Formulierung und Charakterisierung eines Exosom-basierten Dopaminträgersystems

Summary

Hier haben wir uns zum Ziel gesetzt, eine Formulierung durch Dopaminbeladung der isolierten Exosomen von Stammzellen aus Whartons mesenchymalen Jelly-Stammzellen zu erhalten. Die Isolierung und Charakterisierung von Exosomen, die Wirkstoffbeladung der resultierenden Exosomen und die zytotoxische Aktivität der entwickelten Formulierung werden in diesem Protokoll beschrieben.

Abstract

Exosomen zwischen 40 und 200 nm Größe bilden die kleinste Untergruppe der extrazellulären Vesikel. Diese bioaktiven Vesikel, die von Zellen abgesondert werden, spielen eine aktive Rolle bei der interzellulären Fracht und Kommunikation. Exosomen kommen meist in Körperflüssigkeiten wie Plasma, Liquor, Urin, Speichel, Fruchtwasser, Kolostrum, Muttermilch, Gelenkflüssigkeit, Sperma und Pleurasäure vor. In Anbetracht der Größe der Exosomen wird angenommen, dass sie eine wichtige Rolle bei Erkrankungen des zentralen Nervensystems spielen könnten, da sie die Blut-Hirn-Schranke (BHS) passieren können. Daher zielte diese Studie darauf ab, ein auf Exosomen basierendes Nanocarrier-System zu entwickeln, indem Dopamin in Exosomen eingekapselt wird, die aus Whartons mesenchymalen Jelly-Stammzellen (WJ-MSCs) isoliert wurden. Exosomen, die den Charakterisierungsprozess bestanden hatten, wurden mit Dopamin inkubiert. Die Dopamin-beladenen Exosomen wurden am Ende der Inkubation neu charakterisiert. Dopamin-beladene Exosomen wurden in Wirkstofffreisetzungs- und Zytotoxizitätsassays untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass Dopamin erfolgreich in die Exosomen eingekapselt werden konnte und dass die Dopamin-beladenen Exosomen die Lebensfähigkeit der Fibroblasten nicht beeinflussten.

Introduction

Exosomen, bioaktive Vesikel mit signifikanten Merkmalen, haben eine Größe von 40 nm bis 200 nm. Exosomen entstehen aus der Zellmembran und entstehen durch die Freisetzung der Endosomen¹. Diese Strukturen dienen als Zell-zu-Zell-Kommunikatoren und interagieren mit benachbarten Zellen, um den Transfer aktiver Moleküle zu erleichtern. Exosomen können aus vielen verschiedenen Quellen isoliert werden. Dazu gehören Körperflüssigkeiten wie Plasma, Urin, Liquor, Speichel sowie Zelllinien, die unter In-vitro-Bedingungen kultiviert werden. Exosomen spielen dank der enthaltenen Biomakromoleküle wie Lipide, Proteine und Nukleinsäuren eine wichtige Rolle bei der Beseitigung von Nervenschäden². Gliazellen, die Stützzellen des Nervensystems³, übertragen Proteine und Mikro-RNAs über Exosomen⁴ auf die Axone von Neuronen.

Lipide, die die Myelinscheide bilden, die ein charakteristisches Merkmal der Nervenleitung sind, werden ebenfalls über Exosomen ^4,5 von Oligodendrozyten freigesetzt. Exosomen sind auch an Prozessen wie synaptischer Plastizität, neuronaler Stressantwort, Zell-Zell-Kommunikation und Neurogenese im Gehirn beteiligt ^6,7. Die Tatsache, dass Exosomen Nanodimensionen besitzen, ermöglicht es ihnen, die BHS zu passieren. Es besteht ein spezieller Übergangsweg von der interstitiellen Flüssigkeit zum Liquor cerebrospinalis nach Durchdringung dieser Membran⁸. Dank ihrer Oberflächeneigenschaften können Exosomen als Wirkstoffverabreichungssystem effizient mit Zielzellen interagieren und die beladenen Medikamente aktiv abgeben.

Aufgrund der Expression verschiedener adhäsiver Proteine (Tetraspanine und Integrine) auf der Oberfläche von Exosomen können diese extrazellulären Vesikel leicht mit Wirtszellmembranen interagieren und fusionieren⁹. Es wird angenommen, dass Exosomen aufgrund ihrer Fähigkeit, die BHS zu durchdringen, und ihrer Oberflächeneigenschaften als Arzneimittelverabreichungssystem verwendet werden können, insbesondere bei der Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Aus mesenchymalen Stammzellen (MSC) gewonnene Exosomen haben im Vergleich zu allogenen Zelltherapien ein geringeres Risiko für eine Immunabstoßung und können in dieser Hinsicht ein wichtiger Bestandteil zellfreier Behandlungsanwendungen sein¹⁰.

Dopamin ist ein Molekül, dessen Mangel im Gehirn das charakteristische Merkmal der Parkinson-Krankheit (PD) ist und sich von Tag zu Tag verschlimmert^11,12,13. Es ist bekannt, dass Parkinson mit einer Degeneration von dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra des Mesencephalons und einem Verlust von Motoneuronenfunktionen verbunden ist^14,15. Das Absterben von dopaminergen Neuronen verhindert die Versorgung des Gehirnstriatums mit dem Neurotransmitter Dopamin. Dies wiederum führt zur Entstehung von Parkinson-spezifischen Symptomen¹⁶. Diese Symptome der Parkinson-Krankheit sind Bradykinesie, posturale Instabilität, Rigidität und insbesondere Ruhetremor^12,13. Obwohl Parkinson erstmals vor mehr als zwei Jahrhunderten beschrieben wurde, sind Studien zum Verständnis der Pathologie und Ätiologie der Krankheit noch im Gange, und es wird derzeit akzeptiert, dass Parkinson eine komplexe systemische Erkrankung ist¹⁷. Es wird prognostiziert, dass ein Dopaminmangel auftritt, und klinische Parkinson-Symptome werden beobachtet, wenn mehr als 80 % der Neuronen degenerieren¹⁸. Bei der Behandlung der Krankheit wird eine unvollständige Dopamin-Supplementierung bevorzugt, um motorische Symptome zu reduzieren. In-vivo-Studien haben gezeigt, dass die direkte Infusion von Dopamin in das Gehirn die Symptome bei Tieren signifikant reduziert¹⁹. Dopaminvorstufen wie L-DOPA (L-3,4-Dihydroxyphenylalanin) und Dopaminrezeptor-Medikamente werden in der Klinik eingesetzt, da die direkte Infusion von Dopamin in das Gehirn beim Menschen nicht möglich ist und Dopamin, das in das System gelangt, die BHS²⁰ nicht überwinden kann. Diese Art von Medikamenten verliert mit der Zeit ihre Wirksamkeit. Es gibt jedoch immer noch keinen kurativen Behandlungsansatz für Parkinson. Daher besteht ein großer Bedarf, neue therapeutische Strategien und Behandlungsmodalitäten zu entwickeln, um die Pathophysiologie der Krankheit aufzudecken und die Auswirkungen von Parkinson auf die Patienten zu reduzieren.

Exosomen-basierte Studien haben in jüngster Zeit Aufmerksamkeit erregt, weil sie Informationen sowohl über Therapieansätze als auch über Pathologien von Erkrankungen des Nervensystems sammeln. Es wurde gezeigt^, dass MSC-abgeleitete Exosomen Entzündungen bei Nervenschäden reduzieren und zur neuronalen Regeneration beitragen^21,22,23. Darüber hinaus wurde berichtet, dass MSC-abgeleitete Exosomensekretome die Apoptose reduzieren, indem sie neurotrophe und neuroprotektive Wirkungen zeigen, insbesondere auf dopaminerge Neuronen^24,25. Die Forschung an Plattformen, in denen Exosomen als therapeutische Drug-Delivery-Systeme eingesetzt werden, hat sich in den letzten Jahren intensiv beschleunigt. In zahlreichen Studien wurde beobachtet, dass relevante Medikamente leicht in Exosomen eingekapselt und sicher in Zielzellen, Gewebe und Organe eingebracht werden können^26,27. Verschiedene Methoden wie Inkubation, Gefrier-/Auftauzyklen, Beschallung und Extrusion könnten für die Wirkstoffbeladung in Exosomen verwendet werden²⁸.

Die Koinkubation mit Exosomen oder Exosomen-ähnlichen Vesikeln ermöglicht es, lipophile kleine Moleküle passiv in diese Verabreichungssysteme einzukapseln^28,29,30. Insbesondere wurden verschiedene Moleküle wie Curcumin 31, Katalase 30, Doxorubicin³² und Paclitaxel³³ effektiv in Exosomen geladen. Es wurde beobachtet, dass Katalase-haltige Exosomen, die eine antioxidative Aktivität haben, sich effizient in den Neuronen und Mikrogliazellen im Gehirn ansammelten und starke neuroprotektive Aktivitäten zeigten³⁰. In derselben Studie wurde festgestellt, dass Saponin, das dem Komplex zugesetzt wird, um die Beladungseffizienz zu erhöhen, den Prozentsatz der Wirkstoffbeladung während der Inkubation erhöht^30,34. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um die Standards für die Beladung von Exosomen mit Medikamenten festzulegen.

Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung eines Nanocarrier-Systems durch Einkapselung von Dopamin in Exosomen, die aus WJ-MSCs isoliert wurden. Alle Schritte, einschließlich der Kultivierung von WJ-MSCs, der Isolierung und Charakterisierung von Exosomen, der Wirkstoffbeladungsexperimente, der Charakterisierung von Dopamin-beladenen Exosomen mit verschiedenen Techniken und der In-vitro-Zytotoxizitätsanalyse werden ausführlich erläutert.

Protocol

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden. 1. Kultivierung und Kryokonservierung von mesenchymalen Wharton-Jelly-Stammzellen Nehmen Sie die WJ-MSCs (von ATCC) aus dem Gefrierschrank bei -80 °C. Die Zellen werden in einen Kolben mit DMEM-F12-Medium gesät, der mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) angereichert ist. Sie werden bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 %…

Representative Results

Isolierung und Charakterisierung von ExosomenWharton-Jelly-Stammzellen werden kultiviert und 48 Stunden lang in einem serumfreien Medium inkubiert, wenn die Kultur eine ausreichende Dichte erreicht hat. Nach Beendigung der Inkubation wird der Überstand bei -20 °C gelagert. Die gesammelten Überstände werden mit PBS verdünnt und einer Ultrazentrifugation unterzogen (Abbildung 1). Die erhaltene Lösung wird durch NTA- und DLS-Analysen analysiert. Die Exosomen werden s…

Discussion

Exosomen sind kleine Membranvesikel mit Abmessungen von 40-200 nm, die von den meisten Zelltypen, z.B.^{MSCs 1}, sezerniert werden. Exosomen sind in der Lage, die Kommunikation zwischen Zellen zu ermöglichen, und können auf unterschiedliche Weise in Zellen eindringen, z. B. durch Endozytose, Phagozytose, Mikropinozytose, lipidvermittelte Internalisierung und Fusion^33,44. Im Vergleich zu anderen Nanocarrier-Systemen verleihen die Lipide und …

Materials

0.22 µm membrane filter	Aisimo		Used for the sterilization process
0.45 µm syringe filter	Aisimo		Used for the sterilization process
15 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
50 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
96 well plates (Falcon, TPP microplates)	Merck Millipore		Used in cell culture step
Acetonitrile	Sigma	271004-1L	Used for HPLC analysis
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process
Cell Culture Cabin	Hera Safe KS		Used for the cell culture process
Centrifugal	Hitachi	CF16RN	Used in the exosome isolation step
CO2 incubator with Safe Cell UV	Panasonic		Used for the cell culture process
Dopamine hydrochloride H8502-10G	Sigma	H8502-10G	Used in exosome dopamine loading
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Used as cell culture medium
Fetal Bovine Serum-FBS	Capricorn	FBS-16A	It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	To store cells and the resulting exosomes
Fridge	Panasonic	MPR-215-PE	Used to store cell culture and other materials
High performance liquid chromatography-HPLC	Agilent Technologies		The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.
Microscope- Primovert	Zeiss		Used to observe cells in cell culture.
MTT Assay	Biomatik		Used to measure cell viability
NanoSight NS300	Malvern panalytical	Malvern panalytical	Used for exosome characterization
Optima XPN-100 Ultracentrifuge	Beckman Coulter		Used in the exosome isolation step
PBS tablet	Biomatik	43602	In the preparation of the PBS solution
Penicilin/Streptomycin Solution	Capricorn	PB-S	It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Pipette Aid	Isolab
Precision balance-Kern	Kern-ABJ220-4NM		Used in the preparation of solutions
Q500 Sonicator	Qsonica, LLC		Used to digest exosomes in HPLC analysis
Saponin	Sigma	47036-50G-F	It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.
Spectrostar-Nano-Spectrophotometry	BMG LABTECH		Used for MTT and drug release analyzes
SPSS 22			statistical package program
Vorteks-FinePCR	FinePCR-FineVortex		Used to mix solutions homogeneously
Water Bath 37 °C-Senova	Senova		Used in cell culture step
Wharton’s jelly mesenchymal stem cells	ATCC
ZetaSizer	Malvern Nano ZS	Malvern Nano ZS	Used for exosome characterization