В данной работе мы стремились получить рецептуру путем дофаминовой загрузки изолированных экзосом стволовых клеток из желейных мезенхимальных стволовых клеток Уортона. Выделение и характеристика экзосом, загрузка препарата в полученные экзосомы и цитотоксическая активность разработанной лекарственной формы описаны в данном протоколе.
Экзосомы размером от 40 до 200 нм составляют наименьшую подгруппу внеклеточных везикул. Эти биологически активные везикулы, секретируемые клетками, играют активную роль в межклеточном грузе и коммуникации. Экзосомы в основном содержатся в жидкостях организма, таких как плазма, спинномозговая жидкость, моча, слюна, околоплодные воды, молозиво, грудное молоко, суставная жидкость, сперма и плевральная кислота. Учитывая размер экзосом, считается, что они могут играть важную роль в заболеваниях центральной нервной системы, поскольку они могут проходить через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Таким образом, это исследование было направлено на разработку системы наноносителей на основе экзосом путем инкапсуляции дофамина в экзосомы, выделенные из желейных мезенхимальных стволовых клеток Уортона (WJ-MSCs). Экзосомы, прошедшие процесс характеризации, инкубировали с дофамином. Экзосомы, нагруженные дофамином, были повторно охарактеризованы в конце инкубации. Экзосомы, нагруженные дофамином, были исследованы в анализах на высвобождение лекарств и цитотоксичность. Результаты показали, что дофамин может быть успешно инкапсулирован в экзосомах, и что экзосомы, загруженные дофамином, не влияют на жизнеспособность фибробластов.
Экзосомы, биологически активные везикулы со значительными особенностями, имеют размер от 40 нм до 200 нм. Экзосомы происходят из клеточной мембраны и образуются в результате высвобождения эндосом1. Эти структуры служат межклеточными коммуникаторами и взаимодействуют с соседними клетками, облегчая передачу активных молекул. Экзосомы могут быть выделены из множества различных источников. К ним относятся биологические жидкости, такие как плазма, моча, спинномозговая жидкость, слюна, а также клеточные линии, культивируемые в условиях in vitro . Экзосомы играют важную роль в устранении повреждений нервов благодаря содержащимся в них биомакромолекулам, таким как липиды, белки и нуклеиновыекислоты. Глии, которые являются опорными клетками нервной системы3, переносят белки и микроРНК к аксонам нейронов через экзосомы4.
Липиды, образующие миелиновую оболочку, которые являются характерной особенностью нервной проводимости, также высвобождаются из олигодендроцитов через экзосомы 4,5. Экзосомы также участвуют в таких процессах, как синаптическая пластичность, реакция нейронов на стресс, межклеточная коммуникация и нейрогенез в мозге 6,7. Тот факт, что экзосомы обладают наноразмерностью, позволяет им проходить через ГЭБ. Существует специальный путь перехода от интерстициальной жидкости к спинномозговой жидкости после проникновения через эту мембрану8. Благодаря своим поверхностным свойствам экзосомы могут эффективно взаимодействовать с клетками-мишенями в качестве системы доставки лекарств и активно доставлять загруженные лекарства.
Благодаря экспрессии различных адгезивных белков (тетраспанинов и интегринов) на поверхности экзосом эти внеклеточные везикулы могут легко взаимодействовать и сливаться с клеточными мембранамихозяина 9. Считается, что экзосомы могут быть использованы в качестве системы доставки лекарств, особенно при лечении заболеваний центральной нервной системы из-за их способности проникать в ГЭБ и их поверхностных свойств. Экзосомы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток (МСК), имеют более низкий риск иммунного отторжения по сравнению с аллогенной клеточной терапией, и в этом отношении они могут быть важным компонентом применения бесклеточного лечения10.
Дофамин – это молекула, дефицит которой в головном мозге является характерным признаком болезни Паркинсона (БП), ухудшающейся день ото дня11,12,13. Известно, что болезнь Паркинсона ассоциирована с дегенерацией дофаминергических нейронов в черной субстанции мезэнфералона и потерей функций двигательных нейронов14,15. Гибель дофаминергических нейронов препятствует поступлению нейромедиатора дофамина в полосатое тело головного мозга. Это, в свою очередь, приводит к возникновению симптомов, специфичных для БП16. Такими симптомами БП являются брадикинезия, постуральная нестабильность, ригидность и особенно тремор в покое12,13. Несмотря на то, что болезнь Паркинсона была впервые описана более двух столетий назад, исследования, направленные на понимание патологии и этиологии заболевания, все еще продолжаются, и в настоящее время признано, что болезнь Паркинсона является сложным системнымзаболеванием. Прогнозируется, что дефицит дофамина возникает, а клинические симптомы болезни Паркинсона наблюдаются при дегенерации более 80% нейронов18. При лечении заболевания предпочтение отдается неполному приему дофамина для уменьшения двигательных симптомов. Исследования in vivo показали, что прямая инфузия дофамина в мозг значительно уменьшает симптомыу животных. Предшественники дофамина, такие как L-ДОФА (L-3,4-дигидроксифенилаланин) и препараты дофаминовых рецепторов, используются в клинике, потому что прямая инфузия дофамина в мозг у человека невозможна, и дофамин, попадая в систему, не может пересечьГЭБ-20. Эти виды препаратов со временем теряют свою эффективность. Тем не менее, до сих пор не существует подхода к лечению болезни Паркинсона. Следовательно, существует огромная необходимость в разработке новых терапевтических стратегий и методов лечения для выявления патофизиологии заболевания и снижения влияния БП на пациентов.
Исследования на основе экзосом в последнее время привлекли внимание в связи со сбором информации как о терапевтических подходах, так и о патологиях заболеваний нервной системы. Было показано, что экзосомы, полученные из МСК, уменьшают воспаление при повреждении нервов и способствуют регенерации нейронов21,22,23. Кроме того, сообщалось, что секретомы экзосом, полученные из МСК, снижают апоптоз, проявляя нейротрофические и нейропротекторные эффекты, особенно на дофаминергических нейронах24,25. Исследования платформ, в которых экзосомы используются в качестве терапевтических систем доставки лекарств, интенсивно ускорились в последние годы. В многочисленных исследованиях было замечено, что соответствующие лекарственные препараты могут быть легко инкапсулированы в экзосомы и безопасно доставлены в клетки, ткани и органы-мишени26,27. Различные методы, такие как инкубация, циклы замораживания/оттаивания, ультразвуковая обработка и экструзия, могут быть использованы для загрузки лекарств в экзосомы28.
Коинкубация с экзосомами или экзосомоподобными везикулами позволяет пассивно инкапсулировать липофильные малые молекулы в эти системы доставки28,29,30. В частности, различные молекулы, такие как куркумин31, каталаза30, доксорубицин 32 и паклитаксел33, были эффективно загружены в экзосомы. Было замечено, что каталазосодержащие экзосомы, обладающие антиоксидантной активностью, эффективно накапливаются в нейронах и клетках микроглии головного мозга и проявляют сильную нейропротекторную активность30. В этом же исследовании было обнаружено, что сапонин, добавленный в комплекс для повышения эффективности загрузки, увеличивает процент загрузки препарата во время инкубации30,34. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить стандарты загрузки лекарств в экзосомы.
В данной работе описывается разработка системы наноносителей путем инкапсуляции дофамина в экзосомы, которые были выделены из WJ-MSCs. Подробно объясняются все этапы, включая культивирование WJ-МСК, выделение и характеристику экзосом, эксперименты по загрузке лекарственными препаратами, характеристику экзосом, нагруженных дофамином, с помощью различных методов и анализ цитотоксичности in vitro .
Экзосомы представляют собой небольшие мембранные везикулы размером 40-200 нм, секретируемые большинством типов клеток, например, МСК1. Способные обеспечивать коммуникацию между клетками, экзосомы могут проникать в клетки различными путями, такими как эндоцитоз, фагоцитоз, м…
The authors have nothing to disclose.
Работа была в основном поддержана финансированием исследований, предоставленным Научно-исследовательскими проектами Технического университета Йылдыз (TSA-2021-4713).
0.22 µm membrane filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
0.45 µm syringe filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
15 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
Acetonitrile | Sigma | 271004-1L | Used for HPLC analysis |
Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process | |
Cell Culture Cabin | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
Centrifugal | Hitachi | CF16RN | Used in the exosome isolation step |
CO2 incubator with Safe Cell UV | Panasonic | Used for the cell culture process | |
Dopamine hydrochloride H8502-10G | Sigma | H8502-10G | Used in exosome dopamine loading |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | To store cells and the resulting exosomes |
Fridge | Panasonic | MPR-215-PE | Used to store cell culture and other materials |
High performance liquid chromatography-HPLC | Agilent Technologies | The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated. | |
Microscope- Primovert | Zeiss | Used to observe cells in cell culture. | |
MTT Assay | Biomatik | Used to measure cell viability | |
NanoSight NS300 | Malvern panalytical | Malvern panalytical | Used for exosome characterization |
Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Used in the exosome isolation step | |
PBS tablet | Biomatik | 43602 | In the preparation of the PBS solution |
Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
Pipette Aid | Isolab | ||
Precision balance-Kern | Kern-ABJ220-4NM | Used in the preparation of solutions | |
Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Used to digest exosomes in HPLC analysis | |
Saponin | Sigma | 47036-50G-F | It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process. |
Spectrostar-Nano-Spectrophotometry | BMG LABTECH | Used for MTT and drug release analyzes | |
SPSS 22 | statistical package program | ||
Vorteks-FinePCR | FinePCR-FineVortex | Used to mix solutions homogeneously | |
Water Bath 37 °C-Senova | Senova | Used in cell culture step | |
Wharton’s jelly mesenchymal stem cells | ATCC | ||
ZetaSizer | Malvern Nano ZS | Malvern Nano ZS | Used for exosome characterization |