Formulazione e caratterizzazione di un sistema di trasporto della dopamina basato sugli esosomi

Summary

Qui, abbiamo mirato ad ottenere una formulazione caricando dopamina degli esosomi isolati di cellule staminali dalle cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton. In questo protocollo vengono descritti l’isolamento e la caratterizzazione degli esosomi, il caricamento del farmaco negli esosomi risultanti e l’attività citotossica della formulazione sviluppata.

Abstract

Gli esosomi di dimensioni comprese tra 40 e 200 nm costituiscono il sottogruppo più piccolo di vescicole extracellulari. Queste vescicole bioattive secrete dalle cellule svolgono un ruolo attivo nel carico e nella comunicazione intercellulare. Gli esosomi si trovano principalmente nei fluidi corporei come plasma, liquido cerebrospinale, urina, saliva, liquido amniotico, colostro, latte materno, liquido articolare, sperma e acido pleurico. Considerando le dimensioni degli esosomi, si pensa che possano svolgere un ruolo importante nelle malattie del sistema nervoso centrale perché possono passare attraverso la barriera emato-encefalica (BBB). Quindi, questo studio mirava a sviluppare un sistema di nanocarrier basato sugli esosomi incapsulando la dopamina in esosomi isolati dalle cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton (WJ-MSCs). Gli esosomi che hanno superato il processo di caratterizzazione sono stati incubati con dopamina. Gli esosomi carichi di dopamina sono stati ricaratterizzati alla fine dell’incubazione. Gli esosomi carichi di dopamina sono stati studiati in saggi di rilascio di farmaci e citotossicità. I risultati hanno mostrato che la dopamina poteva essere incapsulata con successo all’interno degli esosomi e che gli esosomi carichi di dopamina non influenzavano la vitalità dei fibroblasti.

Introduction

Gli esosomi, vescicole bioattive con caratteristiche significative, hanno dimensioni comprese tra 40 nm e 200 nm. Gli esosomi hanno origine dalla membrana cellulare e si formano a causa del rilascio degli endosomi¹. Queste strutture fungono da comunicatori cellula-cellula e interagiscono con le cellule vicine per facilitare il trasferimento di molecole attive. Gli esosomi possono essere isolati da molte fonti diverse. Questi includono fluidi corporei come plasma, urina, liquido cerebrospinale, saliva e linee cellulari coltivate in condizioni di vitro . Gli esosomi hanno un ruolo importante nell’eliminazione dei danni ai nervi, grazie alle biomacromolecole che contengono, come lipidi, proteine e acidi nucleici². La glia, che sono le cellule di supporto del sistema nervoso³, trasferisce proteine e micro RNA agli assoni dei neuroni attraverso gli esosomi⁴.

I lipidi che formano la guaina mielica, che sono una caratteristica della conduzione nervosa, vengono rilasciati anche dagli oligodendrociti attraverso gli esosomi ^4,5. Gli esosomi sono anche coinvolti in processi come la plasticità sinaptica, la risposta allo stress neuronale, la comunicazione cellula-cellula e la neurogenesi nel cervello ^6,7. Il fatto che gli esosomi possiedano dimensioni nanometriche consente loro di passare attraverso la BBB. Esiste una speciale via di transizione dal liquido interstiziale al liquido cerebrospinale dopo essere penetrata in questa membrana⁸. Grazie alle loro proprietà superficiali, gli esosomi possono interagire in modo efficiente con le cellule bersaglio come sistema di somministrazione dei farmaci e rilasciare attivamente i farmaci caricati.

A causa dell’espressione di varie proteine adesive (tetraspanine e integrine) sulla superficie degli esosomi, queste vescicole extracellulari possono facilmente interagire e fondersi con le membrane della cellula ospite⁹. Si ritiene che gli esosomi possano essere utilizzati come sistema di somministrazione di farmaci, soprattutto nel trattamento delle malattie del sistema nervoso centrale grazie alla loro capacità di penetrare nella BBB e alle loro proprietà superficiali. Gli esosomi derivati da cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno un rischio inferiore di rigetto immunitario rispetto alle terapie cellulari allogeniche e, a questo proposito, possono essere una componente importante delle applicazioni di trattamento senza cellule¹⁰.

La dopamina è una molecola la cui carenza nel cervello è la caratteristica del morbo di Parkinson (PD), peggiorando di giorno in giorno^11,12,13. È noto che la malattia di Parkinson è associata alla degenerazione dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra del mesencefalo e alla perdita delle funzioni dei motoneuroni^14,15. La morte dei neuroni dopaminergici impedisce l’apporto del neurotrasmettitore dopamina allo striato cerebrale. Questo, a sua volta, provoca l’emergere di sintomi specifici del morbo di Parkinson¹⁶. Questi sintomi della malattia di Parkinson sono la bradicinesia, l’instabilità posturale, la rigidità e soprattutto il tremore a riposo^12,13. Sebbene la malattia di Parkinson sia stata descritta per la prima volta più di due secoli fa, gli studi per comprendere la patologia e l’eziologia della malattia sono ancora in corso ed è attualmente accettato che la malattia di Parkinson sia una malattia sistemica complessa¹⁷. Si prevede che si verifichi una carenza di dopamina e si osservano sintomi clinici di Parkinson quando oltre l’80% dei neuroni degenera¹⁸. Nel trattamento della malattia, l’integrazione incompleta di dopamina è preferita per ridurre i sintomi motori. Studi in vivo hanno dimostrato che l’infusione diretta di dopamina nel cervello riduce significativamente i sintomi negli animali¹⁹. I precursori della dopamina come la L-DOPA (L-3,4-diidrossifenilalanina) e i farmaci del recettore della dopamina sono utilizzati in clinica perché l’infusione diretta di dopamina nel cervello non è possibile negli esseri umani e la dopamina che entra nel sistema non può attraversare la BBB²⁰. Questi tipi di farmaci perdono la loro efficacia nel tempo. Tuttavia, non esiste ancora un approccio terapeutico curativo per la malattia di Parkinson. Quindi, c’è un’enorme necessità di sviluppare nuove strategie terapeutiche e modalità di trattamento per rivelare la fisiopatologia della malattia e ridurre l’impatto della malattia sui pazienti.

Gli studi basati sugli esosomi hanno recentemente attirato l’attenzione per la raccolta di informazioni sia sugli approcci terapeutici che sulle patologie delle malattie del sistema nervoso. È stato dimostrato che gli esosomi derivati dalle MSC riducono l’infiammazione nel danno ai nervi e contribuiscono alla rigenerazione neuronale^21,22,23. Inoltre, è stato riportato che i secretomi esosomici derivati da MSC riducono l’apoptosi mostrando effetti neurotrofici e neuroprotettivi, in particolare sui neuroni dopaminergici^24,25. La ricerca sulle piattaforme in cui gli esosomi sono utilizzati come sistemi terapeutici di somministrazione di farmaci ha subito un’intensa accelerazione negli ultimi anni. In numerosi studi, è stato osservato che i farmaci rilevanti possono essere facilmente incapsulati negli esosomi e somministrati in modo sicuro nelle cellule, nei tessuti e negli organi bersaglio^26,27. Diversi metodi come l’incubazione, i cicli di congelamento/scongelamento, la sonicazione e l’estrusione potrebbero essere utilizzati per il caricamento del farmaco negli esosomi²⁸.

La coincubazione con esosomi o vescicole simili agli esosomi consente di incapsulare passivamente piccole molecole lipofile in questi sistemi di rilascio^28,29,30. In particolare, varie molecole come la curcumina 31, la catalasi³⁰, la doxorubicina³² e il paclitaxel³³ sono state efficacemente caricate negli esosomi. È stato osservato che gli esosomi contenenti catalasi, che hanno attività antiossidante, si accumulavano in modo efficiente nei neuroni e nelle cellule microgliali del cervello e mostravano forti attività neuroprotettive³⁰. Nello stesso studio, è stato riscontrato che la saponina, aggiunta al complesso per aumentare l’efficienza di caricamento, aumenta la percentuale di carico del farmaco durante l’incubazione^30,34. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per stabilire gli standard per il caricamento del farmaco negli esosomi.

Questo articolo descrive lo sviluppo di un sistema di nanocarrier mediante incapsulamento della dopamina in esosomi che sono stati isolati da WJ-MSCs. Tutte le fasi, tra cui la coltivazione di WJ-MSC, l’isolamento e la caratterizzazione degli esosomi, gli esperimenti di carico farmacologico, la caratterizzazione degli esosomi carichi di dopamina con varie tecniche e l’analisi della citotossicità in vitro sono spiegate in dettaglio.

Protocol

NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e le attrezzature utilizzati in questo protocollo. 1. Coltura e crioconservazione di cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton Rimuovere i WJ-MSC (dall’ATCC) dal congelatore a -80 °C. Seminare le cellule in un matraccio contenente terreno DMEM-F12 integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS). Incubarli a 37 °C in un incubatore contenente il 5% di CO<su…

Representative Results

Isolamento e caratterizzazione degli esosomiLe cellule staminali della gelatina Wharton vengono coltivate e incubate in un terreno privo di siero per 48 ore quando la coltura raggiunge una densità sufficiente. Al termine dell’incubazione, il surnatante viene conservato a -20 °C. I surnatanti raccolti vengono diluiti con PBS e sottoposti a ultracentrifugazione (Figura 1). La soluzione ottenuta viene analizzata mediante analisi NTA e DLS. Gli esosomi vengono sterilizzat…

Discussion

Gli esosomi sono piccole vescicole di membrana con dimensioni di 40-200 nm secrete dalla maggior parte dei tipi di cellule, ad esempio le MSC¹. In grado di consentire la comunicazione tra le cellule, gli esosomi possono entrare nelle cellule in diversi modi come l’endocitosi, la fagocitosi, la micropinocitosi, l’internalizzazione mediata dai lipidi e la fusione^33,44. Rispetto ad altri sistemi di nanocarrier, i lipidi e il colesterolo prese…

Materials

0.22 µm membrane filter	Aisimo		Used for the sterilization process
0.45 µm syringe filter	Aisimo		Used for the sterilization process
15 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
50 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
96 well plates (Falcon, TPP microplates)	Merck Millipore		Used in cell culture step
Acetonitrile	Sigma	271004-1L	Used for HPLC analysis
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process
Cell Culture Cabin	Hera Safe KS		Used for the cell culture process
Centrifugal	Hitachi	CF16RN	Used in the exosome isolation step
CO2 incubator with Safe Cell UV	Panasonic		Used for the cell culture process
Dopamine hydrochloride H8502-10G	Sigma	H8502-10G	Used in exosome dopamine loading
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Used as cell culture medium
Fetal Bovine Serum-FBS	Capricorn	FBS-16A	It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	To store cells and the resulting exosomes
Fridge	Panasonic	MPR-215-PE	Used to store cell culture and other materials
High performance liquid chromatography-HPLC	Agilent Technologies		The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.
Microscope- Primovert	Zeiss		Used to observe cells in cell culture.
MTT Assay	Biomatik		Used to measure cell viability
NanoSight NS300	Malvern panalytical	Malvern panalytical	Used for exosome characterization
Optima XPN-100 Ultracentrifuge	Beckman Coulter		Used in the exosome isolation step
PBS tablet	Biomatik	43602	In the preparation of the PBS solution
Penicilin/Streptomycin Solution	Capricorn	PB-S	It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Pipette Aid	Isolab
Precision balance-Kern	Kern-ABJ220-4NM		Used in the preparation of solutions
Q500 Sonicator	Qsonica, LLC		Used to digest exosomes in HPLC analysis
Saponin	Sigma	47036-50G-F	It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.
Spectrostar-Nano-Spectrophotometry	BMG LABTECH		Used for MTT and drug release analyzes
SPSS 22			statistical package program
Vorteks-FinePCR	FinePCR-FineVortex		Used to mix solutions homogeneously
Water Bath 37 °C-Senova	Senova		Used in cell culture step
Wharton’s jelly mesenchymal stem cells	ATCC
ZetaSizer	Malvern Nano ZS	Malvern Nano ZS	Used for exosome characterization