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Bioengineering

Un chip microfluídico simple para el crecimiento a largo plazo y la obtención de imágenes de Caenorhabditis elegans

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63136
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,5, 2
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

Summary

El protocolo describe un diseño simple de chip microfluídico y una metodología de microfabricación utilizada para cultivar C. elegans en presencia de un suministro continuo de alimentos durante hasta 36 h. El dispositivo de crecimiento e imágenes también permite obtener imágenes intermitentes de alta resolución a largo plazo de procesos celulares y subcelulares durante el desarrollo durante varios días.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) ha demostrado ser un valioso sistema modelo para estudiar los procesos biológicos celulares y de desarrollo. La comprensión de estos procesos biológicos a menudo requiere imágenes a largo plazo y repetidas del mismo animal. Los largos tiempos de recuperación asociados con los métodos convencionales de inmovilización realizados en almohadillas de agar tienen efectos perjudiciales para la salud animal, por lo que es inapropiado obtener imágenes repetidas del mismo animal durante largos períodos de tiempo. Este documento describe un diseño de chip microfluídico, método de fabricación, protocolo de cultivo de C. elegans en chip y tres ejemplos de imágenes a largo plazo para estudiar los procesos de desarrollo en animales individuales. El chip, fabricado con polidimetilsiloxano y unido a un vidrio de cubierta, inmoviliza a los animales en un sustrato de vidrio utilizando una membrana elastomérica que se desvía con gas nitrógeno. La inmovilización completa de C. elegans permite obtener imágenes robustas de lapso de tiempo de eventos celulares y subcelulares sin anestesia. Una geometría de canal con una gran sección transversal permite al animal moverse libremente dentro de dos membranas de aislamiento parcialmente selladas que permiten el crecimiento en el canal con un suministro continuo de alimentos. Usando este simple chip, se pueden realizar imágenes de fenómenos de desarrollo como el crecimiento del proceso neuronal, el desarrollo vulvar y la arborización dendrítica en las neuronas sensoriales PVD, a medida que el animal crece dentro del canal. El chip de crecimiento e imágenes a largo plazo funciona con una sola línea de presión, sin válvulas externas, consumibles fluídicos de bajo costo y utiliza protocolos estándar de manejo de gusanos que pueden ser fácilmente adaptados por otros laboratorios que utilizan C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans ha demostrado ser un poderoso organismo modelo para estudiar la biología celular, el envejecimiento, la biología del desarrollo y la neurobiología. Ventajas como su cuerpo transparente, ciclo de vida corto, fácil mantenimiento, un número definido de células, homología con varios genes humanos y genética bien estudiada han llevado a C. elegans a convertirse en un modelo popular tanto para los descubrimientos de biología fundamental como para la investigación aplicada 1,2. Comprender los procesos biológicos y de desarrollo de las células a partir de la observación repetida a largo plazo de animales individuales puede resultar beneficioso. Convencionalmente, C. elegans se anestesia en almohadillas de agar y se obtiene una imagen bajo el microscopio. Los efectos adversos de los anestésicos sobre la salud de los animales limitan el uso de animales anestesiados para imágenes intermitentes repetidas y a largo plazo del mismo animal 3,4. Los avances recientes en las tecnologías microfluídicas y su adaptación para la captura sin anestesia de C. elegans con riesgos insignificantes para la salud permiten obtener imágenes de alta resolución del mismo animal durante un período de tiempo corto y largo.

Los chips microfluídicos han sido diseñados para C. elegans'5 cribado de alto rendimiento 6,7,8, captura y dispensación9, cribado de fármacos 10,11, estimulación neuronal con imágenes de alta resolución 12 e imágenes de alta resolución del animal 12,13,14. También se han desarrollado láminas microfluídicas ultrafinas para la inmovilización en portaobjetos15. Se han realizado estudios a largo plazo de C. elegans utilizando imágenes de baja resolución de animales que crecen en cultivo líquido para observar el crecimiento, la dinámica del calcio, los efectos de los medicamentos en su comportamiento16,17,18,19, su longevidad y el envejecimiento20. Se han realizado estudios a largo plazo con microscopía de alta resolución para evaluar el desarrollo sináptico21, la regeneración neuronal 22 y la adición mitocondrial23. Las imágenes de alta resolución a largo plazo y el rastreo del destino y la diferenciación celular se han realizado en dispositivos multicanal24,25. Varios eventos celulares y subcelulares ocurren en las escalas de tiempo de varias horas y requieren atrapar al mismo individuo en diferentes puntos de tiempo durante su desarrollo para caracterizar todos los pasos intermedios en el proceso para comprender la dinámica celular in vivo. Para obtener imágenes de procesos biológicos como la organogénesis, el desarrollo neuronal y la migración celular, el animal necesita ser inmovilizado en la misma orientación en múltiples puntos de tiempo. Anteriormente hemos publicado un protocolo para imágenes de alta resolución de C. elegans durante más de 36 h para determinar dónde se agregan las mitocondrias a lo largo de las neuronas receptoras del tacto (TRN)23.

Este documento proporciona un protocolo para establecer una metodología basada en microfluídica para imágenes repetidas de alta resolución. Este dispositivo, con un solo canal de flujo, es el más adecuado para imágenes repetidas de un solo animal por dispositivo. Para mejorar el rendimiento y la imagen de muchos animales a la vez, se pueden conectar múltiples dispositivos a la misma línea de presión pero con conectores separados de tres vías que controlan un solo animal en cada dispositivo. El diseño es útil para estudios que exigen imágenes de lapso de tiempo de alta resolución, como procesos de desarrollo postembrionario, migración celular, transporte de orgánulos, estudios de expresión génica, etc. La tecnología podría ser limitante para algunas aplicaciones, como la vida útil y los estudios de envejecimiento que requieren crecimiento paralelo e imágenes de muchos animales en etapa tardía. El elastómero de polidimetilsiloxano (PDMS) se utilizó para fabricar este dispositivo debido a su bioestabilidad26, biocompatibilidad 27,28, permeabilidad al gas 29,30 y módulo elástico sintonizable 31. Este dispositivo de dos capas permite el crecimiento de animales con suministro continuo de alimentos en un canal microfluídico y la captura de C. elegans individuales a través de la compresión de membrana PDMS utilizando gas nitrógeno. Este dispositivo es una extensión del dispositivo publicado anteriormente con la ventaja de crecer e imaginar el mismo animal en el microcanal bajo un suministro continuo de alimentos3. La red de membranas de aislamiento adicional y una membrana de captura de 2 mm de ancho permiten la inmovilización eficiente de los animales en desarrollo. El dispositivo se ha utilizado para observar el desarrollo neuronal, el desarrollo vulvar y la arborización dendrítica en neuronas PVD sensoriales. Los animales crecen sin efectos adversos para la salud en el dispositivo y pueden inmovilizarse repetidamente para facilitar la obtención de imágenes de eventos subcelulares en el mismo animal durante su desarrollo.

Todo el protocolo se divide en cinco partes. La Parte 1 describe la fabricación del dispositivo para el chip de crecimiento e imagen. La Parte 2 describe cómo configurar un sistema de presión para la deflexión de la membrana PDMS para inmovilizar y aislar C. elegans individuales. La Parte 3 describe cómo sincronizar C. elegans en una placa de medio de crecimiento de nematodos (NGM) para obtener imágenes del dispositivo. La Parte 4 describe cómo cargar un solo animal en el dispositivo y hacer crecer al animal dentro del dispositivo microfluídico durante varios días. La Parte 5 describe cómo inmovilizar a un animal individual en múltiples puntos de tiempo, capturar imágenes de alta resolución utilizando diferentes objetivos y analizar las imágenes usando Fiji.

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Protocol

1. Fabricación del dispositivo de crecimiento e imagen

  1. Fabricación de moldes SU8
    1. Diseñe patrones 1 (capa de flujo) y 2 (capa de control) utilizando formas rectangulares en un software de procesamiento de textos (o un software CAD de diseño asistido por computadora) e imprima las fotomáscaras con la ayuda de un trazador láser con un tamaño mínimo de característica de 8 μm en película basada en poliéster (Figura 1).
    2. Corte las obleas de silicio en trozos de 2,5 cm × 2,5 cm y límpielos con KOH al 20% durante 1 min. Enjuague las obleas con agua desionizada (DI). Utilice una oblea para el flujo y la capa de control.
      PRECAUCIÓN: KOH es corrosivo y debe manejarse con cuidado.
    3. Secar las piezas con gas nitrógeno comprimido de 14 psi seguido de deshidratación en una placa caliente a 120 °C durante 4 h. Antes de continuar con el siguiente paso, enfríe las dos piezas a temperatura ambiente.
    4. Tome una de las piezas de silicona y colóquela en el mandril de una recubridora de centrifugado y encienda la aspiradora para mantener la oblea en su lugar. En la pieza de silicio, coloque ~ 20 μL de hexametildisilano (HMDS) y cúbralo con el recubridor de centrifugado a 500 rotación por minuto (rpm) durante 5 s seguido de 3.000 rpm durante 30 s.
      PRECAUCIÓN: Este paso debe realizarse con luz amarilla. No utilice luz blanca en la habitación.
    5. Para obtener un espesor fotorresistente uniforme de ~40 μm (específico para la capa de flujo; adecuado para obtener imágenes de animales de la etapa larval temprana 1 a la etapa 3 (L1 - L3), cubra la oblea de silicio con ~ 1.5 ml de fotorresistencia-1 negativa usando una recubridora de centrifugado a 500 rpm durante 5 s seguida de 2,000 rpm durante 30 s.
    6. Repita los pasos 1.1.4 y 1.1.5 con la segunda oblea para obtener un espesor fotorresistente uniforme de ~40 μm específico para la capa de control.
    7. Alternativamente, para aumentar el grosor de la capa de flujo a ~80 μm para animales más viejos, cubra las obleas de silicio con ~1.5 ml de fotorresistencia-2 negativa usando el recubridor de centrifugado a 500 rpm durante 5 s seguido de 2,000 rpm durante 30 s. Este grosor es adecuado para la etapa L3 a animales adultos.
      PRECAUCIÓN: Sostenga las obleas de silicio por sus lados para evitar cualquier daño a las capas recubiertas de centrifugado. Mantenga las luces blancas apagadas durante este paso.
    8. Hornear las piezas de silicio recubiertas de fotorresistencia (para capas de flujo y control) en una placa caliente a 65 °C durante 1 minuto seguido de 95 °C durante 10 min. Enfríe las piezas horneadas a temperatura ambiente.
      NOTA: Las piezas de silicona horneadas se pueden almacenar durante un día antes de continuar con el siguiente paso. Almacenar en la oscuridad y no exponer a la luz blanca.
    9. Coloque piezas de silicona cocidas suavemente en la etapa de exposición del iluminador UV con la superficie recubierta de fotorresistencia frente a la lámpara UV. Exponga las dos piezas por separado a UV durante 15 s, utilizando una lámpara de 200 W, a través de una fotomáscara con patrones 1 y 2 para obtener capas de flujo y control, respectivamente.
      PRECAUCIÓN: Use gafas de seguridad y evite la exposición directa a la luz UV. No encienda la luz blanca en la habitación durante esta etapa.
    10. Hornea las dos piezas de silicona expuestas con la capa recubierta hacia arriba, a 65 °C seguido de 95 °C durante 1 min y 10 min respectivamente. Enfríe las piezas a temperatura ambiente antes de continuar con el siguiente paso.
    11. Desarrolle los patrones remojando las piezas de silicio en la solución reveladora fotorresistente (dilución 1:3 del revelador en isopropanol) durante 20 min. Una vez que el patrón sea visible, enjuague las piezas con alcohol isopropílico puro (IPA) y séquelas suavemente con gas nitrógeno (14 psi).
      PRECAUCIÓN: Utilice un ambiente bien ventilado para este tratamiento químico para evitar la exposición humana. Use luz blanca solo después de desarrollar las características y enjuagar con IPA.
    12. Mantenga las piezas de silicona en un desecador con la superficie recubierta hacia arriba. Exponga las piezas a vapores de silano vertiendo 50 μL de tricloro puro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano en un pequeño vaso de plástico o un portaobjetos de vidrio. Colocar la taza/portaobjetos dentro de un desecador e incubar durante 2 h.
      PRECAUCIÓN: Evite la exposición directa al vapor de silano. Utilice siempre una cámara sellada para el tratamiento con vapor de silano.
      NOTA: Si es necesario, las piezas de silicio desarrolladas se pueden almacenar durante 1-2 días antes de continuar con el siguiente paso.
  2. Fabricación de chips PDMS
    1. Haga PDMS en un vaso de plástico mezclando la base de elastómero con el agente de curado en una proporción de 10: 1. Mezclar bien el contenido revolviendo constantemente durante 3 min. La mezcla creará muchas burbujas de aire en la mezcla PDMS.
    2. Desgasifica la mezcla PDMS en un desecador durante 30 minutos para eliminar todas las burbujas de aire.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que las burbujas de aire se eliminen de la mezcla PDMS antes de verterla en las características, ya que las burbujas pueden causar dispositivos defectuosos y no funcionales.
    3. Coloque las obleas de silicio con la capa de control (patrón 2) en una placa de Petri. Vierta suavemente una capa de mezcla PDMS de 5 mm de espesor sobre la pieza de silicona evitando la formación de burbujas.
    4. Desgasifica la mezcla de PDMS en un desecador para eliminar burbujas adicionales que se forman durante el proceso de vertido de PDMS.
    5. Coloque la oblea de silicio con capa de flujo (patrón 1) en el mandril del spinner aplicando una presión de vacío de 200-500 mTorr para sostener la oblea. Vierta ~ 1 ml de PDMS en la oblea de silicio y cúbrala con una recubridora de centrifugado a 500 rpm durante 5 s seguido de 1,000 rpm durante 30 s para obtener una capa de ~ 80 μm de espesor.
    6. Hornear las dos obleas de silicio con el PDMS recubierto por centrifugado y verter las capas de PDMS a 50 °C en un horno de convección de aire caliente durante 6 h. Después de hornear, espere a que las piezas se enfríen a temperatura ambiente.
    7. Corte la capa PDMS de 5 mm de espesor de la pieza de silicio alrededor de la capa de control (patrón 2) con una cuchilla afilada y despegue del sustrato de silicio.
    8. Perfore dos orificios de ~ 1 mm de diámetro utilizando un perforador Harris en el depósito del bloque PDMS para conectar el canal de inmovilización y las entradas del canal de aislamiento a las líneas de gas para las deflexiones de membrana PDMS.
    9. Coloque la pieza de silicona con la capa PDMS recubierta de espín en el patrón 1 (capa de flujo), con la superficie recubierta de PDMS hacia arriba, en una bandeja de plástico. Mantenga el bloque PDMS perforado con el patrón 2 (capa de control) en la bandeja con el lado moldeado hacia arriba.
    10. Mantenga la bandeja de plástico dentro de un limpiador de plasma y exponga las dos superficies PDMS a plasma de aire de 18 W durante 2 minutos a bajo vacío bajo bajo vacío (200-600 mTorr). Aplique vacío hasta que la cámara se vuelva violeta brillante. Realice este paso con poca luz para ver el cambio de color del plasma.
    11. Saque los dos bloques tratados con plasma y únalos suavemente presionando las superficies tratadas con plasma de los patrones 1 y 2. Hornear los patrones unidos a 50 °C durante 2 h en un horno de convección de aire caliente.
    12. Saque el dispositivo unido del horno. Corte el dispositivo unido de la oblea de silicio con el patrón 1 y el patrón 2, y perfore los orificios en los depósitos de entrada y salida de la capa de flujo con el perforador Harris.
    13. Coloque el bloque PDMS unido con la capa de flujo hacia arriba en una bandeja de plástico. Mantenga un vaso de cubierta limpio (#1.5) en la misma bandeja. Exponga los bloques y el vidrio de la cubierta al plasma de aire de 18 W durante 2 min. Ajuste la presión del vacío para ver una cámara violeta.
      NOTA: Este paso debe hacerse con poca luz para ver el cambio de color del plasma. Para limpiar el vidrio de la cubierta, lávelo con IPA y séquelo con gas nitrógeno a 14 psi.
    14. Coloque el bloque PDMS expuesto con plasma en la parte superior del vidrio de la cubierta y hornee la estructura unida en un horno a 50 °C durante 2 h. Guarde el dispositivo en una cámara limpia para cualquier experimento futuro.

2. Cebado de membrana PDMS

  1. Tome el dispositivo y colóquelo en un microscopio estereoscópico y conecte los tubos. Conecte el tubo micro flex (diámetro interior ~5 mm, diámetro exterior ~8 mm) a una línea de gas nitrógeno comprimido en un extremo. Conecte un conector de tres vías en el otro extremo. Los tubos 1 y 2 de los conectores de tres vías se conectarán a la trampa y a las membranas aislantes, respectivamente.
  2. Conecte dos tubos micro flex (diámetro interior ~1,6 mm, diámetro exterior ~5 mm) a los dos puertos de salida de la llave de paso de tres vías. Conecte el otro extremo de los dos tubos a una aguja de 18 G de 8 mm de largo.
  3. Llene la capa de flujo con tampón M9 utilizando una micropipeta a través del puerto de entrada. Llene ambos tubos con agua DI a través del extremo conectado a la aguja. Inserte las dos agujas en los orificios perforados, conectando la membrana aislante y la membrana de captura, respectivamente.
  4. Abra el regulador de gas nitrógeno a 14 psi y gire la válvula de tres vías del tubo 1 para empujar el agua hacia el dispositivo a través de los canales microfluídicos en las capas de control, a saber, las membranas de trampa y aislamiento.
  5. Espere hasta que el agua llene el canal sin la presencia de ninguna gota de aire en ambos canales. Una vez que los canales están completamente llenos de agua, los canales se consideran cebados.
  6. Libere la presión usando la llave de paso de tres vías una vez que los canales estén llenos de agua y cebados. El cebado puede provocar burbujas en la capa de flujo, elimine las burbujas haciendo fluir medios adicionales a través del canal de flujo.

3. Mantenimiento y sincronización de C. elegans

NOTA: Cepas de C. elegans: El estudio utilizó los siguientes transgenes PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]) para el desarrollo vulvar 32, jsIs609 (mec7p::MLS(señal de localización de matriz mitocondrial)::GFP)33 para el desarrollo de neuronas receptoras táctiles (TRN) e imágenes de transporte de mitocondrias, y wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+)) para rastrear el desarrollo de PVD 34. Se siguió el protocolo estándar de cultivo y mantenimiento de C. elegans 35.

  1. Cultivar C. elegans en las placas de Petri del medio de crecimiento de nematodos (NGM) con E. coli OP50 como fuente de alimento a 22 °C. Mantenga las cepas de C. elegans transfiriendo repetidamente algunos hermafroditas o fragmentando una pequeña cantidad de agar con algunos animales a una nueva placa NGM con un césped OP50.
  2. Después de 3-5 días, revise la placa NGM para el crecimiento de animales y huevos de C. elegans. Recoja y transfiera aproximadamente 30 huevos de un plato a un plato NGM fresco con césped OP50.
  3. Para sincronizar los animales para la obtención de imágenes, transfiera todos los huevos no eclosionados de la placa cada 2 h a una placa nueva y manténgalos a 22 °C. Aproximadamente 15-20 huevos eclosionarán en cada plato.
  4. Recoger los animales entre 14-16 h y 28-30 h después de la eclosión para las etapas larvaria 2 (L2) y larval 3 (L3), respectivamente. Transfiera los animales al dispositivo microfluídico para obtener imágenes. Agregue el suministro de alimentos como se describe en la siguiente sección para mantener al animal dentro del dispositivo para el crecimiento a largo plazo y los experimentos de imágenes.

4. Crecimiento de C. elegans dentro del dispositivo microfluídico de crecimiento e imágenes

  1. Monte un dispositivo microfluídico de crecimiento e imágenes en un microscopio invertido y vea el patrón 2, después de conectar las membranas de aislamiento y la membrana de inmovilización, a bajas ampliaciones (4x o 10x). Asegúrese de que los canales estén llenos de agua destilada limpia.
  2. Preparar una solución fresca de 1 L de medio S utilizando 10 mL de citrato de potasio 1 M pH 6.0, 10 mL de solución de metales traza, 3 mL de 1 M CaCl2, 3 mL de 1 M MgSO4. Prepare la solución en condiciones estériles. No esterilice en autoclave el medio S.
  3. Llene el canal de flujo con medios de crecimiento (medio S) 10 min antes del experimento. Evite cualquier burbuja de aire en el canal de flujo. Fluya un medio adicional si es necesario para eliminar las burbujas de aire.
  4. Elija un solo animal de la etapa de desarrollo requerida de una placa NGM en 10 μL de medio S usando una micropipeta y empuje al animal hacia el canal de flujo a través del orificio de entrada.
  5. Monitoree la posición del animal en el canal de flujo utilizando un objetivo de bajo aumento. Fluya un medio adicional a través de la entrada o salida para empujar al animal y colocarlo dentro del canal de flujo restringido entre las dos membranas de aislamiento.
  6. Abra la llave de paso de tres vías para aplicar una presión de 14 psi en los canales de aislamiento y empuje las membranas hacia abajo en el canal de flujo.
    NOTA: La membrana sella parcialmente el canal de flujo y restringe el movimiento de los animales a la región entre las dos membranas de aislamiento.
  7. Utilizar una sola colonia de E. coli OP50 de una placa rayada para inocular 250 mL de caldo L (2,5 g de bactotriptona, 1,25 g de bacto-levadura, 1,25 g de NaCl enH2O). Cultivar el cultivo inoculado durante la noche a 37 °C.
  8. Alícuota 500 μL de cultivo de OP50 en tubos de centrífuga estériles de 1,5 ml y almacenar el material y la alícuota durante 2 semanas a 4 °C.
  9. Granular el cultivo OP50 por centrifugación a 1,3 x g durante 5 min. Disuelva el pellet con 1 ml de medio S fresco (dilución 0.5x) y guárdelo a temperatura ambiente durante 3-4 días. Utilice este OP50 diluido para alimentar a C. elegans dentro de dispositivos microfluídicos.
  10. Deje una gota de medio S en la parte superior de los depósitos de entrada y salida para reducir la evaporación del medio S en el canal de flujo.
  11. Tomar la solución OP50 diluida en una micropipeta de 10 μL. Retire la micropunta llena con la solución OP50 de la pipeta y coloque la punta a presión en el depósito de entrada. A continuación, coloque otra punta de micropipeta con 10 μL de solución alimenticia e insértela en el depósito de salida.
  12. Selle la cabeza de la punta aplicando presión con un dedo para garantizar la continuidad de las soluciones alimentarias sin ningún espacio de aire. Cambie la punta de micropipeta con la solución OP50 todos los días que no tenga más de 3-4 días.
  13. Llene 20-30 μL adicionales de solución alimenticia en ambas puntas. Agregue o retire la solución alimenticia hacia y desde la punta de la micropipeta para ajustar el gradiente para empujar al animal en el canal de flujo y para ajustar la posición del animal debajo de la membrana de captura para obtener imágenes.
  14. Controle el flujo de bacterias para asegurarse de que sea continuo a través de las membranas de aislamiento parcialmente cerradas en el canal de flujo utilizando imágenes de campo claro.
    NOTA: En ausencia de flujo de bacterias, los animales pueden comer las bacterias disponibles en el canal de flujo entre las dos membranas de aislamiento. En caso de que no haya bacterias o no haya flujo presente en el canal, sustituya las dos puntas de micropipeta en la entrada y salida por puntas de pipeta nuevas llenas de suministros de alimentos recién preparados.

5. Inmovilización e imagen de C. elegans

  1. Inmovilización de C. elegans bajo la membrana de captura
    1. Localice un solo animal en el canal de crecimiento a bajas ampliaciones. Ajuste las alturas de la solución alimentaria en las dos puntas de micropipeta conectadas a los depósitos de entrada y salida. Empuje al animal en la dirección requerida utilizando las diferencias de presión hidrostática en el canal de flujo.
    2. Coloque al animal en el centro de la membrana de captura y controle su comportamiento de natación utilizando un objetivo de bajo aumento (4x).
    3. Gire la llave de paso de tres vías para aumentar lentamente la presión en el canal de trampa. Inmovilice al animal debajo de la membrana de la trampa en una postura recta a lo largo de la pared límite del canal de crecimiento.
      PRECAUCIÓN: Evite atrapar al animal a través del canal de flujo en una posición de curvatura Z o U. Esto hace que el cuerpo del animal sea apretado con mayor presión y causa daños permanentes a su salud.
  2. Imágenes de C. elegans y liberación de la membrana
    1. Lleve y cargue el dispositivo en una plataforma de microscopio. Configure un microscopio invertido en la configuración de imagen deseada con todos los componentes ópticos necesarios (objetivo, fuente de luz, filtros de fluorescencia y un detector) para imágenes de campo brillante de alta resolución, contraste diferencial de imágenes (DIC) o fluorescencia (Figura complementaria 1).
    2. Adquiera una o varias imágenes de fluorescencia de lapso de tiempo para capturar eventos celulares y subcelulares.
    3. Adquirir imágenes de fluorescencia de las neuronas de C. elegans en función de su desarrollo utilizando un objetivo de apertura numérica (NA) de 60x, 1.4, un láser de longitud de onda de 488 nm con 7% -10% de potencia láser, una cámara CCD, en un microscopio de disco giratorio. Realice imágenes de lapso de tiempo utilizando el software provisto con el microscopio y adquiera imágenes a una velocidad de 4 cuadros por segundo (Figura complementaria 1).
    4. Después de la adquisición de imágenes, libere la presión de captura y monitoree la locomoción del animal a bajas ampliaciones: 4x y 10x. Mantenga al animal restringido dentro de la región definida por membranas aislantes (mantenidas por debajo de 14 psi durante todo el experimento).
    5. Ajuste el volumen de solución alimenticia en las dos puntas de micropipeta para continuar un flujo lento de alimentos impulsado por la gravedad en el canal de crecimiento. Este flujo de alimentos se obtiene ajustando los niveles de las soluciones alimentarias en micropipetas en la entrada y la salida (típicamente 1-5 mm de diferencia de altura).
    6. Visualice el flujo bajo un campo brillante del patrón de flujo de las bacterias en el canal de crecimiento.
      NOTA: En ausencia de flujo, el animal come la bacteria OP50 disponible, el canal parece despejado y el animal muere de hambre durante unas pocas horas. Un animal hambriento típicamente desarrolla una alta autofluorescencia, fácilmente observable al adquirir imágenes de fluorescencia de lapso de tiempo. Tales eventos tienen efectos perjudiciales sobre la fisiología animal y se evitaron en los experimentos.
    7. Repita los pasos 5.2.1-5.2.3 después de un intervalo de tiempo predeterminado para adquirir imágenes de fluorescencia/DIC/campo claro del mismo individuo en múltiples puntos de tiempo.
    8. Después de que las imágenes se adquieran en múltiples puntos de tiempo deseados del mismo animal individual, libere el aislamiento y la presión de captura. Enjuague el canal con tampón M9 y empuje al animal a través del depósito de entrada. Recupere al animal del reservorio y colóquelo en una placa de NGM fresca para un mayor control de la salud.
    9. Enjuague el canal con tampón M9 varias veces para eliminar las bacterias. Enjuague el canal de flujo con alcohol etílico al 70% (diluido en agua destilada). Seque los canales empujando el aire con una jeringa. Guarde el dispositivo en un lugar seco y libre de polvo para usarlo repetidamente en el futuro.
  3. Análisis de imágenes y estadísticas
    1. Utilice el software FIJI ImageJ para el análisis de imágenes tiff. Abra imágenes tiff de las imágenes de lapso de tiempo PVD de los animales wdIs51 en Fiji ImageJ. Extraiga los mejores planos de la pila de planos z que muestran los procesos primarios seleccionando la pestaña Imagen > Proyecto Pilas > Z.
    2. Filtre toda la serie de imágenes y encuentre marcos de imagen específicos que cubran con éxito todos los procesos neuronales utilizando secciones superpuestas de los marcos de imágenes de animales. Seleccione Plugin > Analyze > Cell Counter en la barra de herramientas de FIJI. Esto abrirá una ventana para numerar diferentes ramas y mantener un recuento de cada neurona seleccionada.
    3. Seleccione Inicializar contadores > > Tipo1 y, a continuación, marque las ramas secundarias. A continuación, seleccione Tipo 2 y marque Cuaternario, haga clic en la ventana Resultados que muestra los recuentos de todas las ramas (Figura complementaria 2). Este método mostrará las ramas que ya están contadas.
    4. Abra la siguiente imagen superpuesta y cuente las ramas restantes. Este proceso evitará el doble conteo y garantizará que se cuente cada proceso. Identificar y contar el número total de ramas primarias presentes en las primeras etapas larvales de C. elegans. Realizar análisis similares para las imágenes para procesos secundarios y cuaternarios en animales más viejos.
      NOTA: Los adultos muestran muchos procesos que inervan en los músculos de la pared corporal y pueden ser difíciles de contar. Asegúrese de que cada proceso se cuente solo una vez.
    5. Calcule la distancia entre los cuerpos celulares PVD en los animales wdIs51 dibujando una línea segmentada desde el cuerpo celular PVD (CB) hasta PVC CB. Para los animales en etapa larval 4 (L4), los cuerpos celulares están muy separados y no están en el mismo marco cuando se toman imágenes con un objetivo de 60x.
    6. Seleccione imágenes superpuestas de la pila para cubrir toda la longitud del animal de la cabeza a la cola usando la pestaña Imagen > proyecto Pilas > Z de ImageJ. Dibuje líneas segmentadas a lo largo del proceso neuronal entre los CB PVD y PVC.
    7. Mida las longitudes de todas las líneas segmentadas con ImageJ > Analyze > Measure. Suma las longitudes de todos los segmentos para calcular la distancia total entre PVD y PVC CB para cada punto de tiempo.
    8. Para la longitud neuronal de los TRN en animales jsIs609 , cargue las imágenes en Fiji. Dibujar una línea segmentada a lo largo de los microtúbulos laterales posteriores (PLM; visible con GFP soluble) desde el cuerpo celular hasta el centroide de la primera mitocondria. Calcule la longitud de la línea para el primer valor de distancia.
    9. Dibuja una línea segmentada desde el centro de la primera a la segunda mitocondria. Repita este proceso para cada par de mitocondrias hasta el final de la longitud del proceso neuronal. Suma todas las longitudes para calcular la longitud total del proceso neuronal.
    10. Para el análisis del linaje celular, cargue todas las imágenes vulvares en Fiji y extraiga la mejor imagen de enfoque de las células de las imágenes de lapso de tiempo de múltiples planos z.
    11. Representar los datos como media ± error estándar de la media (SEM). Calcule la significación estadística utilizando ANOVA unidireccional para más de dos muestras o una prueba t de dos muestras para un par de muestras. Denote significación por valor de p < 0,05 (*), valor de p < 0,005 (**) y valor de p > 0,05 (ns, no significativo).

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Representative Results

Caracterización del dispositivo: El dispositivo de crecimiento e imagen consiste en dos capas de PDMS unidas entre sí (Figura 1) utilizando enlaces de plasma irreversibles. La capa de flujo (patrón 1) que tiene 10 mm de longitud y 40 μm u 80 μm de altura nos permite cultivar al animal en cultivo líquido (Figura 1A). La capa de captura (patrón 2) tiene una membrana de 2 mm de ancho (Figura 1B) para inmovilizar al animal para obtener imágenes de alta resolución. La máscara para la capa de captura también crea un par de membranas de aislamiento para restringir el movimiento de los animales dentro de una sección del canal de flujo entre los sucesivos puntos de tiempo de la imagen. La membrana de captura del dispositivo está adaptada de nuestro dispositivo de imagen anterior3. El dispositivo actual (Figura 1C, L) incluye la adición de una membrana de aislamiento y un aumento en el ancho de la membrana de captura a 2 mm para la inmovilización eficiente del mismo animal en múltiples puntos de tiempo.

Para probar el dispositivo, se llenó agua destilada limpia en los canales microfluídicos que conectan las membranas de captura (Figura 1D, E y Figura 3 suplementaria) y se presurizó con gas nitrógeno de 14 psi, también utilizado para atrapar a un animal bajo una membrana PDMS de 2 mm de espesor (Figura 1H, K, L). Un solo animal fue recogido de una placa NGM usando una micropipeta y cargado en el canal de flujo (Figura 1F). El canal de crecimiento se llenó con bacterias resuspendidas en medios S (Figura 1F, G, I, J). Se mantuvo un flujo constante durante toda la duración de la obtención de imágenes ajustando las alturas de los medios en las puntas de pipeta conectadas a la entrada y salida del dispositivo mientras se monitoreaba al animal en el canal de flujo entre las dos membranas de aislamiento. La solución OP50 recién preparada se llenó diariamente en las puntas de micropipeta para garantizar una fuente de alimento saludable para el animal dentro del microcanal. La fuente de alimento fresco y el material PDMS permeable al gas aseguran un suministro suficiente de oxígeno dentro del microcanal30,29. El crecimiento de los animales en el dispositivo se rastreó mediante el uso de marcadores específicos de células o marcadores que muestran el linaje celular o los patrones de expresión celular variables durante el desarrollo. Los animales fueron inmovilizados bajo la membrana de captura utilizando gas nitrógeno de 14 psi y sosteniendo gusanos en una posición recta a lo largo de la pared del canal. El animal creció más lentamente dentro del canal microfluídico en comparación con una placa NGM23.

Estudio del linaje celular utilizando el dispositivo de imagen a largo plazo: Para evaluar el desarrollo de C. elegans dentro del dispositivo microfluídico, cultivamos la cepa PS3239 (ZMP-1: : GFP) con suministro constante de alimentos para rastrear el desarrollo de la vulva en diferentes puntos de tiempo de su crecimiento. ZMP-1 codifica una metaloproteasa de zinc y se expresa en la célula de anclaje en la etapa L3, en las células vulD y vulE en la etapa L4, y en vulA en animales adultos del día 1 (1D) (Figura 2A). Los cambios en el patrón de expresión representan un ejemplo de regulación temporal de genes donde el mismo gen se expresa en diferentes células en diferentes etapas de desarrollo. Para observar el desarrollo vulvar, el animal fue inmovilizado primero y luego se fotografió la región vulvar a través de múltiples planos z cada 8-10 h desde L3 en adelante hasta las etapas adultas. ZMP-1::GFP se expresa en diferentes células vulvares según la etapa de desarrollo (Figura 2B). Las imágenes de fluorescencia de alta resolución de las células vulvares de los animales que crecen dentro del dispositivo microfluídico demuestran un desarrollo vulvar normal y la expresión y localización de ZMP-1::GFP son similares a los informes anteriores32.

Seguimiento del desarrollo neuronal utilizando un dispositivo de imágenes y crecimiento a largo plazo: Para demostrar el uso del dispositivo para imágenes subcelulares de un animal individual, se monitorizó el desarrollo de dos neuronas mecanosensoriales PVD y TRN. Se utilizó la cepa NC1686 que expresa wdIs51 que expresa GFP en las dos neuronas PVD34,36. Cada neurona PVD muestra una arquitectura dendrítica ramificada similar a la menorá que comprende procesos primarios (PP), secundarios (SP), terciarios (TP) y cuaternarios (QP) en las etapas de desarrollo L2 (14-16 h), L2 tardía (20-22 h), L3 (24-26 h) y L4 (36-42 h), respectivamente (Figura 3). El cuerpo celular PVD está presente después de la vulva. Envía un axón y dos procesos dendríticos primarios que dan lugar a SP y TP, que a su vez dan lugar a ramas dendríticas QP que inervan los músculos de la pared del cuerpo. Las etapas L3 y L4 tardías muestran una alta arborización37,34. Cultivamos animales individuales NC1686 dentro del dispositivo microfluídico y los alimentamos continuamente con alimentos bacterianos. Los animales fueron inmovilizados durante la etapa de desarrollo L2 hasta 1D y las neuronas PVD fueron fotografiadas repetidamente cada 8-12 h usando un objetivo de aceite 60x, 1.3 NA para contar el número de ramas SP, TP y QP en tres dimensiones. El grado de ramificación aumentó durante el desarrollo, como se muestra en la Figura 3B. El número de SP y QP en diferentes etapas del desarrollo del gusano aumentó con la edad (Figura 4A), como se ha visto en estudios previos37. Los animales L2 mostraron 10 ± 3,8 (n = 9) SP pero ningún QP, cuando se midió utilizando el dispositivo (Figura 4A). Colocamos C. elegans en una gota de levamisol de 3 mM, un anestésico que causa contracción del músculo de la pared corporal y parálisis, para minimizar los efectos adversos sobre el transporte de orgánulos al tiempo que reduce los movimientos de los animales y causa suficiente parálisis, necesaria para la obtención de imágenes de alta resolución 3,4. Los valores de SP (4 ± 1,6, n = 25, p = 0,15) no fueron significativamente diferentes cuando se midieron de animales en etapas similares cultivados en placas NGM y se obtuvieron imágenes utilizando levamisol de 3 mM en un portaobjetos de agar (Figura 4B). Los datos sugieren que la inmovilización del dispositivo permite obtener imágenes de alta resolución de arquitecturas neuronales complejas y no afecta su desarrollo. Los animales en etapa L3 tienen un pequeño número de QP que aumenta en número con el desarrollo. Los adultos 1D mostraron 67 ± 2,8 QP (n = 5) en animales cultivados en el dispositivo. Estudios previos han demostrado la formación, así como una retracción de los procesos de PVD durante el desarrollo conocido como autoevitación, donde reducen sus números de rama38. La reducción de SP a las 51 h (1D) después de la eclosión podría ser el resultado de tales retracciones. Los animales que crecieron en placas NGM y se obtuvieron imágenes con levamisol de 3 mM mostraron una tendencia similar del número de ramificación para etapas comparables de desarrollo (Figura 4A, B). Además, la distancia entre los dos cuerpos celulares de PVC, uno presente en la cola y el segundo presente cerca de la vulva, aumenta a medida que se separan en animales cultivados en el dispositivo o aquellos cultivados en placas NGM (Figura 4C, D). A lo largo del proceso de obtención de imágenes, los animales se mantuvieron sanos y pudieron poner huevos incluso después de que los animales fueron inmovilizados bajo la membrana repetidamente durante este largo período.

Usando este dispositivo, pudimos inmovilizar al animal en la misma orientación e imaginar la neurona idéntica y su arquitectura con alta resolución incluso con una débil expresión GFP. Para demostrar la utilidad de nuestra tecnología de crecimiento e inmovilización, se tomaron imágenes del desarrollo de los TRN de L3 a adultos utilizando animales jsIs609 (mec-7p::MLS::GFP). Los TRN posteriores están presentes en el lado lateral del cuerpo y se denominan PLMR y PLML, que corresponde a los lados derecho e izquierdo del animal. Tomamos imágenes de los mismos animales que crecían en el chip microfluídico y los inmovilizamos a intervalos de 12-14 horas. El montaje representa todo el proceso neuronal PLMR en puntos de tiempo sucesivos destacando tanto las mitocondrias como el proceso neuronal (Figura 5A). Se calculó la longitud total del proceso neuronal y se encontró que aumentaba con una pendiente de 10,4 μm por h (Figura 5B). Esta tasa de aumento en la longitud del proceso neuronal concuerda con un informe anterior de ~ 10 μm / h 18,31,39,40,41. También observamos la adición de nuevas mitocondrias en el proceso de crecimiento y el cambio en la posición del punto de rama sináptica con respecto al cuerpo celular como se informó anteriormente23.

Figure 1
Figura 1: Un chip microfluídico simple para el crecimiento a largo plazo y la obtención de imágenes de C. elegans. (A) La capa de flujo consiste en un canal microfluídico de 10 mm de largo (patrón 1) en una capa delgada de PDMS. (B) La capa de captura consiste en un canal de inmovilización de 2 mm de espesor y un par de canales de aislamiento delgados en la capa de PDMS a granel. (C) Las dos capas de PDMS están unidas entre sí junto con un vidrio de cubierta delgada para hacer el dispositivo. (D, E) Los canales de control de captura y aislamiento se llenan con agua desionizada (DI), bajo gas nitrógeno comprimido (N2). (F) Los C. elegans sincronizados por edad se recogen de las placas NGM y se cargan dentro de la capa de flujo del dispositivo. (G) Los alimentos se suministran utilizando dos puntas de micropipeta en los depósitos de entrada y salida. H) Los animales son libres de moverse dentro de los dos canales de aislamiento y quedan atrapados bajo la membrana de inmovilización. (I) Imagen del dispositivo de crecimiento e imagen con suministro de alimentos a través de dos puntas de micropipetas. (J, K) Imágenes de un C. elegans en movimiento libre e inmovilizado dentro del canal microfluídico. La barra de escala es de 1 mm (I) y 200 μm (J, K). (L) Esquema de la sección transversal del dispositivo que muestra las alturas del canal de flujo (FC), la membrana PDMS (M) y el canal de control (CC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Seguimiento de la expresión de un marcador vulvar en C. elegans que se desarrolla dentro del dispositivo. (A) Esquema de células vulvares que expresan ZMP-1::GFP en animales PS3239 durante el desarrollo. La señal GFP aparece en la célula de anclaje en la etapa L3, en las células vulD y vulE en la etapa L4, y en las células vulA en la etapa adulta 1D. (B) Imágenes de un animal PS3239 creciendo dentro del chip microfluídico e inmovilizado cada 8-10 h para capturar imágenes de fluorescencia de la expresión de ZMP-1::GFP durante el desarrollo vulvar de L3, L4 y 1 día (1D) adulto. Abreviaturas: AC = célula de anclaje, A = vulA, D = vulD, E = vulE. La barra de escala es de 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Imágenes de wdIs51 C. elegans individuales para rastrear el desarrollo neuronal de PVD. (A) Esquema del crecimiento de la neurona PVD y la arborización dendrítica de la etapa L2 a L4. El círculo verde muestra el cuerpo celular PVD (CB, flecha amarilla). Las dendritas muestran la aparición de procesos primarios (PP) en L2 desde el lado anterior y posterior del CB, procesos secundarios (SP) durante L2 tardía, procesos terciarios (TP) en L3 y procesos cuaternarios (QP) durante las etapas L4. (B) Imágenes de neuronas PVD de animales que crecen dentro de un dispositivo microfluídico. (C) Imágenes de neuronas PVD de animales cultivados en una placa NGM e inmovilizados con levamisol (Lev) de 3 mM. La barra de escala es de 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Comparación del desarrollo de PVD en animales cultivados en dispositivos y animales cultivados en placas NGM. (A) El número promedio de procesos secundarios (SP) y cuaternarios (QP) de los mismos animales que crecen dentro del dispositivo microfluídico. Los valores se calculan a las 16 h (L2), 24 h (L3), 36 h (L4 temprana), 42 h (L4 tardía) y 51 h (1D adulto). (B) El número promedio de SP y QP de un lote diferente de animales que crecen en placas NGM y anestesiados con levamisol de 3 mM. (C) Separación media entre los dos cuerpos celulares neuronales PVD del mismo animal que crece en el dispositivo microfluídico. (D) Separación media de diferentes grupos de animales que crecen en placas NGM y anestesiados con levamisol de 3 mM. Datos representados como media ± SEM (n ≥ 10 para levamisol 3 mM y n ≥ 6 para animales inmovilizados con dispositivo). Las significaciones estadísticas se calculan mediante ANOVA unidireccional y se denotan como valor p < 0,05 (*), valor de p < 0,005 (**) y valor de p > 0,05 (ns). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Imágenes de alta resolución de neuronas receptoras táctiles (TRN) de animales que crecen dentro del dispositivo microfluídico. (A) Montaje de procesos neuronales de un solo animal fotografiado en diferentes momentos. El cuerpo celular (CB, flecha), el punto de ramificación sináptica (PA, punta de flecha) y la punta de la neurona (punta, flecha arriba) están etiquetados. El proceso neuronal y la posición de cada mitocondria se rastrean manualmente utilizando Fiji. La barra de escala es de 10 μm. (B) Longitud promedio del proceso neuronal en diferentes puntos de tiempo de imagen. Datos representados como media ± SEM (n = 8). La significación estadística se calcula utilizando ANOVA unidireccional y se denota como valor p < 0,005 (**) y valor p > 0,05 (ns). Una ecuación de regresión se ajusta con una pendiente de 10,4 μm de elongación del proceso neuronal por hora, R2 = 0,9425. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Capturas de pantalla de los ajustes del microscopio para imágenes de fluorescencia de C. elegans. (A) Un panel del software de análisis de imágenes muestra las secciones resaltadas para configurar la velocidad de escaneo, el conjunto de filtros y el objetivo para la obtención de imágenes. (B) El software se utiliza para elegir el láser de 488 nm con el 7% de la potencia total del láser. (C) El software de análisis de imágenes puede tomar un solo marco de imagen o una serie de imágenes de lapso de tiempo y almacenarlas para análisis futuros. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Capturas de pantalla del software FIJI que muestran los pasos de análisis para contar ramas PVD en animales wdIs51 . (A) Muestra la imagen PVD abierta en el software Fiji ImageJ y el enlace al complemento de contador de celdas. (B) Ventana de contador de celdas para inicializar el contador de una imagen. (C) Selección de contadores para marcar las ramas que se incluyen y evitar el conteo múltiple. (D) Ventana de resultados que muestra el número total de sucursales en cada categoría. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Esquema del dispositivo de crecimiento e imagen. Dos puntas de micropipeta, llenas con diferentes volúmenes de solución alimenticia bacteriana (amarillo), se insertan en los punzones de entrada y salida del canal de flujo en la capa inferior. La diferencia en las alturas de las soluciones alimenticias en las puntas hace que la solución fluya dentro del canal, lo que a su vez suministra bacterias al animal para su crecimiento. Los canales de captura y aislamiento (azul) se llenan con agua destilada y se comprimen utilizando un suministro de gas nitrógeno (establecido en 14 psi). El canal de aislamiento siempre está conectado a 14 psi. La presión sobre la membrana de captura se cambia entre 0 (el animal es libre de moverse y alimentarse) y 14 psi (el animal está inmovilizado para imágenes de alta resolución) utilizando un conector de tres vías. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

En este artículo, se ha descrito un protocolo para la fabricación y el uso de un dispositivo microfluídico simple para el cultivo de C. elegans con suministro constante de alimentos e imágenes de alta resolución de un solo animal durante su desarrollo. Este proceso de fabricación es simple y se puede hacer en un ambiente no estéril. Un entorno libre de polvo es crítico durante los pasos de fabricación. La presencia de partículas de polvo conduciría a un contacto inadecuado entre las dos superficies de unión, lo que resultaría en una unión deficiente y fugas del dispositivo durante la aplicación a alta presión mientras C. elegans está inmovilizado. De todos los dispositivos fabricados, el 95% de los dispositivos son adecuados para experimentos. Un pequeño número de dispositivos fallan (5%) debido a una unión inadecuada durante la fabricación o el uso. La falla en la unión se puede reducir llevando a cabo el proceso de fabricación dentro de una sala limpia libre de polvo (> 1,000 grados) disponible en varias instituciones académicas de todo el mundo. Para limpiar los alimentos bacterianos del canal de flujo y permitir la reutilización del dispositivo, enjuague el dispositivo haciendo fluir alcohol a través de él después de cada experimento.

El protocolo demuestra un proceso de fabricación de litografía con un diseño simple que se puede modificar fácilmente para diferentes etapas de desarrollo y tamaños de C. elegans. Además, este diseño de dispositivo se puede adaptar para otros organismos modelo como el pez cebra y Drosophila, aumentando las dimensiones del flujo y atrapando las capas3 para observar una variedad de procesos de desarrollo y subcelulares. En este protocolo, se han utilizado dos alturas diferentes del canal de la capa de flujo, 40 μm y 80 μm, para la inmovilización completa y el seguimiento de las características celulares y subcelulares en diferentes etapas de desarrollo de C. elegans según sea apropiado para sus tamaños corporales. Por ejemplo, la arborización dendrítica en las neuronas sensoriales PVD comienza en las primeras etapas L2 y continúa hasta la etapa L4. Esto se fotografió en un dispositivo con una capa de flujo de 40 μm de alto. A medida que las neuronas PVD forman dendritas que inervan los músculos de la pared del cuerpo, se requiere una sección óptica para cuantificar los procesos en 3D. El análisis cuantitativo de cenadores dendríticos requiere la inmovilización completa de los animales dentro del dispositivo que coincida con el diámetro del cuerpo. Sin embargo, para monitorear el desarrollo vulvar, se utilizó una capa de flujo de 80 μm de altura para rastrear los linajes vulvares. Para la longitud de las TRN y las imágenes de mitocondrias, obtuvimos imágenes de las etapas L2 a L4 utilizando dispositivos con un espesor de capa de flujo de 40 μm. El uso de un dispositivo con la altura incorrecta causará dificultad en la inmovilización. Por ejemplo, los animales pequeños (etapas L2 o L3 tempranas) dentro de un dispositivo de altura de capa de flujo de 80 μm permitirán que el animal se voltee dentro del dispositivo y muestren una inmovilización incompleta incluso después de que la membrana de captura esté por debajo de 14 psi de presión. Por otro lado, los animales con grandes diámetros corporales (más allá de L4 tardía) no entran fácilmente dentro de un dispositivo con una altura de capa de flujo de 40 μm. Atrapar animales grandes en dispositivos pequeños bajo alta presión puede dañar su cuerpo. La aplicación del dispositivo actual con una capa de flujo de 40 μm es limitada y no es adecuada para imágenes de alta resolución de animales muy jóvenes en etapa larvaria temprana (como animales en etapa L1 menores de 10 h después de la eclosión) ya que no están completamente inmovilizados debajo de la membrana. Debido al pequeño tamaño del cuerpo, los animales larvales de pequeño tamaño siguen moviéndose y ocasionalmente escapan de la trampa cuando se excitan con luz láser. Para los animales en etapa L1, se pueden realizar imágenes de campo brillante o fluorescencia de baja resolución utilizando objetivos 4x o 10x y tiempos de exposición de cámara cortos. Como enfoque alternativo, será necesario un nuevo dispositivo de capa de flujo con < altura de 20 μm para inmovilizar completamente las larvas jóvenes en etapa C. elegans.

El seguimiento de los fenómenos de desarrollo en el mismo animal durante una larga escala de tiempo utilizando imágenes de fluorescencia de alta resolución puede resultar en un aumento de la autofluorescencia. Cada ensayo de imagen de lapso de tiempo requiere la optimización de la intensidad de excitación, el tiempo de exposición, el intervalo de tiempo de imagen, el tiempo de recuperación de animales y la calidad de los alimentos para obtener información de desarrollo fisiológicamente relevante de los estudios de C. elegans. Hemos seleccionado > intervalo de tiempo de 3 h para estudios de desarrollo cuando se utilizan animales a partir de las etapas L4 en adelante. El dispositivo es capaz de adquirir imágenes más frecuentes (cada 5-10 min durante unas horas) o múltiples fotogramas por segundo (durante < 1 h) para estudiar otros procesos dinámicos como el transporte y distribución de orgánulos en las neuronas de C. elegans 3,23. La captura y la obtención de imágenes de las primeras etapas del desarrollo requieren una observación más cuidadosa, ya que la captura repetida con intervalos de tiempo cortos sin recuperación completa puede afectar su salud. Durante los experimentos, se encontró que los animales que requerían alta presión para moverlos a la capa de flujo muestran mala salud y más autofluorescencia con el tiempo. Los animales con alta fluorescencia corporal, que se sabe que están asociados con un alto nivel de estrés, se evitaron para los estudios de imagen. Para mantener una buena fisiología, los animales quedaron atrapados en una posición recta adyacente a la pared del canal. Se evitó inmovilizar a los animales con su cuerpo a través del ancho del canal ya que los animales se enferman después de que su cuerpo se comprime bajo una presión de 14 psi en esta posición. Para mantener una buena relación señal-ruido durante la toma de imágenes repetidas con objetivos de aceite, el cubreobjetos debe limpiarse adecuadamente después de cada punto de tiempo. Después de un cuidado especial durante el proceso de fabricación del dispositivo y su aplicación, los mismos dispositivos podrían reutilizarse durante varias sesiones de imágenes.

Este dispositivo podría ser útil para estudios con mutantes que podrían ser sensibles a los anestésicos. El enfoque presentado puede eliminar los efectos anestésicos adversos sobre el crecimiento y la fisiología para facilitar la observación de defectos morfológicos, funcionales y de comportamiento en animales durante un largo período. El dispositivo es fácil de fabricar y se puede configurar en cualquier laboratorio para abordar cuestiones biológicas del desarrollo / células a largo plazo en C. elegans que requieren imágenes intermitentes de alta resolución.

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Disclosures

S.M. y S.P.K. son autores de una patente pendiente sobre el dispositivo de crecimiento microfluídico e imagen (solicitud de patente número 640/CHE/2011).

Acknowledgments

Agradecemos a la instalación de imágenes CIFF, NCBS por el uso de los microscopios confocales apoyados por el DST - Centro de Nanotecnología (No. SR/55/NM-36-2005). Agradecemos la financiación de la investigación de DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), disco giratorio apoyado por DAE-PRISM 12-R & D-IMS-5.02.0202 (SPK y Gautam Menon), y HHMI-IECS número de subvención 55007425 (SPK). Las cepas HB101, PS3239 y wdIs51 fueron proporcionadas por el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC), que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). S.P.K. hizo jsIs609 en el laboratorio de Mike Nonet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G needles Sigma-Aldrich, Bangalore, India Gauge 18
3-way stopcock Cole-Parmer WW-30600-02 Masterflex fitting with luer lock
CCD camera Andor Technology EMCCD C9100-13no
Circuit board film Fine Line Imaging, Colorado, USA The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven Meta-Lab Scientific Industries, India MSI-5
Coverslips Blue stat microscopic cover glass 22mm x 10Gms
Ethanol Hi media
Harris uni-core puncher 1mm Qiagen Z708801
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 440191
Hot plate  IKA RCT B S 22
Isopropanol Fisher Scientific 26895
KOH Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope ZEISS LSM 5 LIVE
Micropipette tips Tarsons 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1 Microchem SU8-2025 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2 Microchem SU8-2050 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas Local Supplier Commercial nitrogen gas Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution) Dow Corning Corporation, MI, USA  Sylgard curing solution curing agent
Petri plates Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
Razor and blades Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base) Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard 184 base elastomer base
Silicon tubes Fisher Scientific Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer University Wafer, MA, USA [100] orientation, 4-inch diameter Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater SPS-Europe B.V., The Netherlands SPIN 150
Spinning Disk microscope Perkin Elmer ultra-view VOX system CSU-X1-A3 N The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer Microchem, MA, USA SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 448931 Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp Oriel Instruments, Bangalore, India 200 Watt and collimated UV light source
Volocity software Perkin-Elmer Image analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Bioingeniería Número 182 C. elegans chip microfluídico crecimiento en chip imágenes a largo plazo imágenes neuronales linaje de células vulvas
Un chip microfluídico simple para el crecimiento a largo plazo y la obtención de imágenes de <em>Caenorhabditis elegans</em>
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Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S. P. A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (182), e63136, doi:10.3791/63136 (2022).

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