Bu çalışmada, Wharton’un jöle mezenkimal kök hücrelerinden izole edilen kök hücrelerin eksozomlarının dopamin yüklemesi ile bir formülasyon elde etmeyi amaçladık. Eksozom izolasyonu ve karakterizasyonu, elde edilen eksozomlara ilaç yüklemesi ve geliştirilen formülasyonun sitotoksik aktivitesi bu protokolde tanımlanmıştır.
Boyutları 40 ila 200 nm arasındaki eksozomlar, hücre dışı veziküllerin en küçük alt grubunu oluşturur. Hücreler tarafından salgılanan bu biyoaktif kesecikler, hücreler arası kargo ve iletişimde etkin rol oynar. Eksozomlar çoğunlukla plazma, beyin omurilik sıvısı, idrar, tükürük, amniyon sıvısı, kolostrum, anne sütü, eklem sıvısı, meni ve plevral asit gibi vücut sıvılarında bulunur. Eksozomların büyüklükleri göz önüne alındığında, kan-beyin bariyerini (BBB) geçebildikleri için merkezi sinir sistemi hastalıklarında önemli rol oynayabilecekleri düşünülmektedir. Bu nedenle, bu çalışma, dopamini Wharton’un jöle mezenkimal kök hücrelerinden (WJ-MSC’ler) izole edilen eksozomlara kapsülleyerek eksozom tabanlı bir nanotaşıyıcı sistem geliştirmeyi amaçladı. Karakterizasyon sürecinden geçen eksozomlar dopamin ile inkübe edildi. Dopamin yüklü eksozomlar, inkübasyonun sonunda yeniden karakterize edildi. Dopamin yüklü eksozomlar, ilaç salınımı ve sitotoksisite deneylerinde araştırıldı. Sonuçlar, dopaminin eksozomlar içinde başarılı bir şekilde kapsüllenebildiğini ve dopamin yüklü eksozomların fibroblast canlılığını etkilemediğini gösterdi.
Eksozomlar, önemli özelliklere sahip biyoaktif veziküller, boyutları 40 nm ila 200 nm arasında değişir. Eksozomlar hücre zarından kaynaklanır ve endozomlarınsalınması nedeniyle oluşur 1. Bu yapılar hücreden hücreye iletişimciler olarak görev yapar ve aktif moleküllerin transferini kolaylaştırmak için komşu hücrelerle etkileşime girer. Eksozomlar birçok farklı kaynaktan izole edilebilir. Bunlar, plazma, idrar, beyin omurilik sıvısı, tükürük gibi vücut sıvılarının yanı sıra in vitro koşullar altında kültürlenen hücre dizilerini içerir. Eksozomlar, içerdikleri lipitler, proteinler ve nükleik asitler gibi biyomakromoleküller sayesinde sinir hasarının giderilmesinde önemli bir role sahiptir2. Sinir sisteminin3 destek hücreleri olan glia, proteinleri ve mikro RNA’ları eksozomlar4 aracılığıyla nöronların aksonlarına aktarır.
Sinir iletiminde karakteristik bir özellik olan miyelin kılıfını oluşturan lipitler de eksozomlar 4,5 aracılığıyla oligodendrositlerden salınır. Eksozomlar ayrıca sinaptik plastisite, nöronal stres tepkisi, hücre-hücre iletişimi ve beyindeki nörojenez gibi süreçlerde de rol oynar 6,7. Eksozomların nano boyutlara sahip olması, BBB’den geçmelerini sağlar. Bu zara nüfuz ettikten sonra interstisyel sıvıdan beyin omurilik sıvısına özel bir geçiş yolu vardır8. Eksozomlar, yüzey özellikleri sayesinde bir ilaç dağıtım sistemi olarak hedef hücrelerle verimli bir şekilde etkileşime girebilir ve yüklenen ilaçları aktif olarak iletebilir.
Eksozomların yüzeyindeki çeşitli yapışkan proteinlerin (tetraspaninler ve integrinler) ekspresyonu nedeniyle, bu hücre dışı veziküller, konakçı hücre zarları ile kolayca etkileşime girebilir ve kaynaşabilir9. Eksozomların BBB’ye nüfuz edebilme yetenekleri ve yüzey özellikleri nedeniyle özellikle merkezi sinir sistemi hastalıklarının tedavisinde ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanılabileceği düşünülmektedir. Mezenkimal kök hücre (MSC) kaynaklı eksozomlar, allojenik hücresel tedavilere kıyasla daha düşük immün reddi riskine sahiptir ve bu açıdan hücresiz tedavi uygulamalarının önemli bir bileşeni olabilirler10.
Dopamin, beyindeki eksikliği Parkinson hastalığının (PH) karakteristik özelliği olan ve her geçen gün kötüleşen bir moleküldür11,12,13. PH’nin mezensefalonun substantia nigra’sındaki dopaminerjik nöronların dejenerasyonu ve motor nöron fonksiyonlarının kaybı ile ilişkili olduğu bilinmektedir14,15. Dopaminerjik nöronların ölümü, nörotransmitter dopaminin beyin striatumuna beslenmesini engeller. Bu da PH’ye özgü semptomların ortaya çıkmasına neden olur16. PH’nin bu semptomları bradikinezi, postüral instabilite, rijidite ve özellikle istirahat tremorudur12,13. PH ilk kez iki yüzyıldan daha uzun bir süre önce tanımlanmış olmasına rağmen, hastalığın patolojisini ve etiyolojisini anlamaya yönelik çalışmalar halen devam etmektedir ve günümüzde PH’nin kompleks bir sistemik hastalık olduğu kabul edilmektedir17. Dopamin eksikliğinin ortaya çıktığı ve nöronların %80’inden fazlasının dejenere olduğu klinik PD semptomlarının gözlendiği öngörülmektedir18. Hastalığın tedavisinde motor semptomları azaltmak için eksik dopamin takviyesi tercih edilir. İn vivo çalışmalar, dopaminin beyne doğrudan infüzyonunun hayvanlarda semptomları önemli ölçüde azalttığını göstermiştir19. Klinikte L-DOPA (L-3,4-dihidroksifenilalanin) gibi dopamin öncülleri ve dopamin reseptör ilaçları kullanılmaktadır çünkü insanlarda dopaminin beyne doğrudan infüzyonu mümkün değildir ve sisteme giren dopamin BBB20’yi geçemez. Bu tür ilaçlar zamanla etkinliğini yitirir. Bununla birlikte, PH için hala küratif bir tedavi yaklaşımı yoktur. Bu nedenle, hastalığın patofizyolojisini ortaya koymak ve PH’nin hastalar üzerindeki etkisini azaltmak için yeni terapötik stratejiler ve tedavi modaliteleri geliştirmeye büyük ihtiyaç vardır.
Eksozom temelli çalışmalar son zamanlarda sinir sistemi hastalıklarının hem terapötik yaklaşımları hem de patolojileri hakkında bilgi toplamak açısından dikkat çekmektedir. MSC kaynaklı eksozomların sinir hasarında inflamasyonu azalttığı ve nöronal rejenerasyona katkıda bulunduğu gösterilmiştir21,22,23. Ayrıca MSC kaynaklı eksozom sekretomlarının özellikle dopaminerjik nöronlar üzerinde nörotrofik ve nöroprotektif etkiler göstererek apoptozu azalttığı bildirilmiştir24,25. Eksozomların terapötik ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanıldığı platformlar üzerine yapılan araştırmalar son yıllarda yoğun bir şekilde hızlanmıştır. Çok sayıda çalışmada, ilgili ilaçların eksozomlara kolayca kapsüllenebildiği ve hedef hücrelere, dokulara ve organlara güvenli bir şekilde verilebildiği gözlemlenmiştir26,27. Eksozomlara ilaç yüklemesi için inkübasyon, donma/çözülme döngüleri, sonikasyon ve ekstrüzyon gibi farklı yöntemlerkullanılabilir 28.
Eksozomlar veya eksozom benzeri veziküllerle çakışma, lipofilik küçük moleküllerin bu dağıtım sistemlerine pasif olarak kapsüllenmesine izin verir28,29,30. Özellikle, kurkumin 31, katalaz30, doksorubisin32 ve paklitaksel33 gibi çeşitli moleküller eksozomlara etkili bir şekilde yüklendi. Antioksidan aktiviteye sahip olan katalaz içeren eksozomların beyindeki nöronlarda ve mikroglial hücrelerde verimli bir şekilde biriktiği ve güçlü nöroprotektif aktiviteler sergilediği gözlemlenmiştir30. Aynı çalışmada, yükleme verimliliğini artırmak için kompleks içine eklenen saponinin, inkübasyon sırasında ilaç yükleme yüzdesini arttırdığı bulunmuştur30,34. Bununla birlikte, eksozomlara ilaç yüklemesi için standartları oluşturmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Bu makale, dopaminin WJ-MSC’lerden izole edilen eksozomlara kapsüllenmesiyle bir nanotaşıyıcı sistemin geliştirilmesini açıklamaktadır. WJ-MSC’lerin kültivasyonu, eksozomların izolasyonu ve karakterizasyonu, ilaç yükleme deneyleri, dopamin yüklü eksozomların çeşitli tekniklerle karakterizasyonu ve in vitro sitotoksisite analizi dahil olmak üzere tüm adımlar ayrıntılı olarak anlatılmaktadır.
Eksozomlar, çoğu hücre tipi, örneğin MSC’ler1 tarafından salgılanan 40-200 nm boyutlarında küçük zar vezikülleridir. Hücreler arasındaki iletişimi sağlayabilen eksozomlar, hücrelere endositoz, fagositoz, mikropinositoz, lipid aracılı içselleştirme ve füzyon gibi farklı yollarla girebilirler33,44. Diğer nanotaşıyıcı sistemlerle karşılaştırıldığında, eksozom yüzeyinde bulunan lipitler ve kolesterol, hem h…
The authors have nothing to disclose.
Çalışma, öncelikle Yıldız Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (TSA-2021-4713) tarafından sağlanan araştırma fonu ile desteklenmiştir.
0.22 µm membrane filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
0.45 µm syringe filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
15 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
Acetonitrile | Sigma | 271004-1L | Used for HPLC analysis |
Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process | |
Cell Culture Cabin | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
Centrifugal | Hitachi | CF16RN | Used in the exosome isolation step |
CO2 incubator with Safe Cell UV | Panasonic | Used for the cell culture process | |
Dopamine hydrochloride H8502-10G | Sigma | H8502-10G | Used in exosome dopamine loading |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | To store cells and the resulting exosomes |
Fridge | Panasonic | MPR-215-PE | Used to store cell culture and other materials |
High performance liquid chromatography-HPLC | Agilent Technologies | The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated. | |
Microscope- Primovert | Zeiss | Used to observe cells in cell culture. | |
MTT Assay | Biomatik | Used to measure cell viability | |
NanoSight NS300 | Malvern panalytical | Malvern panalytical | Used for exosome characterization |
Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Used in the exosome isolation step | |
PBS tablet | Biomatik | 43602 | In the preparation of the PBS solution |
Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
Pipette Aid | Isolab | ||
Precision balance-Kern | Kern-ABJ220-4NM | Used in the preparation of solutions | |
Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Used to digest exosomes in HPLC analysis | |
Saponin | Sigma | 47036-50G-F | It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process. |
Spectrostar-Nano-Spectrophotometry | BMG LABTECH | Used for MTT and drug release analyzes | |
SPSS 22 | statistical package program | ||
Vorteks-FinePCR | FinePCR-FineVortex | Used to mix solutions homogeneously | |
Water Bath 37 °C-Senova | Senova | Used in cell culture step | |
Wharton’s jelly mesenchymal stem cells | ATCC | ||
ZetaSizer | Malvern Nano ZS | Malvern Nano ZS | Used for exosome characterization |