Formuleren en karakteriseren van een op exosomen gebaseerd dopamine-dragersysteem

Summary

Hier wilden we een formulering verkrijgen door dopamine te laden van de geïsoleerde exosomen van stamcellen uit Wharton’s gelei mesenchymale stamcellen. Exosoomisolatie en karakterisering, het laden van geneesmiddelen in de resulterende exosomen en de cytotoxische activiteit van de ontwikkelde formulering worden in dit protocol beschreven.

Abstract

Exosomen tussen 40 en 200 nm groot vormen de kleinste subgroep van extracellulaire blaasjes. Deze bioactieve blaasjes die door cellen worden uitgescheiden, spelen een actieve rol bij intercellulaire lading en communicatie. Exosomen worden meestal aangetroffen in lichaamsvloeistoffen zoals plasma, hersenvocht, urine, speeksel, vruchtwater, colostrum, moedermelk, gewrichtsvloeistof, sperma en pleurazuur. Gezien de grootte van exosomen, wordt gedacht dat ze een belangrijke rol kunnen spelen bij ziekten van het centrale zenuwstelsel, omdat ze de bloed-hersenbarrière (BBB) kunnen passeren. Daarom was deze studie gericht op het ontwikkelen van een op exosomen gebaseerd nanodragersysteem door dopamine in te kapselen in exosomen geïsoleerd uit Wharton’s gelei mesenchymale stamcellen (WJ-MSC’s). Exosomen die het karakteriseringsproces doorstonden, werden geïncubeerd met dopamine. De met dopamine beladen exosomen werden aan het einde van de incubatie opnieuw gekarakteriseerd. Met dopamine beladen exosomen werden onderzocht in tests voor de afgifte van geneesmiddelen en cytotoxiciteit. De resultaten toonden aan dat dopamine met succes kon worden ingekapseld in de exosomen en dat de met dopamine beladen exosomen de levensvatbaarheid van fibroblasten niet beïnvloedden.

Introduction

Exosomen, bioactieve blaasjes met belangrijke kenmerken, variëren in grootte van 40 nm tot 200 nm. Exosomen zijn afkomstig van het celmembraan en worden gevormd door het vrijkomen van de endosomen¹. Deze structuren dienen als cel-tot-cel communicatoren en interageren met naburige cellen om de overdracht van actieve moleculen te vergemakkelijken. Exosomen kunnen uit veel verschillende bronnen worden geïsoleerd. Deze omvatten lichaamsvloeistoffen zoals plasma, urine, hersenvocht, speeksel, evenals cellijnen die onder in vitro omstandigheden zijn gekweekt. Exosomen spelen een belangrijke rol bij de eliminatie van zenuwbeschadiging, dankzij de biomacromoleculen die ze bevatten, zoals lipiden, eiwitten en nucleïnezuren^. Glia, de ondersteunende cellen van het zenuwstelsel³, brengen eiwitten en micro-RNA’s over naar de axonen van neuronen via exosomen⁴.

Lipiden die de myelineschede vormen, die een kenmerkend kenmerk zijn van zenuwgeleiding, worden ook vrijgegeven uit oligodendrocyten via exosomen ^4,5. Exosomen zijn ook betrokken bij processen zoals synaptische plasticiteit, neuronale stressrespons, cel-celcommunicatie en neurogenese in de hersenen ^6,7. Het feit dat exosomen nano-dimensies hebben, stelt ze in staat om door de BBB te gaan. Er is een speciale overgangsroute van de interstitiële vloeistof naar de cerebrospinale vloeistof na penetratie van dit membraan⁸. Dankzij hun oppervlakte-eigenschappen kunnen exosomen efficiënt interageren met doelcellen als een medicijnafgiftesysteem en de geladen medicijnen actief afleveren.

Door de expressie van verschillende adhesieve eiwitten (tetraspanines en integrinen) op het oppervlak van exosomen, kunnen deze extracellulaire blaasjes gemakkelijk interageren en versmelten met gastheercelmembranen⁹. Er wordt gedacht dat exosomen kunnen worden gebruikt als een medicijnafgiftesysteem, vooral bij de behandeling van ziekten van het centrale zenuwstelsel vanwege hun vermogen om de BBB binnen te dringen en hun oppervlakte-eigenschappen. Van mesenchymale stamcellen (MSC) afgeleide exosomen hebben een lager risico op immuunafstoting in vergelijking met allogene cellulaire therapieën, en in dit opzicht kunnen ze een belangrijk onderdeel zijn van celvrije behandelingstoepassingen¹⁰.

Dopamine is een molecuul waarvan het tekort in de hersenen het kenmerkende kenmerk is van de ziekte van Parkinson (PD), dat met de dag verergert^11,12,13. Het is bekend dat PD geassocieerd is met degeneratie van dopaminerge neuronen in de substantia nigra van het mesencephalon en verlies van motorneuronfuncties^14,15. De dood van dopaminerge neuronen verhindert de toevoer van de neurotransmitter dopamine naar het hersenstriatum. Dit resulteert op zijn beurt in het ontstaan van PD-specifieke symptomen¹⁶. Deze symptomen van PD zijn bradykinesie, houdingsinstabiliteit, stijfheid en vooral rusttremor^12,13. Hoewel PD meer dan twee eeuwen geleden voor het eerst werd beschreven, zijn er nog steeds studies gaande om de pathologie en etiologie van de ziekte te begrijpen en wordt momenteel aangenomen dat PD een complexe systemische ziekte is¹⁷. Er wordt voorspeld dat dopamine-deficiëntie optreedt en klinische PD-symptomen worden waargenomen wanneer meer dan 80% van de neuronen degenereert¹⁸. Bij de behandeling van de ziekte wordt de voorkeur gegeven aan onvolledige dopaminesuppletie om motorische symptomen te verminderen. In vivo studies hebben aangetoond dat directe infusie van dopamine in de hersenen de symptomen bij dieren aanzienlijk vermindert¹⁹. Dopamine-precursoren zoals L-DOPA (L-3,4-dihydroxyfenylalanine) en dopaminereceptorgeneesmiddelen worden in de kliniek gebruikt omdat de directe infusie van dopamine in de hersenen bij mensen niet mogelijk is en dopamine die het systeem binnenkomt de BBB²⁰ niet kan passeren. Dit soort medicijnen verliezen na verloop van tijd hun effectiviteit. Er is echter nog steeds geen curatieve behandelingsaanpak voor PD. Daarom is er een enorme noodzaak om nieuwe therapeutische strategieën en behandelingsmodaliteiten te ontwikkelen om de pathofysiologie van de ziekte te onthullen en de impact van PD op patiënten te verminderen.

Op exosomen gebaseerde studies hebben onlangs de aandacht getrokken voor het verzamelen van informatie over zowel therapeutische benaderingen als pathologieën van ziekten van het zenuwstelsel. Van MSC-afgeleide exosomen is aangetoond dat ze ontstekingen bij zenuwbeschadiging verminderen en bijdragen aan neuronale regeneratie^21,22,23. Bovendien is gemeld dat MSC-afgeleide exosoomsecretomen apoptose verminderen door neurotrofe en neuroprotectieve effecten te vertonen, vooral op dopaminerge neuronen^24,25. Onderzoek naar platforms waarin exosomen worden gebruikt als therapeutische medicijnafgiftesystemen is de afgelopen jaren intensief versneld. In talrijke onderzoeken is waargenomen dat relevante geneesmiddelen gemakkelijk kunnen worden ingekapseld in exosomen en veilig kunnen worden afgeleverd in doelcellen, weefsels en organen^26,27. Verschillende methoden, zoals incubatie, vries-/dooicycli, sonicatie en extrusie, kunnen worden gebruikt voor het laden van geneesmiddelen in exosomen²⁸.

Coincubatie met exosomen of exosoomachtige blaasjes maakt het mogelijk om lipofiele kleine moleculen passief in te kapselen in deze afgiftesystemen^28,29,30. In het bijzonder werden verschillende moleculen zoals curcumine 31, catalase 30, doxorubicine³² en paclitaxel³³ effectief in exosomen geladen. Er is waargenomen dat catalase-bevattende exosomen, die een antioxiderende werking hebben, zich efficiënt ophoopten in de neuronen en microgliacellen in de hersenen en sterke neuroprotectieve activiteiten vertoonden³⁰. In dezelfde studie bleek saponine, dat aan het complex werd toegevoegd om de laadefficiëntie te verhogen, het laadpercentage van het geneesmiddel tijdens de incubatie te verhogen^30,34. Er zijn echter verdere studies nodig om de normen vast te stellen voor het laden van geneesmiddelen in exosomen.

Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van een nanodragersysteem door dopamine in te kapselen in exosomen die werden geïsoleerd uit WJ-MSC’s. Alle stappen, waaronder het kweken van WJ-MSC’s, isolatie en karakterisering van exosomen, experimenten met het laden van geneesmiddelen, karakterisering van dopamine-geladen exosomen met verschillende technieken en in vitro cytotoxiciteitsanalyse worden de detail uitgelegd.

Protocol

OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt. 1. Kweken en cryopreservatie van mesenchymale stamcellen van Wharton’s jelly Haal de WJ-MSC’s (van ATCC) uit de vriezer van -80 °C. Zaai de cellen in een kolf met DMEM-F12-medium, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). Incubeer ze bij 37 °C in een incubator met 5% CO2 . Verander het kweekmedi…

Representative Results

Exosoomisolatie en karakteriseringWharton jelly-stamcellen worden gekweekt en geïncubeerd in een serumvrij medium gedurende 48 uur wanneer de cultuur voldoende dichtheid bereikt. Na het einde van de incubatie wordt het supernatans opgeslagen bij -20 °C. De verzamelde supernatanten worden verdund met PBS en onderworpen aan ultracentrifugatie (figuur 1). De verkregen oplossing wordt geanalyseerd door middel van NTA- en DLS-analyses. De exosomen worden gesteriliseerd doo…

Discussion

Exosomen zijn kleine membraanblaasjes met afmetingen van 40-200 nm die worden uitgescheiden door de meeste celtypen, bijvoorbeeld MSC’s¹. Exosomen zijn in staat om communicatie tussen cellen mogelijk te maken en kunnen cellen op verschillende manieren binnendringen, zoals endocytose, fagocytose, micropinocytose, lipide-gemedieerde internalisatie en fusie^33,44. In vergelijking met andere nanodragersystemen verlenen de lipiden en cholesterol…

Materials

0.22 µm membrane filter	Aisimo		Used for the sterilization process
0.45 µm syringe filter	Aisimo		Used for the sterilization process
15 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
50 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
96 well plates (Falcon, TPP microplates)	Merck Millipore		Used in cell culture step
Acetonitrile	Sigma	271004-1L	Used for HPLC analysis
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process
Cell Culture Cabin	Hera Safe KS		Used for the cell culture process
Centrifugal	Hitachi	CF16RN	Used in the exosome isolation step
CO2 incubator with Safe Cell UV	Panasonic		Used for the cell culture process
Dopamine hydrochloride H8502-10G	Sigma	H8502-10G	Used in exosome dopamine loading
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Used as cell culture medium
Fetal Bovine Serum-FBS	Capricorn	FBS-16A	It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	To store cells and the resulting exosomes
Fridge	Panasonic	MPR-215-PE	Used to store cell culture and other materials
High performance liquid chromatography-HPLC	Agilent Technologies		The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.
Microscope- Primovert	Zeiss		Used to observe cells in cell culture.
MTT Assay	Biomatik		Used to measure cell viability
NanoSight NS300	Malvern panalytical	Malvern panalytical	Used for exosome characterization
Optima XPN-100 Ultracentrifuge	Beckman Coulter		Used in the exosome isolation step
PBS tablet	Biomatik	43602	In the preparation of the PBS solution
Penicilin/Streptomycin Solution	Capricorn	PB-S	It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Pipette Aid	Isolab
Precision balance-Kern	Kern-ABJ220-4NM		Used in the preparation of solutions
Q500 Sonicator	Qsonica, LLC		Used to digest exosomes in HPLC analysis
Saponin	Sigma	47036-50G-F	It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.
Spectrostar-Nano-Spectrophotometry	BMG LABTECH		Used for MTT and drug release analyzes
SPSS 22			statistical package program
Vorteks-FinePCR	FinePCR-FineVortex		Used to mix solutions homogeneously
Water Bath 37 °C-Senova	Senova		Used in cell culture step
Wharton’s jelly mesenchymal stem cells	ATCC
ZetaSizer	Malvern Nano ZS	Malvern Nano ZS	Used for exosome characterization