エクソソームベースのドーパミンキャリアシステムの定式化と特性評価
Summary
ここでは、ウォートンゼリー間葉系幹細胞から幹細胞の単離エクソソームをドーパミン負荷することで製剤を得ることを目指しました。エキソソームの単離と特性評価、得られたエクソソームへの薬物負荷、および開発された製剤の細胞毒性活性は、このプロトコルで説明されています。
Abstract
サイズが40〜200nmのエクソソームは、細胞外小胞の最小サブグループを構成します。細胞から分泌されるこれらの生理活性小胞は、細胞間のカーゴやコミュニケーションに積極的な役割を果たしています。エクソソームは、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、羊水、初乳、母乳、関節液、精液、胸膜などの体液に多く含まれています。エクソソームは、その大きさから、血液脳関門(BBB)を通過できることから、中枢神経系疾患において重要な役割を担っているのではないかと考えられます。そこで本研究では、ウォートンゼリー間葉系幹細胞(WJ-MSC)から単離したエクソソームにドーパミンを内包することで、エクソソームを用いたナノキャリアシステムの開発を目指しました。特性評価プロセスに合格したエクソソームをドーパミンとインキュベートしました。ドーパミンをロードしたエクソソームは、インキュベーションの最後に再特徴付けされました。ドーパミンをロードしたエクソソームを、薬物放出および細胞毒性アッセイで調査しました。その結果、ドーパミンがエクソソーム内にうまくカプセル化され、ドーパミンをロードしたエクソソームが線維芽細胞の生存率に影響を与えないことが示されました。
Introduction
重要な特徴を持つ生理活性小胞であるエクソソームは、40nmから200nmまでの大きさです。エクソソームは細胞膜に由来し、エンドソーム1の放出によって形成される。これらの構造は、細胞間コミュニケーターとして機能し、隣接する細胞と相互作用して活性分子の移動を促進します。エクソソームは、多くの異なる供給源から単離することができます。これらには、血漿、尿、脳脊髄液、唾液などの体液、および in vitro 条件下で培養された細胞株が含まれます。エクソソームは、脂質、タンパク質、核酸などの生体高分子を含むため、神経損傷の除去に重要な役割を果たします2。神経系の支持細胞であるグリアは3、エクソソーム を介して タンパク質やマイクロRNAをニューロンの軸索に伝達します4。
神経伝導の特徴であるミエリン鞘を形成する脂質も、エクソソームを介してオリゴデンドロサイトから放出される4,5。エクソソームは、シナプス可塑性、ニューロンストレス応答、細胞間コミュニケーション、脳内のニューロン新生などのプロセスにも関与しています6,7。エクソソームはナノ次元を持っているため、BBBを通過することができます。この膜8を貫通した後、間質液から脳脊髄液への特別な移行経路がある。エクソソームは、その表面特性により、薬物送達システムとして標的細胞と効率的に相互作用し、負荷された薬物を能動的に送達することができます。
エクソソームの表面には様々な接着性タンパク質(テトラスパニンおよびインテグリン)が発現しているため、これらの細胞外小胞は宿主細胞膜と容易に相互作用し、融合することができる9。エクソソームは、BBBに浸透する能力とその表面特性により、特に中枢神経系疾患の治療において、薬物送達システムとして使用できると考えられています。間葉系幹細胞(MSC)由来のエクソソームは、同種細胞療法と比較して免疫拒絶反応のリスクが低く、この点で、無細胞治療アプリケーションの重要な要素となり得る10。
ドーパミンは、脳内の欠乏がパーキンソン病(PD)の特徴である分子であり、日々悪化します11,12,13。PDは、中脳の黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの変性および運動ニューロン機能の喪失と関連していることが知られている14,15。ドーパミン作動性ニューロンの死は、神経伝達物質ドーパミンの脳線条体への供給を妨げる。その結果、PD特異的な症状が出現する16。PDのこれらの症状は、運動緩慢、姿勢の不安定性、硬直、特に安静時の振戦です12,13。パーキンソン病は2世紀以上前に初めて記述されたが、この疾患の病理学と病因を理解するための研究はまだ進行中であり、現在、パーキンソン病は複雑な全身性疾患であることが認められている17。ドーパミン欠乏症が起こり、神経細胞の80%以上が変性すると臨床的PD症状がみられると予測されている18。この疾患の治療では、運動症状を軽減するために不完全なドーパミン補給が好まれます。In vivo研究では、ドーパミンを脳に直接注入すると、動物の症状が大幅に軽減されることが示されています19。L-DOPA(L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン)やドーパミン受容体薬などのドーパミン前駆体は、ヒトでは脳へのドーパミンの直接注入が不可能であり、体内に入るドーパミンがBBB20を通過できないため、診療所で使用されています。これらのタイプの薬は、時間の経過とともに効果を失います。したがって、疾患の病態生理を明らかにし、PDの患者への影響を軽減するために、新しい治療戦略と治療法を開発することが非常に必要です。
近年、エクソソームを用いた研究は、神経系疾患の治療法と病態の双方に関する情報収集として注目されています。MSC由来のエクソソームは、神経損傷の炎症を軽減し、神経細胞の再生に寄与することが示されています21,22,23。さらに、MSC由来のエクソソームセクレトームは、特にドーパミン作動性ニューロンに対して神経栄養作用および神経保護作用を示すことにより、アポトーシスを減少させることが報告されています24,25。近年、エクソソームを治療用薬物送達システムとして用いるプラットフォームの研究が加速しています。多くの研究において、関連する薬物はエキソソームに容易にカプセル化され、標的細胞、組織、および臓器に安全に送達できることが観察されています26,27。インキュベーション、凍結/融解サイクル、超音波処理、および押出成形などのさまざまな方法を、エキソソームへの薬物ローディングに用いることができる28。
エキソソームまたはエキソソーム様小胞とのコインキュベーションにより、親油性小分子をこれらの送達システムに受動的にカプセル化することができます28,29,30。特に、クルクミン31、カタラーゼ30、ドキソルビシン32、パクリタキセル33などの様々な分子がエクソソームに効果的にロードされました。抗酸化活性を持つカタラーゼ含有エクソソームは、脳内の神経細胞やミクログリア細胞に効率よく蓄積し、強い神経保護活性を示すことが観察されている30。同じ研究では、ローディング効率を高めるために複合体に添加されたサポニンは、インキュベーション中の薬物ローディング率を増加させることがわかりました30,34。しかし、エクソソームへの薬物負荷の基準を確立するには、さらなる研究が必要です。
本稿では、WJ-MSCから単離したエクソソームにドーパミンをカプセル化することで、ナノキャリアシステムを開発した。WJ-MSCの培養、エクソソームの単離と特性評価、薬物ローディング実験、さまざまな技術によるドーパミン負荷エクソソームの特性評価、 in vitro 細胞毒性分析など、すべてのステップが詳細に説明されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
エキソソームは、ほとんどの細胞タイプ(MSC1など)から分泌される40〜200nmの寸法の小さな膜小胞です。細胞間のコミュニケーションを可能にすることができるエクソソームは、エンドサイトーシス、食作用、ミクロピノサイトーシス、脂質媒介性内在化、融合など、さまざまな方法で細胞に侵入することができます33,44。他のナノ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、主にユルドゥズ工科大学科学研究プロジェクト(TSA-2021-4713)から提供された研究資金によって支援されました。
Materials
| 0.22 µm membrane filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 0.45 µm syringe filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 15 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| Acetonitrile | Sigma | 271004-1L | Used for HPLC analysis |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process | |
| Cell Culture Cabin | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Centrifugal | Hitachi | CF16RN | Used in the exosome isolation step |
| CO2 incubator with Safe Cell UV | Panasonic | Used for the cell culture process | |
| Dopamine hydrochloride H8502-10G | Sigma | H8502-10G | Used in exosome dopamine loading |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | To store cells and the resulting exosomes |
| Fridge | Panasonic | MPR-215-PE | Used to store cell culture and other materials |
| High performance liquid chromatography-HPLC | Agilent Technologies | The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated. | |
| Microscope- Primovert | Zeiss | Used to observe cells in cell culture. | |
| MTT Assay | Biomatik | Used to measure cell viability | |
| NanoSight NS300 | Malvern panalytical | Malvern panalytical | Used for exosome characterization |
| Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Used in the exosome isolation step | |
| PBS tablet | Biomatik | 43602 | In the preparation of the PBS solution |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Pipette Aid | Isolab | ||
| Precision balance-Kern | Kern-ABJ220-4NM | Used in the preparation of solutions | |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Used to digest exosomes in HPLC analysis | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process. |
| Spectrostar-Nano-Spectrophotometry | BMG LABTECH | Used for MTT and drug release analyzes | |
| SPSS 22 | statistical package program | ||
| Vorteks-FinePCR | FinePCR-FineVortex | Used to mix solutions homogeneously | |
| Water Bath 37 °C-Senova | Senova | Used in cell culture step | |
| Wharton’s jelly mesenchymal stem cells | ATCC | ||
| ZetaSizer | Malvern Nano ZS | Malvern Nano ZS | Used for exosome characterization |
Referências
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