ولا يؤثر على تطورها. تحتوي المرحلة L3 على عدد صغير من QP يزداد عددها مع التطور. أظهر 1D البالغون 67 ± 2.8 QPs (ن = 5) في الحيوانات المزروعة في الجهاز. أظهرت الدراسات السابقة تكوين وتراجع عمليات PVD أثناء التطوير المعروفة باسم تجنب الذات ، حيث تقلل من أعداد فروعها38. يمكن أن يكون الانخفاض في SP عند 51 ساعة (1D) بعد الفقس نتيجة لمثل هذه التراجعات. أظهرت الحيوانات التي تنمو على ألواح NGM وتم تصويرها باستخدام 3 mM levamisole اتجاها مشابها لعدد المتفرعة لمراحل التطور المماثلة (الشكل 4A ، B). علاوة على ذلك ، تزداد المسافة بين جسمي خلية PVC ، أحدهما موجود في الذيل والثاني موجود بالقرب من الفرج ، مع تحركهما بعيدا في الحيوانات المزروعة في الجهاز أو تلك التي تزرع على ألواح NGM (الشكل 4C ، D). طوال عملية التصوير ، ظلت الحيوانات بصحة جيدة ويمكنها وضع البيض حتى بعد تجميد الحيوانات تحت الغشاء بشكل متكرر خلال هذه الفترة الطويلة.

باستخدام هذا الجهاز ، تمكنا من شل حركة الحيوان في نفس الاتجاه وتصوير الخلايا العصبية المتطابقة وهندستها بدقة عالية حتى مع تعبير GFP الخافت. لإثبات فائدة تقنية النمو والشلل لدينا ، تم تصوير تطوير TRNs من L3 إلى البالغين باستخدام jsIs609 (mec-7p :: MLS :: GFP). توجد TRNs الخلفية في الجانب الجانبي من الجسم وتسمى PLMR و PLML والتي تتوافق مع الجانبين الأيمن والأيسر للحيوان. قمنا بتصوير نفس الحيوانات التي تنمو في رقاقة الموائع الدقيقة وشل حركتها على فترات 12-14 ساعة. يمثل المونتاج العملية العصبية PLMR بأكملها في نقاط زمنية متتالية تسلط الضوء على كل من الميتوكوندريا والعملية العصبية (الشكل 5 أ). تم حساب إجمالي طول العملية العصبية ووجد أنه يزداد مع ميل 10.4 ميكرومتر لكل ساعة (الشكل 5B). يتفق معدل الزيادة هذا في طول العملية العصبية مع تقرير سابق ~ 10 ميكرومتر / ساعة18،31،39،40،41. لاحظنا أيضا إضافة ميتوكوندريا جديدة في عملية النمو والتغيير في موضع نقطة الفرع المشبكي فيما يتعلق بجسم الخلية كما ورد سابقا23.

Figure 1
الشكل 1: شريحة موائع دقيقة بسيطة لنمو وتصوير المطثية الإيليجانية على المدى الطويل. (أ) تتكون طبقة التدفق من قناة موائع دقيقة بطول 10 مم (النمط 1) في طبقة PDMS رقيقة. (ب) تتكون طبقة الملائمة من قناة تثبيت بسمك 2 مم وزوج من قنوات العزل الرقيقة في طبقة PDMS السائبة. (ج) يتم ربط طبقتي PDMS معا مع غطاء زجاجي رقيق لصنع الجهاز. (د، ه) تمتلئ قنوات المحاصرة والتحكم في العزل بالماء منزوع الأيونات (DI) ، تحت غاز النيتروجين المضغوط (N2). (و) يتم اختيار C. elegans المتزامنة مع العمر من لوحات NGM وتحميلها داخل طبقة التدفق الخاصة بالجهاز. (ز) يتم توفير الطعام باستخدام طرفين من أطراف الماصة الدقيقة في خزانات المدخل والمخرج. (ح) الحيوانات حرة في التحرك داخل قناتي العزل ومحاصرة تحت غشاء التثبيت. (ط) صورة لجهاز النمو والتصوير مع إمدادات الغذاء من خلال اثنين من أطراف الماصة الدقيقة. (ي، ك) صور ل C. elegans تتحرك بحرية وتجمد داخل قناة الموائع الدقيقة. شريط المقياس هو 1 مم (I) و 200 ميكرومتر (J ، K). (L) رسم تخطيطي للمقطع العرضي للجهاز يوضح ارتفاعات قناة التدفق (FC) وغشاء PDMS (M) وقناة التحكم (CC). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تتبع تعبير علامة الفرج في C. elegans النامية داخل الجهاز. (أ) رسم تخطيطي لخلايا الفرج يعبر عن ZMP-1::GFP في PS3239 أثناء النمو. تظهر إشارة GFP في خلية الربط في المرحلة L3 ، وفي خلايا vulD و vulE في المرحلة L4 ، وفي خلايا vulA في مرحلة 1D للبالغين. (ب) صور لحيوان PS3239 ينمو داخل رقاقة الموائع الدقيقة ويجمد كل 8-10 ساعات لالتقاط صور مضان لتعبير ZMP-1::GFP أثناء نمو الفرج من L3 و L4 ويوم واحد (1D) بالغ. الاختصارات: AC = خلية مرساة ، A = vulA ، D = vulD ، E = vulE. شريط المقياس هو 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تصوير wdIs51 C. elegans الفردية لتتبع تطور الخلايا العصبية PVD. (أ) رسم تخطيطي لنمو الخلايا العصبية PVD والتشجير التغصني من المرحلة L2 إلى المرحلة L4. تظهر الدائرة الخضراء جسم خلية PVD (CB ، السهم الأصفر). تظهر الزوائد الشجيرية ظهور العمليات الأولية (PP) في L2 من كل من الجانب الأمامي والخلفي من CB ، والعمليات الثانوية (SP) خلال أواخر L2 ، والعمليات الثلاثية (TP) في L3 ، والعمليات الرباعية (QP) خلال مراحل L4. ب: صور الخلايا العصبية PVD من الحيوانات التي تنمو داخل جهاز الموائع الدقيقة. (ج) صور الخلايا العصبية PVD من الحيوانات التي تزرع على صفيحة NGM وتجمد مع 3 mM ليفاميزول (ليف). شريط المقياس هو 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: مقارنة تطور PVD في الحيوانات المزروعة بالجهاز والحيوانات المزروعة على ألواح NGM. (أ) متوسط عدد العمليات الثانوية (SP) والعمليات الرباعية (QP) من نفس الحيوانات التي تنمو داخل جهاز الموائع الدقيقة. يتم حساب القيم في 16 ساعة (L2) و 24 ساعة (L3) و 36 ساعة (أوائل L4) و 42 ساعة (أواخر L4) و 51 ساعة (1D بالغ). (ب) متوسط عدد SP و QP من مجموعة مختلفة من الحيوانات التي تنمو على ألواح NGM وتخدير مع 3 mM ليفاميزول. (ج) متوسط الفصل بين جسمي الخلايا العصبية PVD من نفس الحيوان الذي ينمو في جهاز الموائع الدقيقة. (د) متوسط الانفصال عن مجموعات مختلفة من الحيوانات التي تنمو على ألواح NGM وتخدير 3 مليمول ليفاميزول. البيانات ممثلة كمتوسط ± SEM (n ≥ 10 ل 3 mM levamisole و n ≥ 6 للحيوانات التي يجمد الجهاز). يتم حساب الدلالة الإحصائية بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه ويرمز لها بالقيمة p < 0.05 (*) ، والقيمة p < 0.005 (**) ، والقيمة p > 0.05 (ns). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: تصوير عالي الدقة للخلايا العصبية المستقبلة لمستقبلات اللمس (TRNs) من الحيوانات التي تنمو داخل جهاز الموائع الدقيقة. (أ) مونتاج العمليات العصبية من واحد تم تصويره في أوقات مختلفة. يتم تسمية جسم الخلية (CB ، السهم) ، ونقطة الفرع المشبكي (BP ، رأس السهم) ، وطرف الخلية العصبية (الطرف ، السهم لأعلى). يتم تتبع العملية العصبية وموضع كل ميتوكوندريون يدويا باستخدام فيجي. شريط المقياس هو 10 ميكرومتر. (ب) متوسط طول العملية العصبية في نقاط زمنية مختلفة للتصوير. البيانات ممثلة كمتوسط ± SEM (ن = 8). يتم حساب الدلالة الإحصائية باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه ويرمز لها بالقيمة p < 0.005 (**) والقيمة p > 0.05 (ns). تتناسب معادلة الانحدار مع ميل 10.4 ميكرومتر استطالة العملية العصبية في الساعة ، R2 = 0.9425. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: لقطات شاشة لإعدادات المجهر للتصوير الفلوري ل C. elegans. (أ) تعرض لوحة من برنامج تحليل الصور الأقسام المميزة لإعداد سرعة المسح ومجموعة المرشحات والهدف للتصوير. (ب) ثم يتم استخدام البرنامج لاختيار ليزر 488 نانومتر مع 7٪ من طاقة الليزر الكاملة. (ج) يمكن لبرنامج تحليل الصور التقاط إطار صورة واحد أو سلسلة من صور الفاصل الزمني وتخزينها للتحليل المستقبلي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: لقطات شاشة لبرنامج فيجي توضح خطوات التحليل لحساب فروع PVD في wdIs51 . (A) يعرض صورة PVD المفتوحة في برنامج Fiji ImageJ والارتباط بالمكون الإضافي لعداد الخلايا. (ب) نافذة عداد الخلية لتهيئة العداد لصورة. (ج) اختيار عدادات لتمييز الفروع المضمنة وتجنب العد المتعدد. (د) نافذة النتائج التي تبين العدد الإجمالي للفروع تحت كل فئة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: رسم تخطيطي لجهاز النمو والتصوير. يتم إدخال طرفين من أطراف الماصة الدقيقة ، المملوءة بأحجام مختلفة من محلول غذائي للبكتيريا (أصفر) ، في لكمات مدخل ومخرج قناة التدفق في الطبقة السفلية. يؤدي الاختلاف في ارتفاعات المحاليل الغذائية في الأطراف إلى تدفق المحلول داخل القناة والذي بدوره يزود الحيوان بالبكتيريا لنموه. تمتلئ قنوات الاصطياد والعزل (الزرقاء) بالماء المقطر وتضغط باستخدام إمداد غاز النيتروجين (المحدد عند 14 رطل / بوصة مربعة). قناة العزل متصلة دائما ب 14 رطل / بوصة مربعة. يتم تبديل الضغط على غشاء الاصطياد بين 0 (الحيوان حر في الحركة والتغذية) و 14 رطل / بوصة مربعة (يتم تجميد الحيوان للتصوير عالي الدقة) باستخدام موصل ثلاثي الاتجاهات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الورقة ، تم وصف بروتوكول لتصنيع واستخدام جهاز الموائع الدقيقة البسيط لزراعة C. elegans مع إمدادات غذائية ثابتة وتصوير عالي الدقة لحيوان واحد أثناء تطوره. عملية التصنيع هذه بسيطة ويمكن إجراؤها في بيئة غير معقمة. تعد البيئة الخالية من الغبار أمرا بالغ الأهمية أثناء خطوات التصنيع. قد يؤدي وجود جزيئات الغبار إلى اتصال غير صحيح بين سطحي الترابط ، مما يؤدي إلى ضعف الترابط وتسرب الجهاز أثناء تطبيق الضغط العالي أثناء تجميد C. elegans. من بين جميع الأجهزة المصنعة ، 95٪ من الأجهزة مناسبة للتجارب. يفشل عدد قليل من الأجهزة (5٪) بسبب الترابط غير المناسب أثناء التصنيع أو الاستخدام. يمكن تقليل الفشل في الترابط عن طريق تنفيذ عملية التصنيع داخل غرفة نظيفة خالية من الغبار (> 1000 درجة) متوفرة في العديد من المؤسسات الأكاديمية حول العالم. لتنظيف الطعام البكتيري من قناة التدفق وتمكين إعادة استخدام الجهاز ، اغسل الجهاز عن طريق تدفق الكحول من خلاله بعد كل تجربة.

يوضح البروتوكول عملية تصنيع الطباعة الحجرية بتصميم بسيط يمكن تعديله بسهولة لمراحل وأحجام تطوير مختلفة من C. elegans. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف تصميم الجهاز هذا مع الكائنات الحية النموذجية الأخرى مثل الزرد وذبابة الفاكهة ، عن طريق زيادة أبعاد التدفق وطبقات الاصطياد3 لمراقبة مجموعة متنوعة من العمليات التنموية وشبه الخلوية. في هذا البروتوكول ، تم استخدام ارتفاعين مختلفين لقناة طبقة التدفق - 40 ميكرومتر و 80 ميكرومتر - للتثبيت الكامل وتتبع السمات الخلوية وشبه الخلوية في مراحل نمو مختلفة من C. elegans بما يتناسب مع أحجام أجسامهم. على سبيل المثال ، يبدأ التشجير الشجيري في الخلايا العصبية الحسية PVD في المراحل المبكرة L2 ويستمر حتى المرحلة L4. تم تصوير هذا في جهاز بطبقة تدفق عالية 40 ميكرومتر. نظرا لأن الخلايا العصبية PVD تشكل التشعبات التي تعصب عضلات جدار الجسم ، فإنها تتطلب تقسيما بصريا لتحديد العمليات في 3D. يتطلب التحليل الكمي للعرش المتغصنة تجميدا كاملا للحيوانات داخل الجهاز الذي يطابق قطر الجسم. ومع ذلك ، لمراقبة نمو الفرج ، تم استخدام ارتفاع 80 ميكرومتر من طبقة التدفق لتتبع سلالات الفرج. بالنسبة لطول TRNs وتصوير الميتوكوندريا ، قمنا بتصوير مراحل L2 إلى L4 باستخدام أجهزة بسمك طبقة تدفق 40 ميكرومتر. سيؤدي استخدام جهاز بارتفاع خاطئ إلى صعوبة في الشلل. على سبيل المثال ، ستسمح الحيوانات الصغيرة (L2 أو مراحل L3 المبكرة) داخل جهاز ارتفاع طبقة التدفق 80 ميكرومتر بتقليب الحيوانات داخل الجهاز وتظهر تجميدا غير مكتمل حتى بعد أن يكون غشاء الاصطياد تحت ضغط 14 رطل لكل بوصة مربعة. من ناحية أخرى ، لا تدخل الحيوانات ذات أقطار الجسم الكبيرة (بعد أواخر L4) بسهولة داخل جهاز بارتفاع طبقة تدفق 40 ميكرومتر. يمكن أن يؤدي محاصرة الحيوانات الكبيرة في أجهزة صغيرة تحت ضغط عال إلى إتلاف أجسامها. تطبيق الجهاز الحالي بطبقة تدفق 40 ميكرومتر محدود وغير مناسب للتصوير عالي الدقة لحيوانات مرحلة اليرقات المبكرة جدا (مثل المرحلة L1 التي تقل أعمارها عن 10 ساعات بعد الفقس) لأنها لا تجمد تماما تحت الغشاء. نظرا لصغر حجم الجسم ، تستمر اليرقات صغيرة الحجم في الحركة وأحيانا تهرب من الفخ عندما تكون متحمسة بضوء الليزر. بالنسبة لحيوانات المرحلة L1 ، يمكن للمرء إجراء مجال ساطع منخفض الدقة أو تصوير مضان باستخدام أهداف 4x أو 10x وأوقات تعرض قصيرة للكاميرا. كنهج بديل ، سيكون من الضروري وجود جهاز طبقة تدفق جديد بارتفاع < 20 ميكرومتر لشل حركة اليرقات الصغيرة C. elegans.

يمكن أن يؤدي تتبع الظواهر التنموية في نفس الحيوان على مدى فترة زمنية طويلة باستخدام التصوير الفلوري عالي الدقة إلى زيادة التألق الذاتي. يتطلب كل اختبار تصوير بفاصل زمني تحسين شدة الإثارة ، ووقت التعرض ، والفاصل الزمني للتصوير ، ووقت تعافي الحيوانات ، وجودة الطعام للحصول على معلومات تنموية ذات صلة من الناحية الفسيولوجية من دراسات C. elegans. لقد اخترنا > فترة زمنية مدتها 3 ساعات للدراسات التنموية عند استخدام الحيوانات من مراحل L4 فصاعدا. الجهاز قادر على الحصول على صور أكثر تكرارا (كل 5-10 دقائق لبضع ساعات) أو إطارات متعددة في الثانية (لمدة < 1 ساعة) لدراسة العمليات الديناميكية الأخرى مثل نقل العضيات وتوزيعها في الخلايا العصبية C. elegans 3,23. يتطلب اصطياد وتصوير مراحل النمو المبكرة مراقبة أكثر دقة لأن الاصطياد المتكرر بفترات زمنية قصيرة دون الشفاء التام يمكن أن يؤثر على صحتهم. خلال التجارب ، وجد أن الحيوانات التي تتطلب ضغطا عاليا لنقلها إلى طبقة التدفق تظهر صحة سيئة والمزيد من التألق الذاتي بمرور الوقت. تم تجنب الحيوانات ذات مضان الجسم المرتفع ، والمعروف أنها مرتبطة بمستوى إجهاد مرتفع ، لدراسات التصوير. للحفاظ على علم وظائف الأعضاء الجيد ، كانت الحيوانات محاصرة في وضع مستقيم مجاور لجدار القناة. تم تجنب شل حركة الحيوانات بجسمها عبر عرض القناة لأن الحيوانات تمرض بعد ضغط جسمها تحت ضغط 14 رطل لكل بوصة مربعة في هذا الوضع. للحفاظ على نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة أثناء التصوير المتكرر مع أهداف الزيت ، يجب تنظيف غطاء الغطاء بشكل صحيح بعد كل نقطة زمنية. بعد عناية خاصة أثناء عملية تصنيع الجهاز وتطبيقه ، يمكن إعادة استخدام نفس الأجهزة على مدار عدة جلسات تصوير.

يمكن أن يكون هذا الجهاز مفيدا للدراسات التي تستخدم الطفرات التي يمكن أن تكون حساسة للتخدير. يمكن للنهج المقدم القضاء على آثار التخدير الضارة على النمو وعلم وظائف الأعضاء لتسهيل ملاحظة العيوب المورفولوجية والوظيفية والسلوكية في الحيوانات على مدى فترة طويلة. الجهاز سهل التصنيع ويمكن إعداده في أي مختبر لمعالجة الأسئلة البيولوجية التنموية / الخلوية طويلة المدى في C. elegans التي تتطلب تصويرا متقطعا عالي الدقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.M. و S.P.K. هما مؤلفا براءة اختراع معلقة على جهاز نمو الموائع الدقيقة والتصوير (طلب براءة الاختراع رقم 640 / CHE / 2011).

Acknowledgments

نشكر مرفق التصوير CIFF ، NCBS لاستخدام المجاهر متحدة البؤر التي يدعمها DST - مركز تكنولوجيا النانو (No. SR/55/NM-36-2005). نشكر تمويل الأبحاث من DBT (SPK) ، CSIR-UGC (JD) ، DST (SM) ، DBT (SM) ، قرص الغزل المدعوم من DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK و Gautam Menon) ، ورقم منحة HHMI-IECS 55007425 (SPK). تم توفير سلالات HB101 و PS3239 و wdIs51 من قبل مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ، والذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية البحثية (P40 OD010440). صنع SPK jsIs609 في مختبر مايك نونت.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G needles Sigma-Aldrich, Bangalore, India Gauge 18
3-way stopcock Cole-Parmer WW-30600-02 Masterflex fitting with luer lock
CCD camera Andor Technology EMCCD C9100-13no
Circuit board film Fine Line Imaging, Colorado, USA The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven Meta-Lab Scientific Industries, India MSI-5
Coverslips Blue stat microscopic cover glass 22mm x 10Gms
Ethanol Hi media
Harris uni-core puncher 1mm Qiagen Z708801
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 440191
Hot plate  IKA RCT B S 22
Isopropanol Fisher Scientific 26895
KOH Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope ZEISS LSM 5 LIVE
Micropipette tips Tarsons 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1 Microchem SU8-2025 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2 Microchem SU8-2050 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas Local Supplier Commercial nitrogen gas Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution) Dow Corning Corporation, MI, USA  Sylgard curing solution curing agent
Petri plates Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
Razor and blades Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base) Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard 184 base elastomer base
Silicon tubes Fisher Scientific Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer University Wafer, MA, USA [100] orientation, 4-inch diameter Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater SPS-Europe B.V., The Netherlands SPIN 150
Spinning Disk microscope Perkin Elmer ultra-view VOX system CSU-X1-A3 N The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer Microchem, MA, USA SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 448931 Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp Oriel Instruments, Bangalore, India 200 Watt and collimated UV light source
Volocity software Perkin-Elmer Image analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435 (2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
  3. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), Copenhagen, Denmark. 372-385 (2011).
  4. Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
  5. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
  6. Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037 (2012).
  7. Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
  8. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  9. Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
  10. Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
  11. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
  12. Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).
  13. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  14. Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192 (2015).
  15. Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  18. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, Clifton, N.J. 159-179 (2015).
  19. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  20. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  21. Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
  22. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
  23. Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
  24. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  25. Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500 (2016).
  26. Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
  27. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
  28. Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
  29. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  30. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499 (2012).
  32. Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, Suppl 1 203-209 (2002).
  33. Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  34. Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
  35. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  36. Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), New York, N.Y. 1285-1288 (2010).
  37. Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
  38. Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
  39. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
  40. Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).
  41. Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 182 ، C. elegans ، رقاقة الموائع الدقيقة ، النمو على الرقاقة ، التصوير طويل المدى ، التصوير العصبي ، سلالة خلايا الفرج
شريحة موائع دقيقة بسيطة للنمو على المدى الطويل وتصوير <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S.… More

Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S. P. A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (182), e63136, doi:10.3791/63136 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter