Summary
We beschrijven een protocol voor de productie, cultuur en visualisatie van menselijke kankers, die zijn uitgezaaid naar de peritoneale oppervlakken. Reseceerde tumormonsters worden gesneden met behulp van een vibratoom en gekweekt op permeabele inserts voor verhoogde oxygenatie en levensvatbaarheid, gevolgd door beeldvorming en downstream-analyses met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.
Abstract
Pseudomyxoma peritonei (PMP) is een zeldzame aandoening die het gevolg is van de verspreiding van een mucineuze primaire tumor en de resulterende accumulatie van mucine-afscheidende tumorcellen in de peritoneale holte. PMP kan voortkomen uit verschillende soorten kanker, waaronder appendiceale, eierstok- en colorectale, hoewel appendiceale neoplasmata veruit de meest voorkomende etiologie zijn. PMP is een uitdaging om te bestuderen vanwege de (1) zeldzaamheid, (2) beperkte muizenmodellen en (3) mucineuze, acellulaire histologie. De hier gepresenteerde methode maakt real-time visualisatie en ondervraging van deze tumortypen mogelijk met behulp van patiënt-afgeleide ex vivo organotypische plakjes in een preparaat waarbij de tumormicro-omgeving (TME) intact blijft. In dit protocol beschrijven we eerst de bereiding van tumorplakken met behulp van een vibratoom en vervolgens een langetermijncultuur. Ten tweede beschrijven we confocale beeldvorming van tumorplakken en hoe functionele uitlezingen van levensvatbaarheid, calciumbeeldvorming en lokale proliferatie kunnen worden gevolgd. Kortom, plakjes worden geladen met beeldvormende kleurstoffen en worden in een beeldvormingskamer geplaatst die op een confocale microscoop kan worden gemonteerd. Time-lapse-video's en confocale afbeeldingen worden gebruikt om de initiële levensvatbaarheid en cellulaire functionaliteit te beoordelen. Deze procedure onderzoekt ook translationele cellulaire beweging en paracriene signaleringsinteracties in de TME. Ten slotte beschrijven we een dissociatieprotocol voor tumorplakken dat moet worden gebruikt voor flowcytometrie-analyse. Kwantitatieve flowcytometrie-analyse kan worden gebruikt voor bench-to-bedside therapeutische testen om veranderingen te bepalen die optreden in het immuunlandschap en de epitheelcelinhoud.
Introduction
Pseudomyxoma peritonei (PMP) is een zeldzaam syndroom met een incidentie van 1 per miljoen mensen per jaar1. De meeste PMP-gevallen worden veroorzaakt door metastasen van appendiceale neoplasmata. Aangezien muizen geen mensachtige appendix hebben, blijft het modelleren van dit type kanker uiterst uitdagend. Hoewel de primaire ziekte vaak te genezen is door chirurgische resectie, zijn de behandelingsopties voor gemetastaseerde ziekte beperkt. Daarom is de reden voor het ontwikkelen van dit nieuwe organotypische slice-model het bestuderen van de pathobiologie van PMP. Tot op heden zijn er geen appendiceale organoïde modellen die eeuwigdurend kunnen worden gekweekt; Een recent model bleek echter nuttig te zijn voor het farmacologisch testen van therapeutische middelen en immunotherapie2. Als zodanig hebben we een organotypisch plakkweeksysteem aangepast, dat is gebruikt bij andere soorten menselijke kankers, zoals hersenen, borsten, pancreas, longen, eierstokken en anderen 3,4,5,6.
Naast appendiceale neoplasmata is PMP af en toe het gevolg van andere tumortypen, waaronder eierstokkanker7, en in zeldzame omstandigheden intraductale papillaire mucineuze neoplasmata8 en darmkanker9. Bovendien hebben deze tumoren de neiging om langzaam te groeien, met slechte enentpercentages in patiënt-afgeleide xenograft (PDX) -modellen10,11. Gezien deze uitdagingen is er een onvervulde behoefte om modellen te ontwikkelen om deze ziekte te bestuderen om de pathobiologie van PMP te begrijpen, en hoe deze kankercellen: worden gerekruteerd naar de peritoneale oppervlakken, prolifereren en ontsnappen aan immuunsurveillance.
Hoewel gesneden uit de systemische vasculaire circulatie, bevatten tumorplakken cellulaire en acellulaire componenten, waaronder de extracellulaire matrix, stromale cellen, immuuncellen, kankercellen, endotheelcellen en zenuwen. Deze semi-intacte micro-omgeving maakt het functioneel onderzoek van deze celtypen mogelijk, wat uniek voordelig is in vergelijking met 3D-organoïde culturen, die alleen uit kankercellen bestaan12. Hoewel organotypische plakculturen in sommige opzichten voordelig zijn, zijn ze ook inherent een op lage doorvoer gebaseerde benadering, vergeleken met 3D-organoïden, die kunnen worden uitgebreid en geschikt zijn voor multiplexed experimentele therapeutische geneesmiddelenscreening13,14,15. In het geval van PMP zijn er geen rapporten die een betrouwbare vaststelling en eeuwigdurende doorgifte van PMP-afgeleide organoïden documenteren16. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de langzaam groeiende aard van PMP-afgeleide tumorcellen, evenals het lage aantal kwaadaardige epitheelcellen in deze mucineuze tumoren. Gezien de noodzaak om modellen te ontwikkelen om PMP te bestuderen, zijn organotypische plakjes bij uitstek geschikt om deze ziekte te bestuderen. We presenteren een protocol voor het voorbereiden, in beeld brengen en analyseren van PMP van menselijke exemplaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De deidentificatie en verwerving van alle weefsels werden uitgevoerd onder een IRB-goedgekeurd protocol aan de Universiteit van Californië, San Diego.
1. Bereiding van menselijke PMP-weefsels voor weefselbewerking en -kweek
- Transport van tumorweefsels en microdissectie
- Bereid de transport- en cultuurmedia voor: voltooi 10% (v/v) Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-Glutamine, 1% Penicilline/Streptomycine (Pen Strep).
- Bij aankomst van het weefsel en volgens een institutioneel IRB-goedgekeurd protocol, breng PMP-tumorweefsels over in 35 schotels met een diameter van 6 cm die volledige DMEM bevatten.
- Micro-ontleed vaste delen van de tumor van elke vloeibaar gemaakte mucine met behulp van een scalpel. Terwijl mucineknobbels ingebed in vaste delen van het weefsel kunnen worden gesneden, verwijdert u alle vloeibaar gemaakte gebieden van de tumor. Naast het verwijderen van vloeibaar mucine of zeer mucineuze weefselgebieden, verwijdert u elk weefsel dat moeilijk te snijden is met een scalpel. Snijd weefselknobbels in kleinere stukjes, ongeveer 1 cm3 groot.
OPMERKING: Het verkrijgen van tumorknobbels gereinigd van mucine en dichte ECM zal essentieel zijn voor succesvol snijden met behulp van een vibratoom. Als kwaliteitscontrole wordt tumorweefsel dat in het onderzoekslaboratorium aankomt eerst door een patholoog gesneden, dat vervolgens wordt gedistribueerd door de UCSD-biorepository. Weefseldonoren die palliatieve debulking van de omentale cake ondergaan, zijn optimale gevallen voor dit protocol gezien een hoge ziektelast, waardoor meer plakproductie mogelijk is door de verhoogde massa weefselbeschikbaarheid voor onderzoek.
LET OP: Werken met menselijke weefsels vereist bioveiligheidsniveau 2 (BSL2) certificering. Neem contact op met de instelling voor training over BSL2-procedures.
- Agarosepreparaat en weefselinbedding
- Bereid een 5% oplossing van laagsmeltende agarose in PBS zonder FBS op dezelfde dag van weefselaankomst. Let goed op de agarose-oplossing, want deze heeft de neiging om snel te koken.
OPMERKING: Laagsmeltende agarose is essentieel voor het inbedden van weefselstukken. Hoog gesmolten agarose zal stollen bij hogere temperaturen, waardoor de levensvatbaarheid van weefselplakken wordt verminderd als ze zijn ingebed. Bovendien zal FBS in de oplossende oplossing precipitaten veroorzaken. - Plaats de verkregen weefselstukken in schaaltjes van 6 cm zonder vloeistof. Plaats niet meer dan 2-3 stuks per schaal van 6 cm, zodat ze als agaroseblokjes kunnen worden verwijderd zonder andere weefsels te storen of aan te raken.
- Voeg de vloeibare 5% agarose-oplossing toe aan schaaltjes van 6 cm met de 1 cm3 tumormonsters. Voeg voldoende agarose toe om het exemplaar te bedekken. Eenmaal toegevoegd, plaats de ingesloten weefsels gedurende 30 minuten in een koelkast van 4 °C.
- Bereid een 5% oplossing van laagsmeltende agarose in PBS zonder FBS op dezelfde dag van weefselaankomst. Let goed op de agarose-oplossing, want deze heeft de neiging om snel te koken.
- Montage van weefselmonsters op het vibratoom
- Haal de gestolde agar uit de koelkast en snijd de agaroseblokjes iets groter dan de breedte van het weefsel met een scalpel.
- Breng superlijm aan op het vibratomenstadium en plaats het agaroseblokje voorzichtig op de secondelijm. Laat 1-2 minuten stollen voordat de lijm stolt. Op dit punt moet de agarose-kubus met weefsel aan het stadium worden bevestigd.
- Bevestig het mes aan het vibratoom en stel de gewenste dikte van het weefselgedeelte in. Voor optimale downstream-beeldvorming met behulp van confocale microscopie moeten secties ongeveer 150 tot 250 micron zijn. Druk op de Start-knop en blijf door het snijden van het agarose-weefselblok bladeren totdat het weefsel volledig is gesneden.
OPMERKING: Als het weefsel niet snijdt of loskomt van de agarose-kubus, overweeg dan om het weefsel in te bedden in een hogere concentratie agarose en knip eventuele extra weefselstukken af die mogelijk te dicht zijn om te snijden of aan het vibratome-mes kleven.
- Het kweken van weefselplakken op permeabele inserts
- Bereid een doorlatende insertplaat voor kweek voor door 2 ml complete DMEM-media boven en 3 ml onder het permeabele membraan toe te voegen.
- Til de plakjes weefsel voorzichtig uit de snijkamer van het vibratoom met een dunne kwast en plaats twee tot vier plakjes in doorlatende kweekschalen met volledige DMEM-media. Zuig na 24 uur de media op met een pipet en vervang de media door verse cultuurmedia.
- Kweek de plakjes maximaal 7 dagen bij 37 °C/5% CO2 en vervang de media om de 24 uur. Voeg op dit moment controles voor celdoding (bortezomib) en testbare chemotherapieën 5-fluoruracil (5-FU) toe aan de kweekmedia om farmacologische interventie uit te voeren.
- Verwacht na 7 dagen kweken ongeveer 15% -25% verlies van levensvatbaarheid in vergelijking met het tijdstip van dag 0 (onmiddellijk na het snijden) onder niet-medicamenteuze behandelde omstandigheden (volledige DMEM). Meet de levensvatbaarheid met behulp van levend-dode levensvatbaarheidskleurstoffen zoals calceïne AM (levend) en propidiumjodide (dood).
2. Confocale beeldvorming van plakjes levend menselijk weefsel
OPMERKING: Zodra de organotypische tumorplakken zijn voorbereid, is het essentieel om de levensvatbaarheid van het weefsel te bepalen om een efficiënte en geoptimaliseerde downstream-analyse uit te voeren. Aangezien tumormonsters 150-250 μm dik zijn, wordt confocale of twee-fotonenmicroscopie ten zeerste aanbevolen boven breedveldmicroscopen voor het bepalen van studies in situ. Flowcytometrie kan ook worden gebruikt voor het bepalen van de levensvatbaarheid en cellulaire populaties (methoden staan hieronder). De ruimtelijke resolutie gaat echter verloren tijdens flowcytometrie-analyse en de levensvatbaarheid wordt waarschijnlijk onderschat gezien de noodzaak om tumorplakken te scheiden met mechanische en chemische methoden.
- Reagensbereiding en experimentele opstelling
- Plaats tumorplakken voor confocale beeldvormingsanalyse in een enkele put van een schaal met 12 putten die PBS met 1% FBS bevat. Voor calciumbeeldvormingsexperimenten, in plaats van PBS, incuberen de plakjes in extracellulaire calciumoplossing die als volgt is bereid: 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,4, 3 mM glucose, steriel gefilterd. Bereid deze oplossing van tevoren en bewaar deze maximaal 1 maand bij 4 °C (zie rubriek 2.1.8).
- Volg de concentraties en protocollen die door de fabrikant worden aanbevolen, kleurt u monsters met beeldvormende kleurstoffen (zie materiaaltabel) om de levensvatbaarheid van weefselplakken te bepalen. Afbeelding gedurende 10 min-1 uur na toevoeging van de levensvatbaarheidskleurstof.
- Breng na incubatie de plakjes over naar een optisch heldere petrischaal met glazen bodem met PBS met 1% FBS voor gebruik voor beeldvorming op een confocaal beeldvormingsapparaat.
OPMERKING: Voor confocale beeldvorming is het Nikon A1R Confocal platform gebruikt. - Open de confocale beeldvormingssoftware. Begin met beeldvorming op 10x en selecteer de XYZ-beeldmodus. Configureer vervolgens de acquisitie-instellingen als volgt.
- Schakel de volgende lasers in: 488 nm en 561 nm. Stel de versterking in op 100 met laservermogen op 1%. Pas het laservermogen en de versterking indien nodig aan tijdens de beeldacquisitie. Afhankelijk van de gewenste beeldkwaliteit selecteert u 512 x 512 pixels of 1024 x 1024 pixels voor een hogere resolutie.
- Selecteer Interlock verwijderen en selecteer vervolgens Scannen om beeldvorming te starten.
- Voor calciumbeeldvorming, incuberen weefselplakken met Fluo-4-AM gedurende 1 uur beschermd tegen licht. Volg het protocol van de fabrikant voor het oplossen van Fluo-4-AM in DMSO. Was na 1 uur plakjes 3x met extracellulaire calciumoplossing en volg het beeldvormingsprotocol in stappen 2.1.4-2.1.5.
- Voor calciumbeeldvormingsexperimenten met Fluo-4-AM selecteert u XYZT en deselecteert u de 561 nm-laser om de acquisitiesnelheid te verhogen. Gebruik daarnaast de resonantiescanner om de beeldsnelheid verder te verhogen.
3. Disassociatie van levende plakken voor flowcytometrie
OPMERKING: Disassociatie van plakjes levend weefsel kan worden gebruikt voor verschillende downstream-toepassingen, waaronder immunotypering, beoordeling van de levensvatbaarheid en ondervraging van de veranderingen in celpopulaties na farmacologische interventie. Er moeten maatregelen worden genomen om ervoor te zorgen dat de weefselkwaliteit en de levensvatbaarheid van de cellen tijdens het disassociatieproces behouden blijven.
- Snijd een klein stukje van het uiteinde van een pipetpunt van 1 ml om de opening te verbreden om krachtige mechanische dissociatie mogelijk te maken door gedurende 1 minuut te pipetteren.
- Incubeer plakjes bij 37 °C met rotatie gedurende 5-15 minuten in 1 ml verteringsbuffer bestaande uit hoge glucose DMEM, 10% zacht collagenase/hyaluronidase (GCH), 10% FBS en 10% DNaseI (1 mg/ml bouillon).
OPMERKING: Batch-afhankelijke veranderingen van collagenase / hyaluronidase worden vaak gevonden. - Voer krachtige verstoring van het weefsel uit met behulp van mechanische dissociatie 2-3 keer tijdens de incubatie. Zorg ervoor dat u de spijsvertering elke 5 minuten met het oog controleert op bewijs van volledige spijsvertering. Stop indien nodig de enzymatische vertering door verder te gaan met stap 3.1.4.
- Eenmaal verteerd, pipetteer de plakjes en de verteringsmedia bovenop een filter van 70 μm dat bovenop een conische buis van 50 ml wordt geplaatst. Pluk grotere stukken met een steriele tang of een pipet.
- Gebruik de stompe achterkant van een plastic spuit van 5 ml om grotere niet-gedissocieerde plakjes te pureren en verder te wassen met 4 ml PBS met 2% FBS.
- Neem het gedissocieerde celsupernatant in een conische buis van 50 ml en draai gedurende 5-10 minuten op 300 x g . Verwijder het supernatant en was de pellet met 1 ml PBS met 2% FBS.
- Om het monster voor te bereiden op flowcytometrie, voegt u de blokkeringsbuffer met 50 μL humaan Fc-blok toe en laat u gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur staan. Voer extracellulaire kleuring uit met behulp van de respectieve antilichamen in 50 μL PBS met 2% FBS.
OPMERKING: Er zijn veel flowcytometriesystemen. Zodra het monster is voorbereid voor flowcytometrie, raadpleegt u het protocol van de fabrikant voor de werking van het apparaat.
4. Farmacologische interventie met levende weefselplakken voor levensvatbaarheids- en proliferatieanalyse
OPMERKING: Zodra de organotypische tumorplakken zijn voorbereid, kunnen interventionele benaderingen worden uitgevoerd met behulp van verschillende methoden, waaronder het testen van geneesmiddelen, siRNA en virale infectie van plakjes levend weefsel. Hier zullen we het testen van geneesmiddelen bespreken, evenals downstream functionele uitlezingen, waaronder levensvatbaarheidsanalyse met behulp van lokale proliferatie.
- Bereid 10 ml 10% v / v complete DMEM met 10% FBS, 2 mM L-Glutamine, 1% Pen Strep.
- Aliquot 5 ml complete media voor controle- en behandelingsomstandigheden. Voeg aan de resterende 5 ml media bortezomib (2 μM) toe om celdood in tumorplakken te induceren als een positieve controle.
OPMERKING: Bortezomib, in hoge concentraties, is een cytotoxisch geneesmiddel dat celdood induceert. De andere cytotoxische geneesmiddelen kunnen worden gebruikt als positieve controle voor celdoding. - Voeg met behulp van twee tot vier weefselplakken, die op de doorlatende schalen zijn geplateerd, de in stap 4.2 bereide media aan de schaal toe, evenals eventuele aanvullende combinatietherapieën die moeten worden gebruikt voor downstream levensvatbaarheid LIVE/DEAD-analyse met behulp van confocale microscopie zoals beschreven in stap 2.1.2, of gebruik een commerciële luminescerende levensvatbaarheidsanalyse met behulp van sequentieel afgestemde plakjes.
OPMERKING: Sequentiële slice matching is essentieel voor luminescerende levensvatbaarheidsanalyse, aangezien luminescerende levensvatbaarheidstest afhankelijk is van cellulair ATP-gehalte. Omdat interne controles verloren gaan tijdens cellyse, zijn plakjes van vergelijkbare grootte vereist, omdat de resultaten afhankelijk zijn van het beginaantal levensvatbare cellen (d.w.z. onevenwichtige plakjes zullen resulteren in onevenwichtige resultaten). Als de gebruiker geen opeenvolgende plakjes verkrijgt, is luminescerende levensvatbaarheidsanalyse niet mogelijk en is als zodanig een andere levensvatbaarheidsbeoordelingsmethode vereist (flowcytometrie of confocale beeldvorming op basis van levende celanalyse). - Laat weefselplakken in cultuur met volledige DMEM gedurende 2-5 dagen, verander van media evenals bortezomib en 5-FU om de andere dag.
- Voeg voor een luminescerende levensvatbaarheidsanalyse 500 μL PBS toe aan een schaal met 12 putten en breng de sequentieel afgestemde weefselplakken over naar de PBS-oplossing met een penseel of gebruik de zuigkracht van een pipet van 1 ml voorzichtig om deze over te brengen.
- Verwijder de PBS en voeg de luminescerende levensvatbaarheidsanalyseoplossing toe die is voorbereid. Zie de handleiding voor de bereiding van het reagens.
- Voeg 500 μL van de luminescerende levensvatbaarheidsoplossing per toestand toe en incubeer met een langzame rotatie op de schudder bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Lees luminescentie af met behulp van een luminescentieplaatlezer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kortom, menselijke tumormonsters van PMP worden verkregen onder een IRB-goedgekeurd protocol. Het weefsel wordt geprepareerd, micro-ontleed en gestold in een agarose-mal om te worden gesneden met behulp van een vibratoom (figuur 1A; Video 1). Eenmaal gesneden, worden weefselplakken geplaatst en gekweekt op permeabele insertmembranen (figuur 1B), die kunnen worden gebruikt voor beeldvormingstests in situ, evenals voor cellulaire en functionele ondervraging met behulp van flowcytometrie, confocale beeldvormingsanalyse en cytotoxiciteitstests. Een representatieve workflow van de kweek en verwerking van menselijke PMP-weefselplakken is weergegeven in figuur 1C. De eerste beeldvormingsanalyse kan worden uitgevoerd door middel van lichtmicroscopie (figuur 2A-B). De kleuring van mucine in weefselplakken werd gevisualiseerd met behulp van periodieke zuur-Schiff (PAS) kleuring (figuur 2C) en mucine-specifieke antilichamen (figuur 2D). Om de levensvatbaarheid te beoordelen, worden plakjes gesneden uit verschillende regio's geïncubeerd in calceïne AM en propidiumjodide om hun gezondheid en levensvatbaarheid te bepalen (figuur 2E-F). De meeste cellen (ongeveer 85%) zijn levensvatbaar (calceïne AM +; groen), terwijl sommige cellen dood zijn (propidiumjodide; rood) wanneer ze worden gevisualiseerd door confocale microscopie na het eerste snijden. De extracellulaire matrix kan worden gevisualiseerd met behulp van een invallend wit licht op een hoekpositie van 180°. Tumoren die voorafgaand aan de operatie met chemotherapie worden behandeld, vertonen vaak meer PI-signaal. De proliferatie van weefselplakken kan worden gevolgd met behulp van EdU toegevoegd in de plakkweekmedia. Voor detectie werd een commerciële celproliferatietestkit gebruikt en de test werd uitgevoerd op vaste plakjes na 72 uur kweek. Actief prolifererende cellen in cultuur kunnen worden gemeten in het FITC-kanaal (groen). De celkernen (DAPI) overlappen met cellen die zich tijdens de kweek hebben vermenigvuldigd (EdU+) (figuur 2G). Deze resultaten worden gekwantificeerd om het aantal prolifererende cellen (DAPI+ kernen) in de tumorschijf te bepalen (figuur 2H). De hier getoonde resultaten geven aan dat gekweekte plakjes levensvatbaar en proliferatief zijn tijdens plakcultuur.
Om de functionaliteit van immuuncellen te identificeren, werden Ca2+ beeldvormingsstudies uitgevoerd op levende tumorplakken (figuur 3; Video 2). Met behulp van deze aanpak kunnen directe en paracriene signaleringsmechanismen worden geïdentificeerd. Om lokale immuuncellen te labelen, werd in situ cytolabeling uitgevoerd door plakjes te incuberen met een CD11b-PE geconjugeerd antilichaam samen met Fluo-4-AM (figuur 3A). Pseudocolor geschaalde afbeeldingen die intracellulaire Ca 2+ niveaus laten zien, maken het beter mogelijk om differentiële niveaus van intracellulair Ca2+ te visualiseren (figuur 3B). Spontane activiteit werd bijgehouden en timelapse-beelden worden getoond voor vóór (figuur 3C), tijdens (figuur 3D) en na (figuur 3E) een intracellulaire Ca2+ respons binnen de gemarkeerde (witte gestippelde cirkeldoos; Figuur 3A,B) CD11b+ immuuncel. De ruwe sporen van Ca2+ responsen in de CD11b immuuncel (rood) samen met andere responsieve (zwart) en niet-responsieve cellen (blauw) worden getoond (Figuur 3F). Kwantificering van het gebied onder de curve van de ruwe sporen van de reagerende immuuncel (CD11b+; rode figuur 3F) vergeleken met de kwantificering van de niet-reagerende cel (blauw; Figuur 3F) zijn gekwantificeerd (figuur 3G). Deze resultaten geven aan dat live cell functionele tracking kan worden uitgevoerd met behulp van dit platform voor levende weefselplakken.
Downstream-analyse met behulp van flowcytometrie kan worden gebruikt om immunotype te maken en veranderingen in cellulaire profielen te onderzoeken als reactie op therapeutische middelen. Resultaten kunnen te wijten zijn aan directe signalering of indirecte (paracriene) signalering. Representatieve resultaten van immunotypering van een tumormonster van een patiënt met PMP zijn weergegeven in figuur 4A. Het tumorimmunoprofiel werd gekwantificeerd en het donormonster 337 bleek hoge niveaus van M2-macrofagen te hebben (figuur 4B). Deze resultaten geven aan dat het gebruik van PMP-afgeleide weefselplakken onderzoekers in staat stelt om het unieke donorcellulaire landschap van de tumormonsters van de patiënt te ondervragen. Verdere analyse en ondervraging van het moleculaire, cellulaire en genomische landschap is gerechtvaardigd om een therapeutische benadering van bank tot bed te ontwikkelen die gunstig kan zijn voor de uitkomsten van de patiënt.
Farmacotypering en downstream-analyse van weefselplakken uit PMP-weefsels zijn een directe methode om chemoresistantie en geneesmiddelgevoeligheid te meten (figuur 5). De resultaten tonen celdoding van tumorplakken zoals bevestigd door cytotoxiciteitsanalyse en TUNEL confocale beeldvorming als reactie op het cytotoxische geneesmiddel bortezomib (2 μM) en 5-fluorouracil (5-FU; 2 μM) (figuur 5A-C). Aangezien tumordodende reacties zeer heterogeen zijn, is het belangrijk om gegevens te stratificeren op basis van tumorgraad en eerdere HIPEC, aangezien herhaalde chemotherapie een ineffectieve methode is gebleken om tumorcellen in vivo en ex vivo17,18 te aborteren. Naast TUNEL-analyse werd luminescerende levensvatbaarheidsanalyse uitgevoerd met behulp van sequentieel gematchte segmenten (figuur 5D). Het is essentieel om sequentieel gematchte tumorplakken te gebruiken bij het uitvoeren van cytotoxiciteitstests, omdat ongeëvenaarde plakjes tot onbetrouwbare resultaten zullen leiden.
Figuur 1: Schematische illustratie van pseudomyxoma peritonei ex vivo organotypisch plakkweekplatform met representatieve weefselplakken. Een representatieve workflow voor het voorbereiden van organotypische plakculturen voor immunotypering en het onderzoeken van functionele eigenschappen van pseudomyxoomtumoren van appendiceale oorsprong. (A) Het beeld van een levend gemonteerd tumorknobbeltje van een pseudomyxoma peritonei (PMP) neoplasma. De tumorknobbel is ingebed in agarose, die met behulp van secondelijm aan een vibratoom wordt bevestigd. (B) De representatieve verdeling van snijdende tumorplakken en rangschikking in een trans-well kweekschaal. (C) Het schema dat de workflow van slice culture en ondervraging van tumorplakken weergeeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Confocale beeldvorming en functionele analyse van plakjes levend weefsel . (A) Brightfield-beeld 2x vergroting van een representatieve weefselschijf gesneden van een patiënt met pseudomyxoma peritonei van appendiceale oorsprong. (B) Een 10x vergroting van de representatieve weefselschijf zoals weergegeven in A. (C) PAS-kleuring van een weefsel van een patiënt met pseudomyxoma peritonei. Schaalbalk 1 mm. (D) Immunofluorescentiebeeldvorming met behulp van MUC2-antilichaam (groen), EPCAM (rood) en DAPI (blauw). Schaalbalk 50 μm. (E) Immunofluorescentie beeldvorming van het gebruik van levende (calceïne AM; groen) en dode (propidiumjodide; rood) kleurstoffen van donor 39. Schaalbalk 50 μm. (F) Kwantificering van de levensvatbaarheidsanalyse met behulp van drie afzonderlijke plakjes van donor 39 tijdens het eerste weefselsnijden. Foutbalken zijn de standaardfout van het gemiddelde. (G) Immunofluorescentie beeldvorming van proliferatie met behulp van EdU (groen). Celkernen zijn gelabeld met DAPI (blauw). (H) Kwantificering van het aantal EdU-positieve cellen per 1.000 cellen. N = 3 representatieve plakjes van donor 39. Foutbalken zijn de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Live cell tracking met behulp van calciumbeeldvorming van levende weefselplakken. (A) In situ cytolabeling van een plakje levend weefsel van donor 292. CD11b gelabelde macrofagen weergegeven in rood. Calcium imaging kleurstof Fluo-4-AM (groen). Macrofaag gelabeld met CD11b en Fluo-4-AM gemarkeerd in wit. (B) Pseudokleurenschaal van een plakje levend weefsel (zie onder A). Macrofaag wit gemarkeerd zoals in A. Schaalbalk met 100 μm is van toepassing op A. Pseudokleurschaalbalk weergegeven als gemiddelde grijswaarden. (C-E) Hoge vergrotingsafbeelding van Fluo-4-AM vóór (C), tijdens (D) en na (E) calciumactivering. (F) Kwantificering van het calciumgehalte aan de hand van ruwe sporen. De CD11b+ macrofaag gemarkeerd in A-E is rood gemarkeerd. Een niet-reagerende cel wordt blauw gemarkeerd. De andere reagerende celsporen worden in het zwart weergegeven. (G) Kwantificering van het genormaliseerde gebied onder de weergegeven curve tussen CD11b+ macrofaag en een niet-reagerende cel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Immunotypering van levende menselijke tumorplakken van pseudomyxoma peritonei . (A) Representatief schema voor het uitvoeren van flowcytometriekarakterisering van immuuncelprofielen van pseudomyxoomtumoren van appendiceale oorsprong. (B) Het percentage immuuncelsubsets is kleurgecodeerd en de gemiddelde balk van de donor is uitgezet. De bovenstaande kleurmarkeringen zijn bedoeld voor subsets van immuuncellen in cirkeldiagrammen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve analyse voor farmacologische interventie met organotypische plakcultuur. (A) Immunofluorescentie van representatieve beelden van TUNEL-analyse op onbehandelde plakjes (linkerkolom), 5-FU (2 μM; middelste kolom) of bortezomib (2 μM; rechterkolom) behandelde plakjes. (B) Kwantificering van TUNEL-immunofluorescentie als percentage TUNEL-positieve DAPI+-cellen van donor 339. (C) Kwantificering van TUNEL-immunofluorescentie als percentage TUNEL-positieve PanCK+-cellen van donor 339. (D) Kwantificering van met geneesmiddelen behandelde plakjes met behulp van luminescerende levensvatbaarheidsanalyse van donor 339 gepoold van 2-3 sequentieel gematchte biologische replicaties. CTL staat voor controle. Concentratie voor controle, 5-FU (2 μM) en Bortezomib (2 μM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Het snijden van levende menselijke weefselplakken uit gemetastaseerde mucineuze tumorknobbeltjes. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: Calciumbeeldvorming van levende organotypische tumorplakken van pseudomyxoma peritonei. Pseudokleurenbeelden van maximale projectie van confocale beelden van een levende weefselschijf geladen met Fluo-4-AM op tijdstip 00:00. De schaalbalk is 50 μm (rechtsonder). Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript beschrijft een techniek die kan worden gebruikt om menselijke pseudomyxoma peritonei (PMP) tumormonsters te kweken, te ondervragen en te analyseren. We hebben talloze downstream functionele assays gebruikt om de tumorimmuunmicro-omgeving te ondervragen en een platform voor bench-to-bedside testen.
Hoewel de methode zeer efficiënt is in onze handen, vereist het enige oefening om tumormonsters te snijden met behulp van een vibratoom. We kwamen namelijk problemen tegen die te wijten waren aan zeer mucineuze monsters, evenals monsters die onjuist werden gemicrodissecteerd om niet-snijdbare steigers te verwijderen (buikwand, ascites, verschillende ECM-eiwitten). Als zodanig is microdissectie van het PMP-weefsel om overtollig mucine te verwijderen een cruciale stap van dit protocol. We rapporteren een succespercentage van 80% bij patiënten met solide knobbeltjes zoals eerder gemeld. Hoogwaardige monsters waren technisch minder uitdagend om18 te snijden. Bovendien is de bereiding van agarose (zonder FBS) en stolling van het weefsel in agarose ook belangrijk voor dit protocol om weefselplakken te produceren. Bovendien is het essentieel dat de onderzoeker op de hoogte is van informatie over weefselaandoeningen en chirurgische parameters van het monster (locatie van de metastase, voorbehandelde monsters), omdat deze nieuwe inzichten zullen helpen en helpen bij het oplossen van mogelijke probleemoplossingsproblemen. Een andere cruciale stap in dit protocol is in de functionele analyse van tumorcellen. Hier is het essentieel om een epitheliale marker (zoals cytokeratinekleuring) te gebruiken in combinatie met een functionele uitlezing (apoptose, proliferatie) om de werkzaamheid te beoordelen. Dit is nodig in dit specifieke type tumor, omdat veel PMP-tumoren minder dan 10% van de cellulaire samenstelling hebben als tumorcellen18. Als zodanig is flowcytometrie of confocale beeldvorming de voorkeursmethode voor analyse. High throughput assays met behulp van luminescentie-gebaseerde beeldvorming kunnen echter geschikt zijn bij tumoren met een hoger tumorcelgehalte, of bij het beoordelen van de rol van therapeutica op de TME.
Ondanks dat het een krachtig hulpmiddel is, heeft de organotypische plakcultuur bepaalde beperkingen. Een uitdaging van deze techniek is bijvoorbeeld de cellulaire heterogeniteit binnen tumoren. Om rekening te houden met tumorheterogeniteit, moeten sequentieel gesneden plakjes uit vergelijkbare tumorregio's worden gematcht tussen groepen voor behandeling en analyse van de levensvatbaarheid van cellen. Het snijden en voorbereiden van plakjes vereist oefening om niet-snijdbare tumorsteigers te microdissecteren. Deze vaardigheden zijn vereist voor het succesvol snijden en optimaliseren van weefselplakken om experimentele vooroordelen te beperken. Een andere beperking is de levensvatbaarheid van weefsel tijdens het kweken van plakjes. Hoewel het mogelijk is om hersen- of hartsneden maandenlang te behouden in culturen 19,20, zijn plakculturen van PMP momenteel slechts ongeveer 1 week getest in cultuur18, wat langdurig experimenteel onderzoek voorkomt, inclusief chronische medicamenteuze behandeling en genetische manipulatie. Verbeteringen in kweekmethoden zoals het toevoegen van supplementen en groeifactoren kunnen nodig zijn om de levensduur van PMP-plakculturen te verlengen.
Organotypische plakcultuur is een veelgebruikte techniek om verschillende organen te bestuderen, waaronder de hersenen, nieren en lever. We hebben deze techniek gebruikt voor gebruik tijdens PMP, waardoor we een alternatief modelsysteem hebben dat, voor zover we weten, het eerste model is dat de PMP-tumormicro-omgeving in een semi-intact preparaat onderzoekt. In combinatie met 3D-patiënt-afgeleide organoïden en explantculturen biedt deze techniek een robuust en flexibel platform om de werkzaamheid van de behandeling snel te beoordelen en onmiddellijke vertaling van nieuwe therapieën van bank naar bed mogelijk te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs willen Kersi Pestonjamasp van de Moores Cancer Center imaging core facility bedanken voor hulp bij de microscopen UCSD Specialized Cancer Support Center P30 grant 2P30CA023100. Dit werk werd bovendien ondersteund door een JoVE-publicatiebeurs (JRW), evenals gulle giften uit de nalatenschap van Elisabeth en Ad Creemers, de Euske Family Foundation, het Gastrointestinal Cancer Research Fund en het Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| 100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| ATPγS | Tocris | 4080 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
| CD11b | Biolegend | 101228 | |
| CD206 | Biolegend | 321140 | |
| CD3 | Biolegend | 555333 | |
| CD4 | Biolegend | 357410 | |
| CD45 | Biolegend | 304006 | |
| CD8 | Biolegend | 344721 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
| Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
| Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
| Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
| LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
| Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
| Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |
References
- Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J.
- Votanopoulos, K. I., et al. Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study. Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Misra, S., et al. Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 2133 (2019).
- Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture. Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).
- Seidman, J. D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases. The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).
- Mizuta, Y., et al. Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas. Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).
- Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review. Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).
- Fleten, K. G., et al. Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models. Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).
- Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment. Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Carr, N. J. New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy. Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).
- Votanopoulos, K. I., et al. Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy. Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).
- Weitz, J., et al. An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape. Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).
