Formulation et caractérisation d’un système de transport de dopamine à base d’exosomes

Summary

Ici, nous avons cherché à obtenir une formulation par chargement dopaminergique des exosomes isolés de cellules souches issues des cellules souches mésenchymateuses gelées de Wharton. L’isolement et la caractérisation des exosomes, la charge du médicament dans les exosomes résultants et l’activité cytotoxique de la formulation développée sont décrits dans ce protocole.

Abstract

Les exosomes d’une taille comprise entre 40 et 200 nm constituent le plus petit sous-groupe de vésicules extracellulaires. Ces vésicules bioactives sécrétées par les cellules jouent un rôle actif dans la cargaison et la communication intercellulaires. Les exosomes se trouvent principalement dans les fluides corporels tels que le plasma, le liquide céphalo-rachidien, l’urine, la salive, le liquide amniotique, le colostrum, le lait maternel, le liquide articulaire, le sperme et l’acide pleural. Compte tenu de la taille des exosomes, on pense qu’ils peuvent jouer un rôle important dans les maladies du système nerveux central car ils peuvent traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE). Par conséquent, cette étude visait à développer un système de nanotransporteurs à base d’exosomes en encapsulant la dopamine dans des exosomes isolés des cellules souches mésenchymateuses gelées de Wharton (WJ-MSCs). Les exosomes qui ont passé le processus de caractérisation ont été incubés avec de la dopamine. Les exosomes chargés en dopamine ont été recaractérisés en fin d’incubation. Les exosomes chargés de dopamine ont été étudiés dans des tests de libération de médicaments et de cytotoxicité. Les résultats ont montré que la dopamine pouvait être encapsulée avec succès dans les exosomes et que les exosomes chargés de dopamine n’affectaient pas la viabilité des fibroblastes.

Introduction

Les exosomes, des vésicules bioactives aux caractéristiques significatives, ont une taille comprise entre 40 nm et 200 nm. Les exosomes proviennent de la membrane cellulaire et se forment en raison de la libération des endosomes¹. Ces structures servent de communicateurs de cellule à cellule et interagissent avec les cellules voisines pour faciliter le transfert de molécules actives. Les exosomes peuvent être isolés à partir de nombreuses sources différentes. Il s’agit notamment des fluides corporels tels que le plasma, l’urine, le liquide céphalo-rachidien, la salive, ainsi que des lignées cellulaires cultivées dans des conditions in vitro . Les exosomes jouent un rôle important dans l’élimination des lésions nerveuses, grâce aux biomacromolécules qu’ils contiennent, telles que les lipides, les protéines et les acides nucléiques². Les glies, qui sont les cellules de soutien du système nerveux³, transfèrent des protéines et des micro-ARN aux axones des neurones via les exosomes⁴.

Les lipides formant la gaine de myéline, qui sont un élément caractéristique de la conduction nerveuse, sont également libérés par les oligodendrocytes via les exosomes ^4,5. Les exosomes sont également impliqués dans des processus tels que la plasticité synaptique, la réponse neuronale au stress, la communication cellule-cellule et la neurogenèse dans le cerveau ^6,7. Le fait que les exosomes possèdent des dimensions nanométriques leur permet de passer à travers la BHE. Il existe une voie de transition spéciale entre le liquide interstitiel et le liquide céphalo-rachidien après avoir pénétré cette membrane⁸. Grâce à leurs propriétés de surface, les exosomes peuvent interagir efficacement avec les cellules cibles en tant que système d’administration de médicaments et délivrer activement les médicaments chargés.

En raison de l’expression de diverses protéines adhésives (tétraspanines et intégrines) à la surface des exosomes, ces vésicules extracellulaires peuvent facilement interagir et fusionner avec les membranes des cellules hôtes⁹. On pense que les exosomes peuvent être utilisés comme système d’administration de médicaments, en particulier dans le traitement des maladies du système nerveux central en raison de leur capacité à pénétrer dans la BHE et de leurs propriétés de surface. Les exosomes dérivés de cellules souches mésenchymateuses (CSM) présentent un risque de rejet immunitaire plus faible que les thérapies cellulaires allogéniques et, à cet égard, ils peuvent constituer un élément important des applications de traitement sans cellules¹⁰.

La dopamine est une molécule dont la carence dans le cerveau est le trait caractéristique de la maladie de Parkinson (MP), s’aggravant de jour en jour^11,12,13. On sait que la maladie de Parkinson est associée à la dégénérescence des neurones dopaminergiques dans la substance noire du mésencéphale et à la perte des fonctions des motoneurones^14,15. La mort des neurones dopaminergiques empêche l’apport du neurotransmetteur dopamine au striatum cérébral. Ceci, à son tour, entraîne l’apparition de symptômes spécifiques à la maladie de Parkinson¹⁶. Ces symptômes de la maladie de Parkinson sont la bradykinésie, l’instabilité posturale, la rigidité et surtout les tremblements au repos^12,13. Bien que la maladie de Parkinson ait été décrite pour la première fois il y a plus de deux siècles, les études visant à comprendre la pathologie et l’étiologie de la maladie sont toujours en cours et il est actuellement admis que la maladie de Parkinson est une maladie systémique complexe¹⁷. Il est prédit qu’une carence en dopamine se produit et que des symptômes cliniques de la maladie de Parkinson sont observés lorsque plus de 80 % des neurones dégénèrent¹⁸. Dans le traitement de la maladie, une supplémentation incomplète en dopamine est préférée pour réduire les symptômes moteurs. Des études in vivo ont montré que l’infusion directe de dopamine dans le cerveau réduit considérablement les symptômes chez les animaux¹⁹. Les précurseurs de la dopamine tels que la L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphénylalanine) et les médicaments à base de récepteurs de la dopamine sont utilisés en clinique parce que la perfusion directe de dopamine dans le cerveau n’est pas possible chez l’homme et que la dopamine entrant dans le système ne peut pas traverser le BHS²⁰. Ces types de médicaments perdent de leur efficacité avec le temps. Cependant, il n’existe toujours pas d’approche curative pour la maladie de Parkinson. Il est donc absolument nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et modalités de traitement pour révéler la physiopathologie de la maladie et réduire l’impact de la maladie de Parkinson sur les patients.

Les études basées sur les exosomes ont récemment attiré l’attention pour la collecte d’informations sur les approches thérapeutiques et les pathologies des maladies du système nerveux. Il a été démontré que les exosomes dérivés de CSM réduisent l’inflammation des lésions nerveuses et contribuent à la régénération neuronale^21,22,23. De plus, il a été rapporté que les sécrétomes d’exosomes dérivés de CSM réduisent l’apoptose en montrant des effets neurotrophiques et neuroprotecteurs, en particulier sur les neurones dopaminergiques^24,25. La recherche sur les plateformes dans lesquelles les exosomes sont utilisés comme systèmes d’administration de médicaments thérapeutiques s’est intensifiée ces dernières années. Dans de nombreuses études, il a été observé que les médicaments pertinents peuvent être facilement encapsulés dans des exosomes et administrés en toute sécurité dans les cellules, les tissus et les organes cibles^26,27. Différentes méthodes telles que l’incubation, les cycles de congélation/décongélation, la sonication et l’extrusion pourraient être utilisées pour le chargement du médicament dans les exosomes²⁸.

La coincubation avec des exosomes ou des vésicules de type exosome permet d’encapsuler passivement de petites molécules lipophiles dans ces systèmes d’administration^28,29,30. En particulier, diverses molécules telles que la curcumine³¹, la catalase 30, la doxorubicine 32 et le paclitaxel³³ ont été efficacement chargées dans les exosomes. Il a été observé que les exosomes contenant de la catalase, qui ont une activité antioxydante, s’accumulaient efficacement dans les neurones et les cellules microgliales du cerveau et présentaient de fortes activités neuroprotectrices³⁰. Dans la même étude, la saponine, ajoutée au complexe pour augmenter l’efficacité de la charge, a augmenté le pourcentage de charge du médicament pendant l’incubation^30,34. Cependant, d’autres études sont nécessaires pour établir les normes de charge des médicaments dans les exosomes.

Cet article décrit le développement d’un système de nanotransporteurs par encapsulation de la dopamine dans des exosomes qui ont été isolés à partir de CSM-WJ. Toutes les étapes, y compris la culture des CSM-WJ, l’isolement et la caractérisation des exosomes, les expériences de chargement de médicaments, la caractérisation des exosomes chargés en dopamine avec diverses techniques et l’analyse de cytotoxicité in vitro sont expliquées en détail.

Protocol

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et équipements utilisés dans ce protocole. 1. Culture et cryoconservation des cellules souches mésenchymateuses de la gelée de Wharton Retirez les WJ-MSC (de l’ATCC) du congélateur à -80 °C. Semez les cellules dans une fiole contenant du milieu DMEM-F12 complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS). Incubez-les à 37 °C dans un incubateur contenant …

Representative Results

Isolement et caractérisation des exosomesLes cellules souches gelées de Wharton sont cultivées et incubées dans un milieu sans sérum pendant 48 h lorsque la culture atteint une densité suffisante. Après la fin de l’incubation, le surnageant est stocké à -20 °C. Les surnageants collectés sont dilués avec du PBS et soumis à une ultracentrifugation (Figure 1). La solution obtenue est analysée par des analyses NTA et DLS. Les exosomes sont stérilisés en pa…

Discussion

Les exosomes sont de petites vésicules membranaires de dimensions de 40 à 200 nm sécrétées par la plupart des types de cellules, par exemple, les CSM¹. Capables de permettre la communication entre les cellules, les exosomes peuvent pénétrer dans les cellules de différentes manières telles que l’endocytose, la phagocytose, la micropinocytose, l’internalisation à médiation lipidique et la fusion^33,44. Par rapport à d’autres…

Materials

0.22 µm membrane filter	Aisimo		Used for the sterilization process
0.45 µm syringe filter	Aisimo		Used for the sterilization process
15 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
50 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
96 well plates (Falcon, TPP microplates)	Merck Millipore		Used in cell culture step
Acetonitrile	Sigma	271004-1L	Used for HPLC analysis
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process
Cell Culture Cabin	Hera Safe KS		Used for the cell culture process
Centrifugal	Hitachi	CF16RN	Used in the exosome isolation step
CO2 incubator with Safe Cell UV	Panasonic		Used for the cell culture process
Dopamine hydrochloride H8502-10G	Sigma	H8502-10G	Used in exosome dopamine loading
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Used as cell culture medium
Fetal Bovine Serum-FBS	Capricorn	FBS-16A	It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	To store cells and the resulting exosomes
Fridge	Panasonic	MPR-215-PE	Used to store cell culture and other materials
High performance liquid chromatography-HPLC	Agilent Technologies		The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.
Microscope- Primovert	Zeiss		Used to observe cells in cell culture.
MTT Assay	Biomatik		Used to measure cell viability
NanoSight NS300	Malvern panalytical	Malvern panalytical	Used for exosome characterization
Optima XPN-100 Ultracentrifuge	Beckman Coulter		Used in the exosome isolation step
PBS tablet	Biomatik	43602	In the preparation of the PBS solution
Penicilin/Streptomycin Solution	Capricorn	PB-S	It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Pipette Aid	Isolab
Precision balance-Kern	Kern-ABJ220-4NM		Used in the preparation of solutions
Q500 Sonicator	Qsonica, LLC		Used to digest exosomes in HPLC analysis
Saponin	Sigma	47036-50G-F	It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.
Spectrostar-Nano-Spectrophotometry	BMG LABTECH		Used for MTT and drug release analyzes
SPSS 22			statistical package program
Vorteks-FinePCR	FinePCR-FineVortex		Used to mix solutions homogeneously
Water Bath 37 °C-Senova	Senova		Used in cell culture step
Wharton’s jelly mesenchymal stem cells	ATCC
ZetaSizer	Malvern Nano ZS	Malvern Nano ZS	Used for exosome characterization