هنا ، كنا نهدف إلى الحصول على تركيبة عن طريق تحميل الدوبامين للإكسوسومات المعزولة للخلايا الجذعية من الخلايا الجذعية الوسيطة الهلامية في وارتون. يتم وصف عزل وتوصيف الإكسوسوم ، وتحميل الدواء في الإكسوسومات الناتجة ، والنشاط السام للخلايا للتركيبة المطورة في هذا البروتوكول.
تشكل الإكسوسومات التي يتراوح حجمها بين 40 و 200 نانومتر أصغر مجموعة فرعية من الحويصلات خارج الخلية. تلعب هذه الحويصلات النشطة بيولوجيا التي تفرزها الخلايا دورا نشطا في الشحن والتواصل بين الخلايا. توجد الإكسوسومات في الغالب في سوائل الجسم مثل البلازما والسائل النخاعي والبول واللعاب والسائل الأمنيوسي واللبأ وحليب الثدي وسائل المفاصل والسائل المنوي وحمض الجنب. بالنظر إلى حجم الإكسوسومات ، يعتقد أنها قد تلعب دورا مهما في أمراض الجهاز العصبي المركزي لأنها يمكن أن تمر عبر الحاجز الدموي الدماغي (BBB). ومن ثم ، تهدف هذه الدراسة إلى تطوير نظام ناقل نانوي قائم على الإكسوسوم عن طريق تغليف الدوبامين في إكسوسومات معزولة من الخلايا الجذعية الوسيطة الهلامية في وارتون (WJ-MSCs). تم تحضين الإكسوسومات التي اجتازت عملية التوصيف بالدوبامين. تم إعادة توصيف الإكسوسومات المحملة بالدوبامين في نهاية الحضانة. تم التحقيق في الإكسوسومات المحملة بالدوبامين في إطلاق الدواء ومقايسات السمية الخلوية. أظهرت النتائج أنه يمكن تغليف الدوبامين بنجاح داخل الإكسوسومات وأن الإكسوسومات المحملة بالدوبامين لم تؤثر على صلاحية الخلايا الليفية.
Exosomes ، الحويصلات النشطة بيولوجيا مع ميزات كبيرة ، تتراوح في الحجم من 40 نانومتر إلى 200 نانومتر. تنشأ الإكسوسومات من غشاء الخلية وتتشكل بسبب إطلاق الإندوسومات1. تعمل هذه الهياكل كمحاورات من خلية إلى خلية وتتفاعل مع الخلايا المجاورة لتسهيل نقل الجزيئات النشطة. يمكن عزل الإكسوسومات من العديد من المصادر المختلفة. وتشمل هذه سوائل الجسم مثل البلازما والبول والسائل النخاعي واللعاب ، وكذلك خطوط الخلايا المزروعة في ظل ظروف المختبر . تلعب الإكسوسومات دورا مهما في القضاء على تلف الأعصاب ، وذلك بفضل الجزيئات الحيوية التي تحتوي عليها ، مثل الدهون والبروتينات والأحماض النووية2. تقوم Glia ، وهي الخلايا الداعمة للجهاز العصبي3 ، بنقل البروتينات والحمض النووي الريبي الصغير إلى محاور الخلايا العصبية عبر exosomes4.
يتم أيضا إطلاق الدهون التي تشكل غمد المايلين ، والتي تعد سمة مميزة في التوصيل العصبي ، من الخلايا قليلة التغصن عبر exosomes 4,5. تشارك الإكسوسومات أيضا في عمليات مثل اللدونة المشبكية ، واستجابة الإجهاد العصبي ، والتواصل بين الخلايا الخلوية ، وتكوين الخلايا العصبية في الدماغ 6,7. حقيقة أن الإكسوسومات تمتلك أبعادا نانوية تمكنها من المرور عبر BBB. هناك طريق انتقال خاص من السائل الخلالي إلى السائل النخاعي بعد اختراق هذا الغشاء8. بفضل خواص سطحها ، يمكن أن تتفاعل الإكسوسومات بكفاءة مع الخلايا المستهدفة كنظام لتوصيل الدواء وتوصيل الأدوية المحملة بنشاط.
بسبب التعبير عن البروتينات اللاصقة المختلفة (tetraspanins و integrins) على سطح exosomes ، يمكن لهذه الحويصلات خارج الخلية أن تتفاعل بسهولة وتندمج مع أغشية الخلايا المضيفة9. يعتقد أنه يمكن استخدام exosomes كنظام لتوصيل الأدوية ، خاصة في علاج أمراض الجهاز العصبي المركزي بسبب قدرتها على اختراق BBB وخصائصها السطحية. الإكسوسومات المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) لديها خطر أقل للرفض المناعي مقارنة بالعلاجات الخلوية الخيفية ، وفي هذا الصدد ، يمكن أن تكون مكونا مهما في تطبيقات العلاج الخالية من الخلايا10.
الدوبامين هو جزيء نقصه في الدماغ هو السمة المميزة لمرض باركنسون (PD) ، ويزداد سوءا يوما بعد يوم11،12،13. من المعروف أن PD يرتبط بانحطاط الخلايا العصبية الدوبامينية في المادة السوداء للدماغ المتوسط وفقدان وظائف الخلايا العصبية الحركية14,15. موت الخلايا العصبية الدوبامين يمنع توريد الدوبامين الناقل العصبي إلى مخطط الدماغ. وهذا بدوره يؤدي إلى ظهور أعراض خاصة بمرض باركنسون16. هذه الأعراض من PD هي بطء الحركة ، وعدم الاستقرار الوضعي ، والصلابة ، وخاصة الهزة يستريح12،13. على الرغم من أن مرض باركنسون قد تم وصفه لأول مرة منذ أكثر من قرنين من الزمان ، إلا أن الدراسات لفهم أمراض المرض ومسبباته لا تزال جارية ومن المقبول حاليا أن مرض باركنسون مرض جهازي معقد17. من المتوقع أن يحدث نقص الدوبامين ، وتلاحظ أعراض PD السريرية عندما تتدهور أكثر من 80 ٪ من الخلايا العصبية18. في علاج المرض ، يفضل مكملات الدوبامين غير المكتملة لتقليل الأعراض الحركية. أظهرت الدراسات في الجسم الحي أن التسريب المباشر للدوبامين في الدماغ يقلل بشكل كبير من الأعراض في الحيوانات19. تستخدم سلائف الدوبامين مثل L-DOPA (L-3،4-dihydroxyphenylalanine) وأدوية مستقبلات الدوبامين في العيادة لأن التسريب المباشر للدوبامين في الدماغ غير ممكن في البشر ولا يمكن للدوبامين الذي يدخل النظام عبور BBB20. هذه الأنواع من الأدوية تفقد فعاليتها بمرور الوقت. ومع ذلك ، لا يوجد حتى الآن نهج علاجي علاجي لمرض باركنسون. وبالتالي ، هناك ضرورة كبيرة لتطوير استراتيجيات علاجية وطرق علاج جديدة للكشف عن الفيزيولوجيا المرضية للمرض وتقليل تأثير مرض باركنسون على المرضى.
جذبت الدراسات القائمة على الإكسوسوم الانتباه مؤخرا لجمع المعلومات حول كل من الأساليب العلاجية وأمراض أمراض الجهاز العصبي. لقد ثبت أن الإكسوسومات المشتقة من MSC تقلل الالتهاب في تلف الأعصاب وتساهم في تجديد الخلايا العصبية21،22،23. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن إفرازات exosome المشتقة من MSC تقلل من موت الخلايا المبرمج من خلال إظهار تأثيرات التغذية العصبية والوقائية العصبية ، خاصة على الخلايا العصبية الدوبامينية24,25. تسارعت الأبحاث على المنصات التي تستخدم فيها الإكسوسومات كأنظمة لتوصيل الأدوية العلاجية بشكل مكثف في السنوات الأخيرة. في العديد من الدراسات ، لوحظ أنه يمكن تغليف الأدوية ذات الصلة بسهولة في exosomes وتسليمها بأمان إلى الخلايا والأنسجة والأعضاء المستهدفة26,27. يمكن استخدام طرق مختلفة مثل الحضانة ، ودورات التجميد / الذوبان ، والصوتنة ، والبثق لتحميل الدواء في exosomes28.
يسمح Coincubation مع exosomes أو الحويصلات الشبيهة بالإكسوسوم بتغليف الجزيئات الصغيرة المحبة للدهون بشكل سلبي في أنظمة التوصيل هذه28،29،30. على وجه الخصوص ، تم تحميل جزيئات مختلفة مثل الكركمين 31 ، الكاتلاز 30 ، دوكسوروبيسين32 ، وباكليتاكسيل33 بشكل فعال في exosomes. وقد لوحظ أن exosomes المحتوية على الكاتلاز ، والتي لها نشاط مضاد للأكسدة ، تراكمت بكفاءة في الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ وأظهرت أنشطة عصبية قوية30. في نفس الدراسة ، وجد أن الصابونين ، المضاف إلى المجمع لزيادة كفاءة التحميل ، يزيد من نسبة تحميل الدواء أثناء الحضانة30,34. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لوضع معايير لتحميل الدواء في exosomes.
تصف هذه الورقة تطوير نظام ناقل نانوي عن طريق تغليف الدوبامين في الإكسوسومات التي تم عزلها من WJ-MSCs. يتم شرح جميع الخطوات ، بما في ذلك زراعة WJ-MSCs ، وعزل وتوصيف الإكسوسومات ، وتجارب تحميل الأدوية ، وتوصيف الإكسوسومات المحملة بالدوبامين بتقنيات مختلفة ، وتحليل السمية الخلوية في المختبر بالتفصيل.
Exosomes عبارة عن حويصلات غشائية صغيرة بأبعاد 40-200 نانومتر تفرزها معظم أنواع الخلايا ، على سبيل المثال ، MSCs1. قادرة على تمكين التواصل بين الخلايا ، يمكن أن تدخل exosomes الخلايا بطرق مختلفة مثل التداخل الخلوي ، البلعمة ، كثرة الكريات الدقيقة ، الاستيعاب بوساطة الدهون ، والاندماج<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم العمل بشكل أساسي من خلال تمويل البحث المقدم من مشاريع البحث العلمي بجامعة يلدز التقنية (TSA-2021-4713).
0.22 µm membrane filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
0.45 µm syringe filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
15 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
Acetonitrile | Sigma | 271004-1L | Used for HPLC analysis |
Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process | |
Cell Culture Cabin | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
Centrifugal | Hitachi | CF16RN | Used in the exosome isolation step |
CO2 incubator with Safe Cell UV | Panasonic | Used for the cell culture process | |
Dopamine hydrochloride H8502-10G | Sigma | H8502-10G | Used in exosome dopamine loading |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | To store cells and the resulting exosomes |
Fridge | Panasonic | MPR-215-PE | Used to store cell culture and other materials |
High performance liquid chromatography-HPLC | Agilent Technologies | The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated. | |
Microscope- Primovert | Zeiss | Used to observe cells in cell culture. | |
MTT Assay | Biomatik | Used to measure cell viability | |
NanoSight NS300 | Malvern panalytical | Malvern panalytical | Used for exosome characterization |
Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Used in the exosome isolation step | |
PBS tablet | Biomatik | 43602 | In the preparation of the PBS solution |
Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
Pipette Aid | Isolab | ||
Precision balance-Kern | Kern-ABJ220-4NM | Used in the preparation of solutions | |
Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Used to digest exosomes in HPLC analysis | |
Saponin | Sigma | 47036-50G-F | It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process. |
Spectrostar-Nano-Spectrophotometry | BMG LABTECH | Used for MTT and drug release analyzes | |
SPSS 22 | statistical package program | ||
Vorteks-FinePCR | FinePCR-FineVortex | Used to mix solutions homogeneously | |
Water Bath 37 °C-Senova | Senova | Used in cell culture step | |
Wharton’s jelly mesenchymal stem cells | ATCC | ||
ZetaSizer | Malvern Nano ZS | Malvern Nano ZS | Used for exosome characterization |