Формулировка и характеристика экзосомно-носительской системы дофамина

Summary

В данной работе мы стремились получить рецептуру путем дофаминовой загрузки изолированных экзосом стволовых клеток из желейных мезенхимальных стволовых клеток Уортона. Выделение и характеристика экзосом, загрузка препарата в полученные экзосомы и цитотоксическая активность разработанной лекарственной формы описаны в данном протоколе.

Abstract

Экзосомы размером от 40 до 200 нм составляют наименьшую подгруппу внеклеточных везикул. Эти биологически активные везикулы, секретируемые клетками, играют активную роль в межклеточном грузе и коммуникации. Экзосомы в основном содержатся в жидкостях организма, таких как плазма, спинномозговая жидкость, моча, слюна, околоплодные воды, молозиво, грудное молоко, суставная жидкость, сперма и плевральная кислота. Учитывая размер экзосом, считается, что они могут играть важную роль в заболеваниях центральной нервной системы, поскольку они могут проходить через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Таким образом, это исследование было направлено на разработку системы наноносителей на основе экзосом путем инкапсуляции дофамина в экзосомы, выделенные из желейных мезенхимальных стволовых клеток Уортона (WJ-MSCs). Экзосомы, прошедшие процесс характеризации, инкубировали с дофамином. Экзосомы, нагруженные дофамином, были повторно охарактеризованы в конце инкубации. Экзосомы, нагруженные дофамином, были исследованы в анализах на высвобождение лекарств и цитотоксичность. Результаты показали, что дофамин может быть успешно инкапсулирован в экзосомах, и что экзосомы, загруженные дофамином, не влияют на жизнеспособность фибробластов.

Introduction

Экзосомы, биологически активные везикулы со значительными особенностями, имеют размер от 40 нм до 200 нм. Экзосомы происходят из клеточной мембраны и образуются в результате высвобождения эндосом¹. Эти структуры служат межклеточными коммуникаторами и взаимодействуют с соседними клетками, облегчая передачу активных молекул. Экзосомы могут быть выделены из множества различных источников. К ним относятся биологические жидкости, такие как плазма, моча, спинномозговая жидкость, слюна, а также клеточные линии, культивируемые в условиях in vitro . Экзосомы играют важную роль в устранении повреждений нервов благодаря содержащимся в них биомакромолекулам, таким как липиды, белки и нуклеиновые^{кислоты.} Глии, которые являются опорными клетками нервной системы³, переносят белки и микроРНК к аксонам нейронов через экзосомы⁴.

Липиды, образующие миелиновую оболочку, которые являются характерной особенностью нервной проводимости, также высвобождаются из олигодендроцитов через экзосомы ^4,5. Экзосомы также участвуют в таких процессах, как синаптическая пластичность, реакция нейронов на стресс, межклеточная коммуникация и нейрогенез в мозге ^6,7. Тот факт, что экзосомы обладают наноразмерностью, позволяет им проходить через ГЭБ. Существует специальный путь перехода от интерстициальной жидкости к спинномозговой жидкости после проникновения через эту мембрану⁸. Благодаря своим поверхностным свойствам экзосомы могут эффективно взаимодействовать с клетками-мишенями в качестве системы доставки лекарств и активно доставлять загруженные лекарства.

Благодаря экспрессии различных адгезивных белков (тетраспанинов и интегринов) на поверхности экзосом эти внеклеточные везикулы могут легко взаимодействовать и сливаться с клеточными мембранами^{хозяина 9}. Считается, что экзосомы могут быть использованы в качестве системы доставки лекарств, особенно при лечении заболеваний центральной нервной системы из-за их способности проникать в ГЭБ и их поверхностных свойств. Экзосомы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток (МСК), имеют более низкий риск иммунного отторжения по сравнению с аллогенной клеточной терапией, и в этом отношении они могут быть важным компонентом применения бесклеточного лечения¹⁰.

Дофамин – это молекула, дефицит которой в головном мозге является характерным признаком болезни Паркинсона (БП), ухудшающейся день ото дня^11,12,13. Известно, что болезнь Паркинсона ассоциирована с дегенерацией дофаминергических нейронов в черной субстанции мезэнфералона и потерей функций двигательных нейронов^14,15. Гибель дофаминергических нейронов препятствует поступлению нейромедиатора дофамина в полосатое тело головного мозга. Это, в свою очередь, приводит к возникновению симптомов, специфичных для БП¹⁶. Такими симптомами БП являются брадикинезия, постуральная нестабильность, ригидность и особенно тремор в покое^12,13. Несмотря на то, что болезнь Паркинсона была впервые описана более двух столетий назад, исследования, направленные на понимание патологии и этиологии заболевания, все еще продолжаются, и в настоящее время признано, что болезнь Паркинсона является сложным системным^{заболеванием}. Прогнозируется, что дефицит дофамина возникает, а клинические симптомы болезни Паркинсона наблюдаются при дегенерации более 80% нейронов¹⁸. При лечении заболевания предпочтение отдается неполному приему дофамина для уменьшения двигательных симптомов. Исследования in vivo показали, что прямая инфузия дофамина в мозг значительно уменьшает симптомы^{у животных.} Предшественники дофамина, такие как L-ДОФА (L-3,4-дигидроксифенилаланин) и препараты дофаминовых рецепторов, используются в клинике, потому что прямая инфузия дофамина в мозг у человека невозможна, и дофамин, попадая в систему, не может пересечь^ГЭБ-20. Эти виды препаратов со временем теряют свою эффективность. Тем не менее, до сих пор не существует подхода к лечению болезни Паркинсона. Следовательно, существует огромная необходимость в разработке новых терапевтических стратегий и методов лечения для выявления патофизиологии заболевания и снижения влияния БП на пациентов.

Исследования на основе экзосом в последнее время привлекли внимание в связи со сбором информации как о терапевтических подходах, так и о патологиях заболеваний нервной системы. Было показано, что экзосомы, полученные из МСК, уменьшают воспаление при повреждении нервов и способствуют регенерации нейронов^21,22,23. Кроме того, сообщалось, что секретомы экзосом, полученные из МСК, снижают апоптоз, проявляя нейротрофические и нейропротекторные эффекты, особенно на дофаминергических нейронах^24,25. Исследования платформ, в которых экзосомы используются в качестве терапевтических систем доставки лекарств, интенсивно ускорились в последние годы. В многочисленных исследованиях было замечено, что соответствующие лекарственные препараты могут быть легко инкапсулированы в экзосомы и безопасно доставлены в клетки, ткани и органы-мишени^26,27. Различные методы, такие как инкубация, циклы замораживания/оттаивания, ультразвуковая обработка и экструзия, могут быть использованы для загрузки лекарств в экзосомы²⁸.

Коинкубация с экзосомами или экзосомоподобными везикулами позволяет пассивно инкапсулировать липофильные малые молекулы в эти системы доставки^28,29,30. В частности, различные молекулы, такие как куркумин³¹, каталаза³⁰, доксорубицин 32 и паклитаксел³³, были эффективно загружены в экзосомы. Было замечено, что каталазосодержащие экзосомы, обладающие антиоксидантной активностью, эффективно накапливаются в нейронах и клетках микроглии головного мозга и проявляют сильную нейропротекторную активность³⁰. В этом же исследовании было обнаружено, что сапонин, добавленный в комплекс для повышения эффективности загрузки, увеличивает процент загрузки препарата во время инкубации^30,34. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить стандарты загрузки лекарств в экзосомы.

В данной работе описывается разработка системы наноносителей путем инкапсуляции дофамина в экзосомы, которые были выделены из WJ-MSCs. Подробно объясняются все этапы, включая культивирование WJ-МСК, выделение и характеристику экзосом, эксперименты по загрузке лекарственными препаратами, характеристику экзосом, нагруженных дофамином, с помощью различных методов и анализ цитотоксичности in vitro .

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам и оборудованию, используемым в этом протоколе. 1. Культивирование и криоконсервация желейных мезенхимальных стволовых клеток Уортона Извлеките…

Representative Results

Выделение и характеристика экзосомСтволовые клетки Уортонского желе культивируют и инкубируют в безсывороточной среде в течение 48 ч, когда культура достигает достаточной плотности. После окончания инкубации надосадочную жидкость хранят при температуре -20 °С. Собранные н?…

Discussion

Экзосомы представляют собой небольшие мембранные везикулы размером 40-200 нм, секретируемые большинством типов клеток, например, МСК¹. Способные обеспечивать коммуникацию между клетками, экзосомы могут проникать в клетки различными путями, такими как эндоцитоз, фагоцитоз, м…

Materials

0.22 µm membrane filter	Aisimo		Used for the sterilization process
0.45 µm syringe filter	Aisimo		Used for the sterilization process
15 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
50 mL Falcon tube	Nest		Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks	Nest		Used in cell culture step
96 well plates (Falcon, TPP microplates)	Merck Millipore		Used in cell culture step
Acetonitrile	Sigma	271004-1L	Used for HPLC analysis
Autoclave	NUVE-OT 90L		Used for the sterilization process
Cell Culture Cabin	Hera Safe KS		Used for the cell culture process
Centrifugal	Hitachi	CF16RN	Used in the exosome isolation step
CO2 incubator with Safe Cell UV	Panasonic		Used for the cell culture process
Dopamine hydrochloride H8502-10G	Sigma	H8502-10G	Used in exosome dopamine loading
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12	Sigma	RNBJ7249	Used as cell culture medium
Fetal Bovine Serum-FBS	Capricorn	FBS-16A	It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80 °C	Panasonic	MDF-U5386S-PE	To store cells and the resulting exosomes
Fridge	Panasonic	MPR-215-PE	Used to store cell culture and other materials
High performance liquid chromatography-HPLC	Agilent Technologies		The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.
Microscope- Primovert	Zeiss		Used to observe cells in cell culture.
MTT Assay	Biomatik		Used to measure cell viability
NanoSight NS300	Malvern panalytical	Malvern panalytical	Used for exosome characterization
Optima XPN-100 Ultracentrifuge	Beckman Coulter		Used in the exosome isolation step
PBS tablet	Biomatik	43602	In the preparation of the PBS solution
Penicilin/Streptomycin Solution	Capricorn	PB-S	It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Pipette Aid	Isolab
Precision balance-Kern	Kern-ABJ220-4NM		Used in the preparation of solutions
Q500 Sonicator	Qsonica, LLC		Used to digest exosomes in HPLC analysis
Saponin	Sigma	47036-50G-F	It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.
Spectrostar-Nano-Spectrophotometry	BMG LABTECH		Used for MTT and drug release analyzes
SPSS 22			statistical package program
Vorteks-FinePCR	FinePCR-FineVortex		Used to mix solutions homogeneously
Water Bath 37 °C-Senova	Senova		Used in cell culture step
Wharton’s jelly mesenchymal stem cells	ATCC
ZetaSizer	Malvern Nano ZS	Malvern Nano ZS	Used for exosome characterization