גיבוש ואפיון מערכת נשאי דופמין מבוססת אקסוזום

Summary

כאן, שאפנו להשיג ניסוח על ידי העמסת דופמין של האקסוזומים המבודדים של תאי גזע מתאי גזע מזנכימליים ג’לי של וורטון. בידוד ואפיון אקסוזום, העמסת תרופות לתוך האקסוזומים המתקבלים, והפעילות ציטוטוקסית של הפורמולציה המפותחת מתוארים בפרוטוקול זה.

Abstract

אקסוזומים בגודל של 40 עד 200 ננומטר מהווים את תת-הקבוצה הקטנה ביותר של שלפוחיות חוץ-תאיות. שלפוחיות ביו-אקטיביות אלה המופרשות על ידי תאים ממלאות תפקיד פעיל במטען ובתקשורת בין-תאיים. אקסוזומים נמצאים בעיקר בנוזלי גוף כגון פלזמה, נוזל מוחי שדרתי, שתן, רוק, מי שפיר, קולוסטרום, חלב אם, נוזל מפרקים, זרע וחומצה פלאורלית. בהתחשב בגודל של אקסוזומים, הוא חשב כי הם עשויים לשחק תפקיד חשוב במחלות מערכת העצבים המרכזית כי הם יכולים לעבור דרך מחסום הדם-מוח (BBB). לפיכך, מחקר זה נועד לפתח מערכת ננו-נשאית מבוססת אקסוזום על ידי עטיפת דופמין לתוך אקסוזומים שבודדו מתאי גזע מזנכימליים ג’לי של וורטון (WJ-MSCs). אקסוזומים שעברו את תהליך האפיון הודגרו עם דופמין. האקסוזומים טעוני הדופמין אופיינו מחדש בסוף הדגירה. אקסוזומים עמוסי דופמין נחקרו במבחני שחרור תרופות וציטוטוקסיות. התוצאות הראו כי ניתן לעטוף בהצלחה דופמין בתוך האקסוזומים וכי האקסוזומים העמוסים בדופמין לא השפיעו על יכולת הקיום של פיברובלסטים.

Introduction

אקסוזומים, בועיות ביו-אקטיביות בעלות תכונות משמעותיות, נעים בין 40 ננומטר ל-200 ננומטר. אקסוזומים מקורם בקרום התא והם נוצרים בגלל שחרור האנדוזומים¹. מבנים אלה משמשים כמתקשרים בין תאים ומתקשרים עם תאים שכנים כדי להקל על העברת מולקולות פעילות. אקסוזומים יכולים להיות מבודדים ממקורות רבים ושונים. אלה כוללים נוזלי גוף כגון פלזמה, שתן, נוזל מוחי שדרתי, רוק, כמו גם קווי תאים בתרבית בתנאי מבחנה . לאקסוזומים יש תפקיד חשוב בסילוק נזק עצבי, הודות לביו-מקרומולקולות שהם מכילים, כגון שומנים, חלבונים וחומצות גרעין². גליה, שהם התאים התומכים של מערכת העצבים³, מעבירים חלבונים ומיקרו-רנ”א לאקסונים של נוירונים באמצעות אקסוזומים⁴.

שומנים המרכיבים את מעטפת המיאלין, שהם תכונה אופיינית בהולכה עצבית, משתחררים גם מאוליגודנדרוציטים באמצעות אקסוזומים ^4,5. אקסוזומים מעורבים גם בתהליכים כגון פלסטיות סינפטית, תגובת לחץ עצבי, תקשורת תא-תא ויצירת תאי עצב במוח ^6,7. העובדה שלאקסוזומים יש ננו-ממד מאפשרת להם לעבור דרך ה-BBB. יש מסלול מעבר מיוחד מהנוזל הבין-תאי לנוזל השדרה לאחר חדירה לקרום זה⁸. הודות לתכונות פני השטח שלהם, אקסוזומים יכולים לתקשר ביעילות עם תאי המטרה כמערכת אספקת תרופות ולהעביר באופן פעיל את התרופות הטעונות.

בשל הביטוי של חלבוני דבק שונים (טטרספנינים ואינטגרינים) על פני השטח של אקסוזומים, שלפוחיות חוץ-תאיות אלה יכולות בקלות לתקשר ולהתמזג עם קרום התא המארח⁹. הוא חשב כי אקסוזומים יכולים לשמש כמערכת העברת תרופות, במיוחד בטיפול במחלות מערכת העצבים המרכזית בשל יכולתם לחדור BBB ואת תכונות פני השטח שלהם. אקסוזומים שמקורם בתאי גזע מזנכימליים (MSC) הם בעלי סיכון נמוך יותר לדחייה חיסונית בהשוואה לטיפולים תאיים אלוגניים, ומבחינה זו, הם יכולים להיות מרכיב חשוב ביישומי טיפול ללא תאים¹⁰.

דופמין הוא מולקולה שמחסור במוח הוא המאפיין האופייני של מחלת פרקינסון (PD), המחמיר מיום ליום^11,12,13. ידוע כי מחלת פרקינסון קשורה לניוון של נוירונים דופמינרגיים בחומר השחור של המזנצפלון ולאובדן תפקודי נוירונים מוטוריים^14,15. המוות של נוירונים דופמינרגיים מונע את אספקת המוליך העצבי דופמין לסטריאטום המוח. זה, בתורו, מביא את הופעתם של סימפטומים ספציפיים PD¹⁶. תסמינים אלה של פרקינסון הם ברדיקינזיה, חוסר יציבות יציבה, נוקשות, ובמיוחד רעד במנוחה^12,13. למרות שמחלת פרקינסון תוארה לראשונה לפני יותר ממאתיים שנה, מחקרים להבנת הפתולוגיה והאטיולוגיה של המחלה עדיין נמשכים וכיום מקובל כי פרקינסון היא מחלה מערכתית מורכבת¹⁷. זה צפוי כי מחסור בדופמין מתרחש, ותסמינים קליניים PD נצפים כאשר יותר מ 80% של נוירונים מתנוונים¹⁸. בטיפול במחלה, תוספת דופמין חלקית עדיפה כדי להפחית את הסימפטומים המוטוריים. מחקרי In vivo הראו כי עירוי ישיר של דופמין למוח מפחית באופן משמעותי את הסימפטומים אצל בעלי חיים¹⁹. מבשרי דופמין כגון L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) ותרופות קולטן דופמין משמשים במרפאה מכיוון שעירוי ישיר של דופמין למוח אינו אפשרי בבני אדם ודופמין הנכנס למערכת אינו יכול לחצות את BBB²⁰. תרופות מסוג זה מאבדות את יעילותן עם הזמן. עם זאת, עדיין אין גישה טיפולית מרפאת לפרקינסון. לפיכך, יש צורך עצום לפתח אסטרטגיות טיפוליות ושיטות טיפול חדשות כדי לחשוף את הפתופיזיולוגיה של המחלה ולהפחית את ההשפעה של פרקינסון על החולים.

מחקרים מבוססי אקסוזום משכו לאחרונה תשומת לב לאיסוף מידע הן על גישות טיפוליות והן על פתולוגיות של מחלות מערכת העצבים. אקסוזומים שמקורם ב-MSC הוכחו כמפחיתים דלקת בנזק עצבי ותורמים להתחדשות עצבית^21,22,23. בנוסף, דווח כי הפרשות אקסוזום שמקורן ב- MSC מפחיתות אפופטוזיס על ידי הצגת השפעות נוירוטרופיות ונוירופרוטקטיביות, במיוחד על נוירונים דופמינרגיים^24,25. המחקר על פלטפורמות שבהן אקסוזומים משמשים כמערכות מתן תרופות טיפוליות הואץ באופן אינטנסיבי בשנים האחרונות. במחקרים רבים, נצפה כי תרופות רלוונטיות יכולות להיעטף בקלות לאקסוזומים ולהעביר בבטחה לתאי מטרה, רקמות ואיברים^26,27. שיטות שונות כגון דגירה, מחזורי הקפאה/הפשרה, סוניקציה ושחול יכולות לשמש להעמסת תרופות לתוך אקסוזומים²⁸.

דגירה עם אקסוזומים או שלפוחיות דמויות אקסוזום מאפשרת למולקולות קטנות ליפופיליות להיות עטופות באופן פסיבי במערכות העברה אלה^28,29,30. בפרט, מולקולות שונות כגון כורכומין 31, קטלאז 30, דוקסורוביצין³² ופקליטקסל³³ הועמסו ביעילות לתוך אקסוזומים. נצפה כי אקסוזומים המכילים קטלאז, בעלי פעילות נוגדת חמצון, צברו ביעילות בנוירונים ובתאי מיקרוגליאה במוח והפגינו פעילות נוירופרוטקטורית חזקה³⁰. באותו מחקר, סאפונין, שנוסף למתחם כדי להגביר את יעילות ההעמסה, נמצא כמגדיל את אחוז העמסת התרופה במהלך הדגירה^30,34. עם זאת, נדרשים מחקרים נוספים כדי לקבוע את הסטנדרטים להעמסת תרופות לתוך אקסוזומים.

מאמר זה מתאר את התפתחותה של מערכת ננו-נשאית על ידי אנקפסולציה של דופמין לתוך אקסוזומים שבודדו מ-WJ-MSCs. כל השלבים, כולל טיפוח WJ-MSCs, בידוד ואפיון אקסוזומים, ניסויי העמסת תרופות, אפיון אקסוזומים טעוני דופמין בטכניקות שונות, וניתוח ציטוטוקסיות חוץ גופית מוסברים בפירוט.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה. 1. טיפוח ושימור בהקפאה של תאי גזע מזנכימליים ג’לי של וורטון הוציאו את WJ-MSCs (מ-ATCC) מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C. זרעו את התאים לתוך בקבוק המכיל DMEM-F12 בינוני בתוספת 10% סרום בק…

Representative Results

בידוד ואפיון אקסוזוםתאי גזע של ג’לי וורטון מתורבתים ומודגרים בתווך ללא סרום במשך 48 שעות כאשר התרבית מגיעה לצפיפות מספקת. לאחר סיום הדגירה, supernatant מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס. הסופרנאטנטים שנאספו מדוללים באמצעות PBS ונתונים לאולטרה-צנטריפוגה (איור 1). הפתרון המתקבל מנ…

Discussion

אקסוזומים הם בועיות קרום קטנות עם ממדים של 40-200 ננומטר המופרשים על ידי רוב סוגי התאים, למשל, MSCs¹. אקסוזומים מסוגלים לאפשר תקשורת בין תאים, ויכולים להיכנס לתאים בדרכים שונות כגון אנדוציטוזה, פאגוציטוזה, מיקרופינוציטוזה, הפנמה בתיווך שומנים ואיחוי^33,44…

Materials

0.22 µm membrane filter	Aisimo		Used for the sterilization process
0.45 µm syringe filter	Aisimo		Used for the sterilization process
15 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
50 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
96 well plates (Falcon, TPP microplates)	Merck Millipore		Used in cell culture step
Acetonitrile	Sigma	271004-1L	Used for HPLC analysis
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process
Cell Culture Cabin	Hera Safe KS		Used for the cell culture process
Centrifugal	Hitachi	CF16RN	Used in the exosome isolation step
CO2 incubator with Safe Cell UV	Panasonic		Used for the cell culture process
Dopamine hydrochloride H8502-10G	Sigma	H8502-10G	Used in exosome dopamine loading
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Used as cell culture medium
Fetal Bovine Serum-FBS	Capricorn	FBS-16A	It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	To store cells and the resulting exosomes
Fridge	Panasonic	MPR-215-PE	Used to store cell culture and other materials
High performance liquid chromatography-HPLC	Agilent Technologies		The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.
Microscope- Primovert	Zeiss		Used to observe cells in cell culture.
MTT Assay	Biomatik		Used to measure cell viability
NanoSight NS300	Malvern panalytical	Malvern panalytical	Used for exosome characterization
Optima XPN-100 Ultracentrifuge	Beckman Coulter		Used in the exosome isolation step
PBS tablet	Biomatik	43602	In the preparation of the PBS solution
Penicilin/Streptomycin Solution	Capricorn	PB-S	It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Pipette Aid	Isolab
Precision balance-Kern	Kern-ABJ220-4NM		Used in the preparation of solutions
Q500 Sonicator	Qsonica, LLC		Used to digest exosomes in HPLC analysis
Saponin	Sigma	47036-50G-F	It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.
Spectrostar-Nano-Spectrophotometry	BMG LABTECH		Used for MTT and drug release analyzes
SPSS 22			statistical package program
Vorteks-FinePCR	FinePCR-FineVortex		Used to mix solutions homogeneously
Water Bath 37 °C-Senova	Senova		Used in cell culture step
Wharton’s jelly mesenchymal stem cells	ATCC
ZetaSizer	Malvern Nano ZS	Malvern Nano ZS	Used for exosome characterization