Formulación y caracterización de un sistema portador de dopamina basado en exosomas

Summary

En este trabajo, nuestro objetivo era obtener una formulación mediante la carga de dopamina de los exosomas aislados de células madre de las células madre mesenquimales de la gelatina de Wharton. En este protocolo se describen el aislamiento y la caracterización de los exosomas, la carga del fármaco en los exosomas resultantes y la actividad citotóxica de la formulación desarrollada.

Abstract

Los exosomas de entre 40 y 200 nm de tamaño constituyen el subgrupo más pequeño de vesículas extracelulares. Estas vesículas bioactivas secretadas por las células desempeñan un papel activo en la carga y la comunicación intercelular. Los exosomas se encuentran principalmente en fluidos corporales como el plasma, el líquido cefalorraquídeo, la orina, la saliva, el líquido amniótico, el calostro, la leche materna, el líquido articular, el semen y el ácido pleural. Teniendo en cuenta el tamaño de los exosomas, se cree que pueden desempeñar un papel importante en las enfermedades del sistema nervioso central porque pueden atravesar la barrera hematoencefálica (BHE). Por lo tanto, este estudio tenía como objetivo desarrollar un sistema de nanoportadores basado en exosomas encapsulando la dopamina en exosomas aislados de células madre mesenquimales de gelatina de Wharton (WJ-MSC). Los exosomas que pasaron el proceso de caracterización fueron incubados con dopamina. Los exosomas cargados de dopamina se recaracterizaron al final de la incubación. Los exosomas cargados de dopamina se investigaron en ensayos de liberación de fármacos y citotoxicidad. Los resultados mostraron que la dopamina podía encapsularse con éxito dentro de los exosomas y que los exosomas cargados de dopamina no afectaban a la viabilidad de los fibroblastos.

Introduction

Los exosomas, vesículas bioactivas con características significativas, varían en tamaño de 40 nm a 200 nm. Los exosomas se originan en la membrana celular y se forman debido a la liberación de los endosomas¹. Estas estructuras sirven como comunicadores de célula a célula e interactúan con las células vecinas para facilitar la transferencia de moléculas activas. Los exosomas se pueden aislar de muchas fuentes diferentes. Estos incluyen fluidos corporales como plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, así como líneas celulares cultivadas en condiciones in vitro . Los exosomas tienen un papel importante en la eliminación del daño nervioso, gracias a las biomacromoléculas que contienen, como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos². Los glías, que son las células de soporte del sistema nervioso³, transfieren proteínas y micro ARN a los axones de las neuronas a través de exosomas⁴.

Los lípidos que forman la vaina de mielina, que son un rasgo característico de la conducción nerviosa, también se liberan de los oligodendrocitos a través de los exosomas ^4,5. Los exosomas también están implicados en procesos como la plasticidad sináptica, la respuesta al estrés neuronal, la comunicación célula-célula y la neurogénesis en el cerebro ^6,7. El hecho de que los exosomas posean nanodimensiones les permite pasar a través de la barrera hematoencefálica. Existe una ruta especial de transición desde el líquido intersticial hasta el líquido cefalorraquídeo después de penetrar en esta membrana⁸. Gracias a sus propiedades superficiales, los exosomas pueden interactuar de manera eficiente con las células diana como un sistema de administración de fármacos y administrar activamente los fármacos cargados.

Debido a la expresión de diversas proteínas adhesivas (tetraspaninas e integrinas) en la superficie de los exosomas, estas vesículas extracelulares pueden interactuar y fusionarse fácilmente con las membranas de las células huésped⁹. Se cree que los exosomas pueden utilizarse como sistema de administración de fármacos, especialmente en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central debido a su capacidad para penetrar en la barrera hematoencefálica y sus propiedades superficiales. Los exosomas derivados de células madre mesenquimales (MSC) tienen un menor riesgo de rechazo inmunológico en comparación con las terapias celulares alogénicas y, en este sentido, pueden ser un componente importante de las aplicaciones de tratamiento libre de células¹⁰.

La dopamina es una molécula cuya deficiencia en el cerebro es el rasgo característico de la enfermedad de Parkinson (EP), empeorando día a día^11,12,13. Se sabe que la EP está asociada a la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra del mesencéfalo y a la pérdida de las funciones de las neuronas motoras^14,15. La muerte de las neuronas dopaminérgicas impide el suministro del neurotransmisor dopamina al cuerpo estriado cerebral. Esto, a su vez, da lugar a la aparición de síntomas específicos de la EP¹⁶. Estos síntomas de la EP son la bradicinesia, la inestabilidad postural, la rigidez y, especialmente, el temblor en reposo^12,13. A pesar de que la EP fue descrita por primera vez hace más de dos siglos, los estudios para comprender la patología y etiología de la enfermedad aún están en curso y actualmente se acepta que la EP es una enfermedad sistémica compleja¹⁷. Se predice que se produce una deficiencia de dopamina, y se observan síntomas clínicos de EP cuando más del 80% de las neuronas se degeneran¹⁸. En el tratamiento de la enfermedad, se prefiere la suplementación incompleta con dopamina para reducir los síntomas motores. Los estudios in vivo han demostrado que la infusión directa de dopamina en el cerebro reduce significativamente los síntomas en animales¹⁹. Los precursores de dopamina como la L-DOPA (L-3,4-dihidroxifenilalanina) y los fármacos receptores de dopamina se utilizan en la clínica porque la infusión directa de dopamina en el cerebro no es posible en los seres humanos y la dopamina que entra en el sistema no puede atravesar la barrera hematoencefálica²⁰. Este tipo de medicamentos pierden su eficacia con el tiempo. Sin embargo, todavía no existe un enfoque de tratamiento curativo para la EP, por lo que existe una gran necesidad de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas y modalidades de tratamiento para revelar la fisiopatología de la enfermedad y reducir el impacto de la EP en los pacientes.

Los estudios basados en exosomas han atraído recientemente la atención por recopilar información sobre enfoques terapéuticos y patologías de enfermedades del sistema nervioso. Se ha demostrado que los exosomas derivados de MSC reducen la inflamación en el daño nervioso y contribuyen a la regeneración neuronal^21,22,23. Además, se ha reportado que los secretomas de exosomas derivados de MSC reducen la apoptosis al mostrar efectos neurotróficos y neuroprotectores, especialmente en las neuronas dopaminérgicas^24,25. La investigación sobre plataformas en las que se utilizan exosomas como sistemas de administración de fármacos terapéuticos se ha acelerado intensamente en los últimos años. En numerosos estudios, se ha observado que los fármacos relevantes pueden encapsularse fácilmente en exosomas y administrarse de forma segura en células, tejidos y órganos diana^26,27. Podrían utilizarse diferentes métodos, como la incubación, los ciclos de congelación/descongelación, la sonicación y la extrusión, para la carga de fármacos en los exosomas²⁸.

La coincubación con exosomas o vesículas similares a exosomas permite encapsular pasivamente pequeñas moléculas lipofílicas en estos sistemas de administración^28,29,30. En particular, varias moléculas como la curcumina³¹, la catalasa 30, la doxorrubicina 32 y el paclitaxel³³ se cargaron eficazmente en los exosomas. Se ha observado que los exosomas que contienen catalasa, que tienen actividad antioxidante, se acumulan eficientemente en las neuronas y células microgliales del cerebro y exhiben fuertes actividades neuroprotectoras³⁰. En el mismo estudio, se encontró que la saponina, añadida al complejo para aumentar la eficiencia de carga, aumenta el porcentaje de carga del fármaco durante la incubación^30,34. Sin embargo, se necesitan más estudios para establecer los estándares para la carga de fármacos en los exosomas.

En este artículo se describe el desarrollo de un sistema de nanoportadores mediante la encapsulación de dopamina en exosomas que se aislaron de WJ-MSC. Se explican en detalle todos los pasos, incluido el cultivo de WJ-MSC, el aislamiento y la caracterización de exosomas, los experimentos de carga de fármacos, la caracterización de exosomas cargados de dopamina con diversas técnicas y el análisis de citotoxicidad in vitro .

Protocol

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales y equipos utilizados en este protocolo. 1. Cultivo y criopreservación de células madre mesenquimales de gelatina de Wharton Retire los WJ-MSC (del ATCC) del congelador a -80 °C. Siembre las células en un matraz que contenga medio DMEM-F12 suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS). Incubarlos a 37 °C en una incubadora que contenga 5% de CO<…

Representative Results

Aislamiento y caracterización de exosomasLas células madre gelatinosas de Wharton se cultivan e incuban en un medio sin suero durante 48 h cuando el cultivo alcanza una densidad suficiente. Una vez finalizada la incubación, el sobrenadante se almacena a -20 °C. Los sobrenadantes recolectados se diluyen con PBS y se someten a ultracentrifugación (Figura 1). La solución obtenida se analiza mediante análisis NTA y DLS. Los exosomas se esterilizan pasando a través d…

Discussion

Los exosomas son pequeñas vesículas de membrana con dimensiones de 40-200 nm secretadas por la mayoría de los tipos de células, por ejemplo, las MSC¹. Capaces de permitir la comunicación entre células, los exosomas pueden entrar en las células de diferentes maneras, como endocitosis, fagocitosis, micropinocitosis, internalización mediada por lípidos y fusión^33,44. En comparación con otros sistemas de nanotransportadores, los lí…

Materials

0.22 µm membrane filter	Aisimo		Used for the sterilization process
0.45 µm syringe filter	Aisimo		Used for the sterilization process
15 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
50 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
96 well plates (Falcon, TPP microplates)	Merck Millipore		Used in cell culture step
Acetonitrile	Sigma	271004-1L	Used for HPLC analysis
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process
Cell Culture Cabin	Hera Safe KS		Used for the cell culture process
Centrifugal	Hitachi	CF16RN	Used in the exosome isolation step
CO2 incubator with Safe Cell UV	Panasonic		Used for the cell culture process
Dopamine hydrochloride H8502-10G	Sigma	H8502-10G	Used in exosome dopamine loading
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Used as cell culture medium
Fetal Bovine Serum-FBS	Capricorn	FBS-16A	It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	To store cells and the resulting exosomes
Fridge	Panasonic	MPR-215-PE	Used to store cell culture and other materials
High performance liquid chromatography-HPLC	Agilent Technologies		The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.
Microscope- Primovert	Zeiss		Used to observe cells in cell culture.
MTT Assay	Biomatik		Used to measure cell viability
NanoSight NS300	Malvern panalytical	Malvern panalytical	Used for exosome characterization
Optima XPN-100 Ultracentrifuge	Beckman Coulter		Used in the exosome isolation step
PBS tablet	Biomatik	43602	In the preparation of the PBS solution
Penicilin/Streptomycin Solution	Capricorn	PB-S	It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Pipette Aid	Isolab
Precision balance-Kern	Kern-ABJ220-4NM		Used in the preparation of solutions
Q500 Sonicator	Qsonica, LLC		Used to digest exosomes in HPLC analysis
Saponin	Sigma	47036-50G-F	It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.
Spectrostar-Nano-Spectrophotometry	BMG LABTECH		Used for MTT and drug release analyzes
SPSS 22			statistical package program
Vorteks-FinePCR	FinePCR-FineVortex		Used to mix solutions homogeneously
Water Bath 37 °C-Senova	Senova		Used in cell culture step
Wharton’s jelly mesenchymal stem cells	ATCC
ZetaSizer	Malvern Nano ZS	Malvern Nano ZS	Used for exosome characterization