Eksozom Tabanlı Dopamin Taşıyıcı Sistemin Formüle Edilmesi ve Karakterize Edilmesi

Summary

Bu çalışmada, Wharton’un jöle mezenkimal kök hücrelerinden izole edilen kök hücrelerin eksozomlarının dopamin yüklemesi ile bir formülasyon elde etmeyi amaçladık. Eksozom izolasyonu ve karakterizasyonu, elde edilen eksozomlara ilaç yüklemesi ve geliştirilen formülasyonun sitotoksik aktivitesi bu protokolde tanımlanmıştır.

Abstract

Boyutları 40 ila 200 nm arasındaki eksozomlar, hücre dışı veziküllerin en küçük alt grubunu oluşturur. Hücreler tarafından salgılanan bu biyoaktif kesecikler, hücreler arası kargo ve iletişimde etkin rol oynar. Eksozomlar çoğunlukla plazma, beyin omurilik sıvısı, idrar, tükürük, amniyon sıvısı, kolostrum, anne sütü, eklem sıvısı, meni ve plevral asit gibi vücut sıvılarında bulunur. Eksozomların büyüklükleri göz önüne alındığında, kan-beyin bariyerini (BBB) geçebildikleri için merkezi sinir sistemi hastalıklarında önemli rol oynayabilecekleri düşünülmektedir. Bu nedenle, bu çalışma, dopamini Wharton’un jöle mezenkimal kök hücrelerinden (WJ-MSC’ler) izole edilen eksozomlara kapsülleyerek eksozom tabanlı bir nanotaşıyıcı sistem geliştirmeyi amaçladı. Karakterizasyon sürecinden geçen eksozomlar dopamin ile inkübe edildi. Dopamin yüklü eksozomlar, inkübasyonun sonunda yeniden karakterize edildi. Dopamin yüklü eksozomlar, ilaç salınımı ve sitotoksisite deneylerinde araştırıldı. Sonuçlar, dopaminin eksozomlar içinde başarılı bir şekilde kapsüllenebildiğini ve dopamin yüklü eksozomların fibroblast canlılığını etkilemediğini gösterdi.

Introduction

Eksozomlar, önemli özelliklere sahip biyoaktif veziküller, boyutları 40 nm ila 200 nm arasında değişir. Eksozomlar hücre zarından kaynaklanır ve endozomların^salınması nedeniyle oluşur 1. Bu yapılar hücreden hücreye iletişimciler olarak görev yapar ve aktif moleküllerin transferini kolaylaştırmak için komşu hücrelerle etkileşime girer. Eksozomlar birçok farklı kaynaktan izole edilebilir. Bunlar, plazma, idrar, beyin omurilik sıvısı, tükürük gibi vücut sıvılarının yanı sıra in vitro koşullar altında kültürlenen hücre dizilerini içerir. Eksozomlar, içerdikleri lipitler, proteinler ve nükleik asitler gibi biyomakromoleküller sayesinde sinir hasarının giderilmesinde önemli bir role sahiptir². Sinir sisteminin³ destek hücreleri olan glia, proteinleri ve mikro RNA’ları eksozomlar⁴ aracılığıyla nöronların aksonlarına aktarır.

Sinir iletiminde karakteristik bir özellik olan miyelin kılıfını oluşturan lipitler de eksozomlar ^4,5 aracılığıyla oligodendrositlerden salınır. Eksozomlar ayrıca sinaptik plastisite, nöronal stres tepkisi, hücre-hücre iletişimi ve beyindeki nörojenez gibi süreçlerde de rol oynar ^6,7. Eksozomların nano boyutlara sahip olması, BBB’den geçmelerini sağlar. Bu zara nüfuz ettikten sonra interstisyel sıvıdan beyin omurilik sıvısına özel bir geçiş yolu vardır⁸. Eksozomlar, yüzey özellikleri sayesinde bir ilaç dağıtım sistemi olarak hedef hücrelerle verimli bir şekilde etkileşime girebilir ve yüklenen ilaçları aktif olarak iletebilir.

Eksozomların yüzeyindeki çeşitli yapışkan proteinlerin (tetraspaninler ve integrinler) ekspresyonu nedeniyle, bu hücre dışı veziküller, konakçı hücre zarları ile kolayca etkileşime girebilir ve kaynaşabilir⁹. Eksozomların BBB’ye nüfuz edebilme yetenekleri ve yüzey özellikleri nedeniyle özellikle merkezi sinir sistemi hastalıklarının tedavisinde ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanılabileceği düşünülmektedir. Mezenkimal kök hücre (MSC) kaynaklı eksozomlar, allojenik hücresel tedavilere kıyasla daha düşük immün reddi riskine sahiptir ve bu açıdan hücresiz tedavi uygulamalarının önemli bir bileşeni olabilirler¹⁰.

Dopamin, beyindeki eksikliği Parkinson hastalığının (PH) karakteristik özelliği olan ve her geçen gün kötüleşen bir moleküldür^11,12,13. PH’nin mezensefalonun substantia nigra’sındaki dopaminerjik nöronların dejenerasyonu ve motor nöron fonksiyonlarının kaybı ile ilişkili olduğu bilinmektedir^14,15. Dopaminerjik nöronların ölümü, nörotransmitter dopaminin beyin striatumuna beslenmesini engeller. Bu da PH’ye özgü semptomların ortaya çıkmasına neden olur¹⁶. PH’nin bu semptomları bradikinezi, postüral instabilite, rijidite ve özellikle istirahat tremorudur^12,13. PH ilk kez iki yüzyıldan daha uzun bir süre önce tanımlanmış olmasına rağmen, hastalığın patolojisini ve etiyolojisini anlamaya yönelik çalışmalar halen devam etmektedir ve günümüzde PH’nin kompleks bir sistemik hastalık olduğu kabul edilmektedir¹⁷. Dopamin eksikliğinin ortaya çıktığı ve nöronların %80’inden fazlasının dejenere olduğu klinik PD semptomlarının gözlendiği öngörülmektedir¹⁸. Hastalığın tedavisinde motor semptomları azaltmak için eksik dopamin takviyesi tercih edilir. İn vivo çalışmalar, dopaminin beyne doğrudan infüzyonunun hayvanlarda semptomları önemli ölçüde azalttığını göstermiştir¹⁹. Klinikte L-DOPA (L-3,4-dihidroksifenilalanin) gibi dopamin öncülleri ve dopamin reseptör ilaçları kullanılmaktadır çünkü insanlarda dopaminin beyne doğrudan infüzyonu mümkün değildir ve sisteme giren dopamin BBB^20’yi geçemez. Bu tür ilaçlar zamanla etkinliğini yitirir. Bununla birlikte, PH için hala küratif bir tedavi yaklaşımı yoktur. Bu nedenle, hastalığın patofizyolojisini ortaya koymak ve PH’nin hastalar üzerindeki etkisini azaltmak için yeni terapötik stratejiler ve tedavi modaliteleri geliştirmeye büyük ihtiyaç vardır.

Eksozom temelli çalışmalar son zamanlarda sinir sistemi hastalıklarının hem terapötik yaklaşımları hem de patolojileri hakkında bilgi toplamak açısından dikkat çekmektedir. MSC kaynaklı eksozomların sinir hasarında inflamasyonu azalttığı ve nöronal rejenerasyona katkıda bulunduğu gösterilmiştir^21,22,23. Ayrıca MSC kaynaklı eksozom sekretomlarının özellikle dopaminerjik nöronlar üzerinde nörotrofik ve nöroprotektif etkiler göstererek apoptozu azalttığı bildirilmiştir^24,25. Eksozomların terapötik ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanıldığı platformlar üzerine yapılan araştırmalar son yıllarda yoğun bir şekilde hızlanmıştır. Çok sayıda çalışmada, ilgili ilaçların eksozomlara kolayca kapsüllenebildiği ve hedef hücrelere, dokulara ve organlara güvenli bir şekilde verilebildiği gözlemlenmiştir^26,27. Eksozomlara ilaç yüklemesi için inkübasyon, donma/çözülme döngüleri, sonikasyon ve ekstrüzyon gibi farklı yöntemler^{kullanılabilir 28}.

Eksozomlar veya eksozom benzeri veziküllerle çakışma, lipofilik küçük moleküllerin bu dağıtım sistemlerine pasif olarak kapsüllenmesine izin verir^28,29,30. Özellikle, kurkumin 31, katalaz³⁰, doksorubisin³² ve paklitaksel³³ gibi çeşitli moleküller eksozomlara etkili bir şekilde yüklendi. Antioksidan aktiviteye sahip olan katalaz içeren eksozomların beyindeki nöronlarda ve mikroglial hücrelerde verimli bir şekilde biriktiği ve güçlü nöroprotektif aktiviteler sergilediği gözlemlenmiştir³⁰. Aynı çalışmada, yükleme verimliliğini artırmak için kompleks içine eklenen saponinin, inkübasyon sırasında ilaç yükleme yüzdesini arttırdığı bulunmuştur^30,34. Bununla birlikte, eksozomlara ilaç yüklemesi için standartları oluşturmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

Bu makale, dopaminin WJ-MSC’lerden izole edilen eksozomlara kapsüllenmesiyle bir nanotaşıyıcı sistemin geliştirilmesini açıklamaktadır. WJ-MSC’lerin kültivasyonu, eksozomların izolasyonu ve karakterizasyonu, ilaç yükleme deneyleri, dopamin yüklü eksozomların çeşitli tekniklerle karakterizasyonu ve in vitro sitotoksisite analizi dahil olmak üzere tüm adımlar ayrıntılı olarak anlatılmaktadır.

Protocol

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzeme ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. 1. Wharton’un jöle mezenkimal kök hücrelerinin kültürlenmesi ve dondurularak saklanması WJ-MSC’leri (ATCC’den) -80 °C dondurucudan çıkarın. Hücreleri,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM-F12 ortamı içeren bir şişeye tohumlayın. % 5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 ° C’de inkübe edin. <li…

Representative Results

Eksozom izolasyonu ve karakterizasyonuWharton jöle kök hücreleri kültürlenir ve kültür yeterli yoğunluğa ulaştığında 48 saat boyunca serumsuz bir ortamda inkübe edilir. İnkübasyonun bitiminden sonra, süpernatan -20 ° C’de saklanır. Toplanan süpernatanlar PBS ile seyreltilir ve ultrasantrifüjlemeye tabi tutulur (Şekil 1). Elde edilen çözelti NTA ve DLS analizleri ile analiz edilmiştir. Eksozomlar 0.22 μm’lik bir filtreden geçirilerek sterilize …

Discussion

Eksozomlar, çoğu hücre tipi, örneğin MSC’ler¹ tarafından salgılanan 40-200 nm boyutlarında küçük zar vezikülleridir. Hücreler arasındaki iletişimi sağlayabilen eksozomlar, hücrelere endositoz, fagositoz, mikropinositoz, lipid aracılı içselleştirme ve füzyon gibi farklı yollarla girebilirler^33,44. Diğer nanotaşıyıcı sistemlerle karşılaştırıldığında, eksozom yüzeyinde bulunan lipitler ve kolesterol, hem h…

Materials

0.22 µm membrane filter	Aisimo		Used for the sterilization process
0.45 µm syringe filter	Aisimo		Used for the sterilization process
15 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
50 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
96 well plates (Falcon, TPP microplates)	Merck Millipore		Used in cell culture step
Acetonitrile	Sigma	271004-1L	Used for HPLC analysis
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process
Cell Culture Cabin	Hera Safe KS		Used for the cell culture process
Centrifugal	Hitachi	CF16RN	Used in the exosome isolation step
CO2 incubator with Safe Cell UV	Panasonic		Used for the cell culture process
Dopamine hydrochloride H8502-10G	Sigma	H8502-10G	Used in exosome dopamine loading
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Used as cell culture medium
Fetal Bovine Serum-FBS	Capricorn	FBS-16A	It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	To store cells and the resulting exosomes
Fridge	Panasonic	MPR-215-PE	Used to store cell culture and other materials
High performance liquid chromatography-HPLC	Agilent Technologies		The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.
Microscope- Primovert	Zeiss		Used to observe cells in cell culture.
MTT Assay	Biomatik		Used to measure cell viability
NanoSight NS300	Malvern panalytical	Malvern panalytical	Used for exosome characterization
Optima XPN-100 Ultracentrifuge	Beckman Coulter		Used in the exosome isolation step
PBS tablet	Biomatik	43602	In the preparation of the PBS solution
Penicilin/Streptomycin Solution	Capricorn	PB-S	It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Pipette Aid	Isolab
Precision balance-Kern	Kern-ABJ220-4NM		Used in the preparation of solutions
Q500 Sonicator	Qsonica, LLC		Used to digest exosomes in HPLC analysis
Saponin	Sigma	47036-50G-F	It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.
Spectrostar-Nano-Spectrophotometry	BMG LABTECH		Used for MTT and drug release analyzes
SPSS 22			statistical package program
Vorteks-FinePCR	FinePCR-FineVortex		Used to mix solutions homogeneously
Water Bath 37 °C-Senova	Senova		Used in cell culture step
Wharton’s jelly mesenchymal stem cells	ATCC
ZetaSizer	Malvern Nano ZS	Malvern Nano ZS	Used for exosome characterization