Summary
يصف هذا البروتوكول إعداد العينة المفصلة والمنخفضة المدخلات لتسلسل النواة الواحدة، بما في ذلك تشريح العقد العنقية والنجمية المتفوقة للفأر، وتفكك الخلايا، والحفظ بالتبريد، وعزل النواة، والترميز الشريطي للوسوم.
Abstract
الجهاز العصبي اللاإرادي القلبي أمر بالغ الأهمية في التحكم في وظيفة القلب ، مثل معدل ضربات القلب وانقباض القلب ، وينقسم إلى فروع ودية وغير ودية. عادة ، هناك توازن بين هذين الفرعين للحفاظ على التوازن. ومع ذلك ، فإن حالات أمراض القلب مثل احتشاء عضلة القلب وفشل القلب وارتفاع ضغط الدم يمكن أن تحفز على إعادة تشكيل الخلايا المشاركة في تعصيب القلب ، والذي يرتبط بنتيجة سريرية ضارة.
على الرغم من وجود كميات هائلة من البيانات للبنية النسيجية ووظيفة الجهاز العصبي اللاإرادي القلبي ، إلا أن بنيته البيولوجية الجزيئية في الصحة والمرض لا تزال غامضة في العديد من الجوانب. التقنيات الجديدة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) تبشر بالتوصيف الجيني للأنسجة بدقة خلية واحدة. ومع ذلك ، فإن الحجم الكبير نسبيا للخلايا العصبية قد يعيق الاستخدام الموحد لهذه التقنيات. هنا ، يستغل هذا البروتوكول تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة القائم على القطيرات (snRNA-seq) ، وهي طريقة لتوصيف البنية البيولوجية للخلايا العصبية الودية القلبية في الصحة والمرض. تم إثبات نهج تدريجي لأداء snRNA-seq من عنق الرحم العلوي الثنائي (SCG) والعقد النجمية (StG) التي تم تشريحها من الفئران البالغة.
تتيح هذه الطريقة الحفاظ على العينات على المدى الطويل ، والحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي المناسبة عندما لا يمكن جمع عينات من أفراد / تجارب متعددة في وقت واحد خلال فترة زمنية قصيرة. يتيح الترميز الشريطي للنوى باستخدام علامات التصنيف oligos (HTOs) إزالة الإرسال المتعدد وتتبع العينات العقدية المميزة بعد التسلسل. كشفت التحليلات اللاحقة عن نجاح التقاط النوى للخلايا العصبية والدبقية الساتلية والبطانية للعقد الودية، كما تم التحقق من صحتها بواسطة snRNA-seq. باختصار ، يوفر هذا البروتوكول نهجا تدريجيا ل snRNA-seq من العقد القلبية الخارجية الودية ، وهي طريقة لديها القدرة على التطبيق على نطاق أوسع في دراسات تعصيب الأعضاء والأنسجة الأخرى.
Introduction
الجهاز العصبي اللاإرادي (ANS) هو جزء حاسم من الجهاز العصبي المحيطي الذي يحافظ على توازن الجسم ، بما في ذلك التكيف مع الظروف البيئية وعلم الأمراض1. وهي تشارك في تنظيم أنظمة الأعضاء المتعددة في جميع أنحاء الجسم مثل أنظمة القلب والأوعية الدموية والجهاز التنفسي والجهاز الهضمي والغدد الصماء. ينقسم ANS إلى فروع متعاطفة ومتماسكة. فروع العمود الفقري للجهاز العصبي الودي المشبك في العقد من السلسلة الودية ، وتقع ثنائيا في وضع شبه الفقرية. العقد العنقية والصدرية الثنائية ، وخاصة StG ، هي مكونات مهمة تشارك في التعصيب الودي القلبي. في الحالات المرضية ، مثل نقص تروية القلب ، يمكن أن تحدث إعادة تشكيل الخلايا العصبية ، مما يؤدي إلى فرط الحركة الودي2. وقد ثبت إعادة تشكيل الخلايا العصبية في دراسات نسيجية متعددة في البشر والعديد من أنواع الحيوانات الأخرى3،4،5،6. لا يوجد حاليا توصيف بيولوجي مفصل لإعادة تشكيل الخلايا العصبية الناجمة عن نقص تروية القلب في العقد الودية القلبية ، ولم يتم تحديد الخصائص البيولوجية الأساسية لأنواع الخلايا العصبية المتخصصة أو الأنواع الفرعية داخل الجهاز العصبي الودي القلبي (SNS) بشكل كامل حتى الآن في الصحة والمرض7.
وقد فتحت التقنيات الجديدة، مثل scRNA-seq، بوابات للتوصيف الجيني للأنسجة الصغيرة على مستوى خلية واحدة 8,9. ومع ذلك ، فإن الحجم الكبير نسبيا للخلايا العصبية قد يعيق الاستخدام الأمثل لهذه التقنيات أحادية الخلية في البشر10. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب تسلسل الخلية الواحدة إنتاجية عالية للخلايا لاستعادة عدد كاف من الخلايا بسبب الخسارة العالية في عملية التسلسل. قد يكون هذا تحديا عند دراسة الأنسجة الصغيرة التي يصعب التقاطها في جلسة واحدة وتتطلب عينات متعددة لإدخال خلايا مفردة كافية للتسلسل. تسمح تقنية snRNA-seq القائمة على القطيرات التي تم تطويرها مؤخرا (أي منصة 10x Chromium) بدراسة الاختلافات البيولوجية بين النوى المفردة11,12. snRNA-seq يحمل ميزة على scRNA-seq للخلايا الكبيرة (>30 ميكرومتر) ، والتي قد لا يتم التقاطها في حبة الجل في المستحلبات (GEMs) ، بالإضافة إلى تحسين التوافق مع التفكك الواسع النطاق و / أو الحفظ المطول13،14،15.
عدم التجانس ، وعدد الخلايا العصبية ، والخلايا الأخرى المخصب في SNS القلب هي جوانب مهمة لتوصيف ANS في الحالات الصحية والمرضية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التعصيب الخاص بالعضو أو المنطقة من قبل كل عقدة متعاطفة يساهم في تعقيد SNS. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن العقد العنقية والنجمية والصدرية للسلسلة الودية تعصب مناطق مختلفة من القلب16. لذلك ، من الضروري إجراء تحليل أحادي النواة للخلايا العقدية المشتقة من العقد الفردية لدراسة بنيتها البيولوجية.
يسمح snRNA-seq القائم على القطيرات بتنميط التعبير على نطاق النسخ لمجموعة من آلاف الخلايا من عينات متعددة في وقت واحد بتكاليف أقل من منصات التسلسل القائمة على اللوحات. يمكن هذا النهج snRNA-seq القائم على القطيرات من أن يكون أكثر ملاءمة لتصنيف النمط الظاهري الخلوي وتحديد السكان الفرعيين الجدد للخلايا داخل SCG و StG. والجدير بالذكر أن هذا البروتوكول يوفر نهجا مرحليا موجزا لتحديد وعزل وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة للعقد القلبية الخارجية الودية ، وهي طريقة لديها القدرة على التطبيق على نطاق واسع في دراسات توصيف العقد التي تعصب الأعضاء والأنسجة الأخرى ذات الصلة في الصحة والمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يصف هذا البروتوكول جميع الخطوات المطلوبة ل snRNA-seq من العقد العنقية الفئرانية و / أو عنق الرحم (النجمي). تم استخدام الفئران C57BL/6J من الإناث والذكور (15 أسبوعا ، n = 2 لكل جنس). تم استخدام ماوس Wnt1-Cre ؛ mT / mG إضافي لتصور العقد لأغراض التشريح17,18. تم إنشاء هذا الماوس الإضافي عن طريق تهجين فأر B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J وماوس B6.129(Cg)-GT(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J. تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر الذي نشرته المعاهد الوطنية للصحة ووافقت عليه لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة لايدن (رقم الترخيص AVD1160020185325 ، لايدن ، هولندا). راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل تتعلق بجميع المواد والمعدات والبرامج والحيوانات المستخدمة في البروتوكول.
1. التحضيرات
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في خزانة تدفق زراعة الخلايا.
- نظف الملقط والمقص عن طريق غمر الأدوات في 70٪ من الإيثانول لمدة 20 دقيقة.
- تحضير وسط العقدة يتكون من وسط عصبي قاعدي مكمل ب B-27 plus (1x) ، L-glutamine (2 mM) ، و 1٪ مضاد حيوي مضاد للفطريات. قم بتسخين وسط العقدة في درجة حرارة الغرفة.
- تحضير محلول الهضم: 0.25٪ Trypsin-EDTA (1: 1) و 1400 U / mL الكولاجيناز من النوع 2 المذاب في وسط العقدة.
- قم بإعداد مخزن مؤقت جديد وبارد (4 درجات مئوية) لغسل الخلايا (0.4٪ ألبومين مصل البقر [BSA]) ومخزن مؤقت للتحلل (10 mM Tris-HCl و 10 mM NaCl و 3 mM MgCl2 و 0.1٪ منظف غير أيوني ، 40 U / mL RNAse في ماء خال من النوكليز) لعزل النواة.
- تحضير المخزن المؤقت لغسل النواة (1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات [PBS] مع 2.0٪ BSA ومثبط RNase 0.2U / μL).
- تحضير مخزن ST العازل للتلطيخ (ST-SB) (10 mM Tris-HCl ، 146 mM NaCl ، 21 mM MgCl 2 ، 1 mM CaCl 2 ،2٪ BSA ، 0.02٪ Tween-20 في الماء الخالي من النوكليز).
2. تشريح العقد العنقية العليا للفأر البالغ (SCG)
- القتل الرحيم للفئران وإبقائها على الجليد.
ملاحظة: في الدراسة الحالية ، تم قتل ما مجموعه 4 فئران C57BL6 / J عن طريق الاختناق CO2 . بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الأيزوفلوران متبوعا بالتفريغ عندما تحتاج كمية كبيرة من الدم إلى جمعها لأغراض الدراسة الأخرى. - قم بإصلاح الماوس على لوحة تشريح بدبابيس وقم بإخماده بنسبة 70٪ من الإيثانول لتقليل تشتت الفراء (الحلاقة ليست ضرورية).
- تحت المجهر المجسم، افتح جلد منطقة الرقبة عن طريق إجراء قطع خط الوسط بالمقص، وحرك الغدد تحت الفك السفلي جانبا، وأزل العضلة القصية لكشف وتحديد موقع الشريان السباتي المشترك وتشعبه (الشكل 1A، B، انظر السهم).
- تشريح تشعب الشريان السباتي الأيمن والأيسر والأنسجة المرتبطة به. انقل كل قطعة من الأنسجة المشوهة إلى طبق بتري منفصل بحجم 3.5 سم يحتوي على PBS بارد.
- ابحث عن SCG المرفق بالتشعب السباتي. قم بتنظيف SCG بشكل أكبر عن طريق إزالة الشريان والأنسجة الأخرى المرفقة في طبق بتري (الشكل 1E).
3. تشريح العقد النجمية للفأر البالغ (StG)
- لتشريح StG ، قم بعمل قطع خط الوسط في البطن ، يليه فتح الحجاب الحاجز والجدار الصدري البطني.
- إزالة القلب والرئتين لفضح الصدر الظهري. ابحث عن اليسار واليمين StG الأمامي الجانبي للعضلة القولونية الطويلة (MCL) على مستوى الضلع الأول (الشكل 1C ، D ، المشار إليه بخطوط متقطعة).
- تشريح كل من اليسار واليمين StG مع ملقط ونقلها بشكل منفصل إلى أطباق بتري 3.5 سم تحتوي على PBS الباردة (الشكل 1F).
4. عزل الخلايا العقدية للفئران والحفاظ عليها بالتبريد
ويرد في الشكل 2 موجز للخطوات من 4 إلى 6.
- انقل بعناية جميع SCG و StG الفردية لفصل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل باستخدام الملقط.
ملاحظة: لا تستخدم أطراف الماصة لنقل العقد لأن العقد عرضة للالتصاق بجدار أطراف الماصة البلاستيكية. - أضف 500 ميكرولتر من محلول التربسين-EDTA بنسبة 0.25٪ إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق واحتضنه في حمام مائي يهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى تسهيل عملية الهضم وإطلاق الخلايا فيما بعد في محلول الكولاجيناز من النوع 2. - قم بإعداد أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من وسط العقدة لكل عينة. اسمح للعقد بالاستقرار في الجزء السفلي من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. جمع supernatant ، الذي يحتوي على عدد قليل جدا من الخلايا العقدية ، ونقل supernatant إلى أنابيب 15 مل المعدة ، ووضع علامة على كل أنبوب. بدلا من ذلك ، لتوفير بعض الوقت ، قم بشفط التربسين-EDTA الخارق دون جمع حيث يمكن اكتشاف عدد قليل جدا من الخلايا المنفصلة فيه.
ملاحظة: يمكن ترك كمية صغيرة من محلول التربسين-EDTA (~ 10-30 ميكرولتر) في أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق لتجنب إزالة العقد. تجنب السحب في هذه الخطوة لأنه قد يتلف العقد ويؤدي إلى انخفاض إنتاج الخلايا العقدية بعد ذلك. - أضف 500 ميكرولتر من محلول الكولاجيناز من النوع 2 إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق واحتضنه في حمام مائي مهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 35-40 دقيقة. حاول إعادة تعليق العقدة بعد 35 دقيقة ؛ إذا كانت العقدة لا تزال سليمة ولا تنفصل ، فقم بإطالة وقت الحضانة أو زيادة تركيز محلول الكولاجيناز من النوع 2 حسب الضرورة.
ملاحظة: يمكن أن يختلف وقت الحضانة اعتمادا على حجم العقدة. - أعد تعليق العقد في محلول الكولاجيناز عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ~ 10 مرات أو حتى لا يتم اكتشاف كتل الأنسجة.
- انقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل المستخدم سابقا والذي يحتوي على وسط زراعة العقد وتعليق التربسين-EDTA من نفس العقدة. قم بتدوير تعليق الخلية باستخدام جهاز طرد مركزي دوار دلو متأرجح لمدة 10 دقائق و 300 × جم في درجة حرارة الغرفة. تخلص بعناية من الخلية الفائقة.
ملاحظة: نظرا لأن الخلايا العقدية منفصلة عن عقدة واحدة ، فقد تكون حبيبات الخلايا صغيرة جدا بحيث لا يمكن اكتشافها بالعين. يمكن ترك كمية صغيرة من supernatant في الأنبوب لتجنب الإزالة العرضية لحبيبات الخلية. - أعد تعليق الخلايا العقدية في 270 ميكرولتر من مصل البقر الجنيني (FBS ، السموم الداخلية المنخفضة) وانقل كل تعليق خلية FBS إلى 1 مل من الكريوفيال.
- لحساب الخلايا ، امزج 5 ميكرولتر من تعليق الخلايا العقدية مع 5 ميكرولتر من صبغة تريبان الزرقاء بنسبة 0.4٪ وقم بتحميل الخليط في مقياس دمية. عد إجمالي أعداد الخلايا الحية تحت المجهر.
ملاحظة: عادة ما تكون صلاحية الخلية (عدد الخلايا الحية / إجمالي عدد الخلايا = قابلية البقاء) أعلى من 90٪ باستخدام بروتوكول التفكك هذا. عادة ما يقع عدد الخلايا الحية لعقدة واحدة (إما SCG أو StG) ضمن نطاق 9000-60000 خلية عندما يتم عزل العقدة من فأر يتراوح عمره بين 12 و 16 أسبوعا. - أضف 30 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى كل تعليق خلية FBS في الكريوفيالات ، واخلطها جيدا ، وانقل الكريوفيات إلى حاوية تجميد الخلية ، والتي يتم الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة. قم بتخزين الحاوية المحملة بالتبريد عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها، وانقل الحاويات المبردة إلى النيتروجين السائل في اليوم التالي للحفاظ عليها لفترة طويلة قبل التسلسل.
5. عزل النواة
ملاحظة: تم استخدام SCG الأيسر والأيمن المعزول من أربعة فئران (في المجموع 8 عينات) كمثال في عزل النواة التالية وإعداد التسلسل. احتفظ بكل شيء على الجليد أثناء الإجراء بأكمله. بسبب عدم رؤية كريات النواة الصغيرة ، يوصى بشدة باستخدام جهاز طرد مركزي مع دلاء متأرجحة لتسهيل إزالة supernatant طوال الإجراء بأكمله.
- تحضير أنابيب 15 مل مع مصفاة (30 ميكرومتر) في الأعلى وشطف المصفاة مع 1 مل من وسط العقدة.
- أخرج الكريوفيات من النيتروجين السائل وقم بإذابتها على الفور في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. عندما يتم ترك حبيبة صغيرة من الجليد في المبرد ، خذ الكريوفيالات من الحمام المائي.
- استعادة الخلايا العقدية عن طريق إسقاط 1 مل من وسط العقدة في كل تبريد أثناء الاهتزاز بعناية باليد. اختياري: لتقييم استرداد الخلية، امزج تعليق الخلية بعد الاسترداد وأخرج 5 ميكرولتر من تعليق الخلايا لحساب الخلايا الحية، كما هو موضح في الخطوة 4.8.
- قم بتحميل كل تعليق خلية عقدي على مصفاة منفصلة (يتم إعدادها في الخطوة 5.1) وشطف كل مصفاة ب 4-5 مل من وسط العقدة.
- قم بالطرد المركزي لتعليق الخلايا المتوترة لمدة 5 دقائق عند 300 × جم ، وقم بإزالة المادة الفائقة بعناية ، وأعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل الخلايا.
- انقل تعليق الخلية إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق منخفض الربط DNA/RNA 0.5 مل.
- الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة 45 ميكرولتر من السوبرناتانت دون لمس الجزء السفلي من الأنبوب لتجنب إزاحة حبيبات الخلية.
- أضف 45 ميكرولتر من Lysis Buffer المبرد وقم بماصته بلطف لأعلى ولأسفل باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر.
- احتضان الخلايا لمدة 8 دقائق على الجليد.
- أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل النواة الباردة إلى كل أنبوب. لا تختلط.
- جهاز طرد مركزي لتعليق النواة عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- إزالة 95 ميكرولتر من supernatant دون تعطيل بيليه النواة.
- أضف 45 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسل النواة المبردة إلى الكرية. اختياري: خذ 5 ميكرولتر من تعليق النواة ، واخلطها مع 5 ميكرولتر من 0.4٪ من أزرق التربان للعد ، وتحقق من جودة النوى تحت المجهر باستخدام مقياس الدم.
- جهاز طرد مركزي لتعليق النواة عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة السوبرناتانت دون لمس الجزء السفلي من الأنبوب لتجنب إزاحة حبيبات النواة.
6. الترميز الشريطي للنواة مع أوليجوس هاشتاغ (HTOs) وتعدد الإرسال
ملاحظة: تم تعديل خطوات تلطيخ HTO وتحسينها لوضع العلامات النووية على كميات منخفضة جدا من النوى (العقدية) وفقا للتطبيق السابق في الأنسجة القشرية بواسطة Gaublomme et al.15.
- أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت ST-SB إلى حبيبات النواة ، وقم بماصة بلطف 8-10 مرات حتى يتم إنعاش النوى بالكامل.
- أضف 5 ميكرولتر من كاشف حجب Fc لكل 50 ميكرولتر من مزيج ST-SB / nuclei واحتضنه لمدة 10 دقائق على الجليد.
- أضف 1 ميكرولتر (0.5 ميكروغرام) من الأجسام المضادة أحادية النواة لكل أنبوب من مزيج ST-SB/nuclei واحتضنها لمدة 30 دقيقة على الجليد.
ملاحظة: يؤدي وقت الحضانة الأقصر إلى انخفاض كفاءة وضع علامات التصنيف ، كما هو موضح في النتائج التمثيلية. - أضف 100 ميكرولتر من ST-SB إلى كل أنبوب. لا تختلط.
- جهاز الطرد المركزي لتعليق النواة لمدة 5 دقائق ، 600 × جم عند 4 درجات مئوية.
- إزالة 145 ميكرولتر من supernatant دون تعطيل بيليه النواة.
- كرر الخطوتين 6.4 و6.5. قم بإزالة السوبرناتانت قدر الإمكان دون لمس الجزء السفلي من الأنبوب لتجنب إزاحة حبيبات النواة.
- أعد تعليق حبيبات النواة في 50 ميكرولتر من ST-SB ، واخلط النوى برفق.
- خذ 5 ميكرولتر من تعليق النواة واخلطها مع 5 ميكرولتر من 0.4٪ من التربان الأزرق لحساب النوى تحت المجهر. انظر الشكل 3A للحصول على صورة تمثيلية للنوى الممزوجة باللون الأزرق التريبان والمحملة في مقياس الدم.
- جهاز الطرد المركزي لتعليق النواة لمدة 5 دقائق عند 600 × جم عند 4 درجات مئوية.
- أعد تعليق النوى في ST-SB لتحقيق تركيز نواة مستهدف يتراوح بين 1000 و 3000 نواة / ميكرولتر لكل عينة وفقا لعدد النواة المقابلة.
- تجميع العينات لتحقيق العدد المطلوب من الخلايا.
ملاحظة: على سبيل المثال، في هذه التجربة، تم تجميع 8 عينات بالتساوي لتحقيق ما مجموعه 25000 نواة للانتقال فورا إلى 10x Genomics Chromium و snRNA-seq بعد ذلك. يقع عدد النواة عادة في نطاق 6000-40000 خلية عندما يتم عزل العقدة من فأر يتراوح عمره بين 12 و 16 أسبوعا. يمكن التقاط حوالي نصف إجمالي النوى المحملة فقط بواسطة snRNA-seq القائم على القطيرات. على سبيل المثال، تم إعداد خليط من 25000 نواة لضمان التقاط 10000 نواة، وهو أمر ضروري لمزيد من إعداد المكتبة وتسلسلها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحليل مراقبة الجودة لإعداد مكتبة cDNA أحادية النواة و snRNA-seq
تصف النتائج التمثيلية نتائج تسلسل 10000 نواة تم التقاطها في تجمع واحد مع مكتبة 25000 قراءة / نواة للتعبير الجيني ومكتبة وسم 5000 قراءة / نواة. يوضح الشكل 3B نتائج مراقبة الجودة ل1st strand cDNA ، ومكتبة التعبير الجيني (GEX) ، ومكتبة HTO ، والتي تم فحصها باستخدام Bioanalyzer. ومن المتوقع أن تكون الحمض النووي الريبوزي المشتق من HTO أصغر من 180 نقطة أساس، في حين أن الحمض النووي الريبي المشتق من الحمض النووي الريبوزي المرسال أكبر من 300 نقطة أساس. يمكن الكشف عن مكتبة GEX عالية الجودة كذروة واسعة من 300 إلى 1000 نقطة أساس ، ويتم الكشف عن مكتبة HTO كذروة محددة تبلغ 194 نقطة أساس. واستخدمت الحزمة19 من سورات آر في وقت لاحق لمراقبة الجودة والتحليلات النهائية.
تم إجراء إزالة الإرسال المتعدد لبيانات snRNA-seq من خلال تحديد HTOs باستخدام استراتيجية Seurat المدمجة لإزالة الإرسال المتعدد. تم تصور قدرة إلغاء الإرسال المتعدد لكل HTO لأول مرة باستخدام ملفات تعبير HTO (الشكل التكميلي S1). في الخريطة الحرارية للشكل 4A ، يتم الكشف عن المفردات كنوى ذات تعبير HTO محدد ، في حين تظهر الثنائيات والسلبيات تعبيرا غير محدد عن HTOs متعددة أو معدومة. تجدر الإشارة إلى أنه تم اكتشاف ما يقرب من 33٪ من النوى على أنها سلبية باستخدام نهج حضانة الأجسام المضادة HTO لمدة 10 دقائق. كشف إطالة وقت الحضانة (الخطوة 6.3) من 10 دقائق إلى 30 دقيقة في تجربة لاحقة عن انخفاض ملحوظ في النوى ذات العلامات السلبية (الشكل التكميلي S2). تشير هذه النتائج إلى أن إطالة وقت حضانة الأجسام المضادة قد يحسن كفاءة الهاشتاغ.
توضح مخططات الكمان في الشكل 4B-D عدد الجينات (nFeature_RNA) ، وعدد المعرفات الجزيئية الفريدة (UMI) (nCount_RNA) ، والنسبة المئوية لتعداد الميتوكوندريا (percent.mt) داخل مجموعة بيانات snRNA-seq لتحديد القيم المتطرفة والنوى منخفضة الجودة. ولم تدرج النوى في التحليل النهائي إلا عندما استوفيت المعايير التالية: أ) nFeature_RNA > 500 و nCount_RNA < 20000؛ و (ب) 20000 نواة؛ و (ج) 20000 نواة؛ و (ج) 20000 نواة و 5000 نواة و 50000 نواة؛ و (ج) 20000 نواة و 20000 ب) percent.mt < 5٪ ؛ ج) أظهرت النواة الفردية تعبيرا واضحا عن HTO واحد. تم تطبيع تعداد التعبير الجيني باستخدام الطريقة الافتراضية في Seurat: تم اكتشاف 875 (2.71٪) من الجينات كجينات متغيرة للغاية (الشكل 4E). تم تحجيم snRNA-seq GEX ، وتم تنفيذه واستخدم مخطط الكوع لتقييم إدراج المكونات الرئيسية التي سيتم استخدامها في التحليلات النهائية (الشكل 4F). في المجموع ، تم تضمين 18 جهاز كمبيوتر. تم إجراء التجميع بدقة 0.4.
تم تجميع النوى ، وتم إجراء تقليل الأبعاد (UMAP) لتصور المجموعات الفردية ال 12 (الشكل 5A). يتراوح متوسط عدد الجينات الخام لكل مجموعة بين 991.5 و 4,586 (الشكل التكميلي S3A ، B). يكشف تصور تقسيم الأجسام المضادة HTO داخل UMAP عن توزيع واضح للعقد ، مما يشير إلى أن جميع المجموعات يتم عرضها في كل عقدة (الشكل 5B). للتحقق من دقة فصل عينات HTO ، تم تقييم التعبير عن نسخة X غير النشطة المحددة (Xist ، المعبر عنها في كروموسوم X الأنثوي غير النشط) لتحديد عينات الذكور وعينات الإناث (الشكل 5C). كان تعبير Xist متوافقا مع وسم الهاشتاج ، مما يدل على أن العينات المصنفة HTO 1-4 كانت عينات إناث ، وكانت عينات HTO 5-8 المصنفة عينات من الذكور. هذا يشير إلى أن وضع علامات HTO المنسقة محدد للغاية.
لمزيد من التحقق من جودة ودقة بيانات التسلسل بالطريقة الحالية ، تم فحص بعض النصوص الرئيسية للخلايا العصبية المتعاطفة لأول مرة. أظهرت النتائج وجود خلايا عصبية متعاطفة تعبر بشكل كبير عن Th و Dbh و Snap25 في المجموعتين 5 و 7 (الشكل 5D-F). تم الكشف عن الخلايا الدبقية الساتلية بتعبير S100b في المجموعات 0-3 (الشكل 5G)20. تم الكشف عن الخلايا البطانية في المجموعة 4 مع تعبير عال عن Pecam1 (الشكل 5H) والخلايا اللحمية في المجموعة 8 مع تعبير عال عن Acta2 (الشكل 5I). تدعم هذه النتائج التقاط النوى الناجحة للخلايا العصبية والدبقية الساتلية والبطانية واللحمية للعقدة الودية باستخدام snRNA-seq.
الشكل 1: تشريح العقد العنقية العليا للفأر البالغ والعقد النجمية . (أ) صورة برايتفيلد لموقع SCG. (ب) لتسهيل التصور ، تم استخدام ماوس Wnt1Cre ؛ mT / mG. تشير العلامات النجمية إلى SCG (eGFP+) ، وتشير رؤوس الأسهم إلى تشعب الشريان السباتي. اللوحة اليسرى ، صورة تباين الطور ؛ اللوحة اليمنى ، صورة الفلورسنت. (ج) تشير صورة برايتفيلد لموقع StG. (D) العلامات النجمية إلى StG (eGFP+) ، وتشير الخطوط المتقطعة إلى MCL. اللوحة اليسرى ، صورة تباين الطور ؛ اللوحة اليمنى ، صورة الفلورسنت. (ه) يتم نقل العقد المشوهة إلى طبق بتري بشكل منفصل لمزيد من التنظيف تحت المجهر المجسم. (و) اللوحة اليسرى، وهي عبارة عن SCG تشريح مع الشريان السباتي الذي لا يزال متصلا. يشير المخطط التفصيلي المتقطع إلى SCG. اللوحة اليمنى ، StG تشريحها وتنظيفها لها شكل مثلث مقلوب ، كما هو موضح في المخطط التفصيلي المتقطع. شريط المقياس = 1000 ميكرومتر. الاختصارات: SCG = العقد العنقية العليا; StG = العقد النجمية; MCL = العضلات القولونية طويلة; eGFP = بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: سير عمل إعداد العينات وتعدد الإرسال القائم على تلطيخ علامات التصنيف ل snRNA-seq. يصور المخطط الانسيابي الخطوات من تفكك الخلايا العقدية (البرتقالية) ، وعزل النواة (الأزرق) ، وتلطيخ الأجسام المضادة و تعدد الإرسال (الأخضر) التي يتم تنفيذها ل snRNA-seq. الاختصارات: FBS = مصل البقر الجنيني. ST-SB = مخزن مؤقت تلطيخ ST ؛ snRNA-seq = تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مراقبة جودة عزل النواة وإعداد مكتبة التعبير الجيني . (أ) صورة تباين الطور للنوى الملطخة ب HTO. يشار إلى النوى بالأسهم. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (B) نتائج المحلل الحيوي ل 1st strand cDNA (أعلى) ، مكتبة GEX (وسط) ، ومكتبة HTO (أسفل). الاختصارات: GEX = التعبير الجيني; HTO = هاشتاغ أوليغو. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مراقبة جودة كفاءة وضع العلامات على علامة الهاشتاج oligo ومراقبة جودة snRNA-seq. (A) خريطة حرارية لتلطيخ HTO تم تحقيقها مع وقت حضانة قدره 10 دقائق مع الأجسام المضادة للوسم. (ب-د) مخططات الكمان لمقاييس مراقبة الجودة التي تصور عدد الجينات (nFeature_RNA ، B) ؛ عدد UMIs (nCount_RNA ، C) ؛ النسبة المئوية لعدد الميتوكوندريا (percent.mt ، D). (ه) من إجمالي 32,285 جينا متسلسلا، تم تحديد 875 جينا (2.71٪) كسمات متغيرة للغاية كما هو موضح في مخطط التشتت. (و) مخطط الكوع للحواسيب لتحديد إدراج الإشارة الحقيقية المستخدمة في التجميع. الاختصارات: snRNA-seq = تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة. HTO = هاشتاغ أوليغو; أجهزة الكمبيوتر = المكونات الرئيسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: النتائج التمثيلية لتحليل مخطط snRNA-seq. (A) UMAP لمجموعة بيانات snRNA-seq المجمعة. (ب) مخطط UMAP الذي يصور توزيع عينات HTO المجمعة. (ج) مخطط الكمان للتحقق من صحة العينات الأنثوية (تعبير Xist العالي) بعد إزالة الإرسال المتعدد. (مد إلى ط) مخططات UMAP التي تعرض جينات علامات محددة؛ تعبر المجموعات بشكل كبير عن الجينات المقابلة التي يشار إليها داخل الدوائر الحمراء: D-F ، الخلايا العصبية المتعاطفة (Th ، Dbh ، Snap25) ؛ (ز) الخلايا الدبقية الساتلية (S100b)؛ (ح) الخلايا البطانية (Pecam1)؛ (I) الخلايا اللحمية (Acta2). الاختصارات: snRNA-seq = تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة. HTO = هاشتاغ أوليغو; UMAP = تقريب وإسقاط موحد متعدد الاتساع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي S1: مقاييس مراقبة الجودة لنتيجة تسلسل أحادية النواة تمثيلية. ملامح تعبير HTO للعينات الفردية التي تصور قدرة إزالة الإرسال المتعدد للأجسام المضادة المستخدمة في الهاشتاغ. اختصار: HTO = هاشتاغ أوليغو. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: خريطة حرارية لتعبير HTO للعينات اللاحقة المحتضنة بالأجسام المضادة HTO لمدة 30 دقيقة. تظهر مقارنة عدد النوى ذات العلامات السلبية بعد إزالة الإرسال المتعدد HTO مع الشكل 4A تحسنا ملحوظا في وسم النواة بعد إطالة وقت حضانة الأجسام المضادة. اختصار: HTO = هاشتاغ أوليغو. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S3: الوسيط والكميات من التعبير الجيني لكل عنقود. (أ) متوسط التعبير الجيني الخام غير الصفري لكل مجموعة. (ب) الإحصاءات الوصفية للتعبير الجيني الخام غير الصفري لكل مجموعة. Q1: 25 النسبة المئوية ، Q3: 75النسبة المئوية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ، يتم وصف بروتوكول مفصل يركز على i) تشريح العقد الودية العنقية والنجمية الفائقة للفئران البالغة ، ii) عزل الخلايا العقدية والحفاظ عليها بالتبريد ، iii) عزل النواة ، و iv) ترميز النواة الشريطية مع وضع علامات HTO لأغراض الإرسال المتعدد و snRNA-seq.
باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن بسهولة الحصول على الخلايا العقدية الودية عن طريق فصل العقد الفردية باستخدام التربسين والكولاجيناز الشائع الاستخدام. كما يتم تحقيق الحفاظ على الخلايا العقدية المعزولة على المدى الطويل بسهولة عن طريق تجميد الخلايا في FBS مع استكمال 10٪ DMSO ، والتي أظهرت جودة عالية من الانتعاش بعد ذوبان الجليد. وعلاوة على ذلك، وبالمقارنة مع تسلسل الحمض النووي الريبي التقليدي أحادي الخلية، فإن استخدام snRNA-seq القائم على القطيرات من العقد الودية الودية للفئران المفردة جنبا إلى جنب مع تطبيق الترميز الشريطي للنواة القائمة على تلطيخ HTO له المزايا التالية: أ) يمكن الحفاظ على العينات لفترة طويلة حتى تصبح جميع العينات جاهزة لمزيد من عزل النواة؛ و (ب) يمكن الحفاظ على العينات لفترة طويلة حتى تصبح جميع العينات جاهزة لمزيد من عزل النواة؛ و (ب) يمكن الحفاظ على العينات لفترة طويلة حتى تصبح جميع العينات جاهزة لمزيد من عزل النواة؛ و (ب) يمكن الحفاظ على العينات لفترة طويلة حتى تصبح جميع العينات جاهزة لمزيد من عزل النواة؛ و (ب) يمكن الحفاظ على العينات لفترة طويلة حتى تصبح جميع العينات جاهزة لمزيد من عزل النواة؛ و (ب) يمكن الحفاظ على العينات لفترة طويلة حتى تصبح جميع العينات جاهزة لمزيد من عزل النواة؛ و (ب) يمكن الحفاظ على العينات لفترة طويلة حتى تصبح جميع العينات جاهزة لمزيد من عزل النواة؛ و (ب) يمكن الحفاظ على العينات لفترة طويلة حتى تصبح جميع العينات جاهزة لمزيد من عزل ب) يمكن تجميع النوى ذات النوعية الجيدة المعزولة من العقد المتعددة صغيرة الحجم معا للتسلسل دون تأثير دفعي ناتج عن إعداد عينة منفصلة ؛ ج) القدرة على تتبع الأصل العقدي المميز بعد التسلسل باستخدام الباركود النواة ؛ و iv) فعالية التكلفة ، حيث لا يلزم سوى إعداد مكتبة واحدة. الأهم من ذلك ، أن بروتوكول العزل وزراعة الخلايا الموصوف يوفر طريقة موحدة واحدة لكل من العقد العنقية الفئرانية والنجمية ويحتمل أن ينطبق على العقد الأخرى ، مثل العقد الجذرية الظهرية والأنواع الأخرى ، على سبيل المثال ، العقد البشرية.
واحدة من المزايا الرئيسية ل scRNA-seq هي القدرة على تحديد أنواع الخلايا (الجديدة) والكشف عن مجموعات الخلايا النادرة التي لا يمكن اكتشافها بواسطة الحمض النووي الريبي السائب. تسهل منصة scRNA-seq القائمة على القطيرات التقاط المزيد من الخلايا. وبالتالي يمكن أن يوفر رؤية مجمعة لأنواع الخلايا (الفرعية) وعدم التجانس النسخي لمجموعة كبيرة من الخلايا مقارنة بمنصة تسلسل قائمة على اللوحات. ومع ذلك ، فإن المنصة القائمة على القطيرات (على سبيل المثال ، 10x Chromium) ليست مناسبة للخلايا التي يزيد حجمها عن 50 ميكرومتر ، مما يحد من تطبيقها في الخلايا الكبيرة مثل الخلايا العصبية البشرية (~ 100 ميكرومتر). إن توفر تقنية snRNA-seq يتغلب على هذا العيب بسبب صغر حجم النواة. علاوة على ذلك ، فإن snRNA-seq هي طريقة مفيدة لدراسات التعبير الجيني للخلايا المترابطة للغاية ومنخفضة الغلة مثل الخلايا العصبية والأنسجة المجمدة.
على الرغم من أنه من الممكن عزل النوى مباشرة من الأنسجة دون تفكك الخلايا مسبقا ، إلا أنه كان من المفيد أن يتخذ العائد طريقة عزل النواة المكونة من خطوتين والتي تقوم أولا بفصل العقدة إلى خلايا مفردة (والتي يمكن حفظها في النيتروجين السائل) تليها عزل النواة. بسبب صغر حجم العقدة الودية للفأر ، وجد أنه تم الحصول على المزيد من النوى باستخدام طريقة عزل النواة المكونة من خطوتين أكثر من نهج عزل النواة من خطوة واحدة. يشير فحص جودة الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين والمكتبة وتحليلات التسلسل إلى جودة النوى / الحمض النووي الريبي الجيدة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحسين الخدمات اللوجستية ، حيث يمكن جمع العينات وتخزينها في نقاط زمنية مختلفة قبل التسلسل الجماعي. وكشف تحليل النواة الواحدة أيضا عن التعافي الناجح والتقاط الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، مما يشير إلى أن نهج عزل النواة الموصوف المكون من خطوتين قد يكون أكثر ملاءمة للتطبيق في الأنسجة الصغيرة.
ميزة أخرى لهذا البروتوكول هي تعدد الإرسال باستخدام الأجسام المضادة المشفرة21. العقدة الودية للفأر هي نسيج صغير (متوسط الحجم 0.1 مم3) ، والعدد المنخفض من الخلايا المشتقة من عقدة فردية غير كاف للتسلسل القائم على القطيرات في حد ذاته. ومع ذلك ، فإن تجميع عدة عقد من الفئران المختلفة أو العقد المختلفة لنفس الفأر سيؤدي إلى فقدان معلومات الفأر الفردية أو معلومات العقدة الفردية. كحل ، فإن خطوة تلطيخ HTO سهلة الأداء وتمكن من وضع العلامات المشفرة على النوى المشتقة من الفئران المختلفة أو العقد المختلفة قبل تجميع النواة. يتم التحقق من دقة إزالة الإرسال المتعدد HTO في هذا البروتوكول من خلال تعبير Xist المطابق في مجموعات النوى الأنثوية المعروفة. وبالتالي ، فإن تعدد النواة بالأجسام المضادة المشفرة بالباركود يقلل من تأثيرات الدفعات ويقلل من تكلفة التسلسل.
قد يكون أحد القيود المحتملة على snRNAseq هو أنه قد تكون هناك اختلافات بين تكوين الحمض النووي الريبي في النواة والسيتوبلازم بسبب الوجود الطبيعي للنسخ الوليدة في النواة ، المرتبطة بالاستجابة المبكرة للأنشطة العصبية22,23. قد تختلف النواة والسيتوبلازم أيضا في النسخ اعتمادا على حالة دورة الخلية24. تم اكتشاف عدد أقل من النسخ في نواة فردية (~ 7000 جين) مقارنة بالخلية (~ 11000 جين)14. لذلك ، قد يؤدي scRNA-seq و snRNA-seq إلى نتائج مختلفة على مستوى النسخة. ومع ذلك ، أظهرت المقارنة بين scRNA-seq و snRNA-seq قدرة مماثلة على التمييز بين أنواع الخلايا العصبية لأنسجة المخ14. لتحسين التمييز بين أنواع الخلايا المتشابهة للغاية أو الأنواع الفرعية بواسطة snRNA-seq ، قد تكون هناك حاجة إلى المزيد من النوى للتعويض عن انخفاض قدرة الكشف عن الجينات مقارنة ب scRNA-seq. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن دقة إزالة الإرسال المتعدد HTO كافية ، إلا أن فقدان بعض البيانات أمر لا مفر منه حيث لا تظهر جميع النوى خصوصية HTO. يمكن أن يؤدي المزيد من التحسين لحضانة الأجسام المضادة إلى تقليل عدد النوى ذات التعبير المزدوج أو السلبي عن HTOs.
يوفر هذا البروتوكول مجتمعا الإجراء التجريبي لتسلسل النوى العصبية من العقد الودية عن طريق سير عمل سهل المتابعة بدءا من عزل العقدة إلى إعداد النوى ذات المدخلات المنخفضة للخلايا ، تليها تسمية النواة القائمة على تلطيخ HTO ل snRNA-seq. يوفر البروتوكول نظرة عامة مفصلة على جميع الخطوات الرئيسية التي يمكن تنفيذها بسهولة وتطبيقها على العقد المختلفة في الفئران والأنواع الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
كلويت (قسم علم الوراثة البشرية، LUMC، لايدن، هولندا) على مساعدتها في التصميم التجريبي والمناقشات المفيدة. نشكر إميل جي دي ماير (قسم علم الوراثة البشرية ، LUMC ، لايدن ، هولندا) للمساعدة في عزل الحمض النووي الريبي أحادي النواة وإعداد المكتبة للتسلسل. هذا العمل مدعوم من قبل المنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO) [016.196.346 إلى M.R.M.J.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and reagents | |||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 0.4% trypan blue dye | Bio-Rad | 1450021 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004176 | use 1,400 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 67685 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| Fetal bovine serum (low endotoxin) | Biowest | S1810-500 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Cell wash buffer |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Cell wash buffer |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Nucleus Lysis buffer |
| Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent) | Sigma-Aldrich | 74385 | Nucleus Lysis buffer |
| Nuclease free water (not DEPC-treated) | Invitrogen | AM9937 | Nucleus Lysis buffer |
| Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus Lysis buffer |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | Nucleus Lysis buffer |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | Nucleus Lysis buffer |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Nucleus wash |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Nucleus wash |
| Protector RNase Inhibitor,40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus wash |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Calcium chloride solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Nuclease free water (not DEPC treated) | Invitrogen | AM9937 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Sodium Chloride Solution, 5M | Sigma-Aldrich | 59222C | ST staining buffer (ST-SB) |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST staining buffer (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody | Biolegend | 682205 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody | Biolegend | 682207 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody | Biolegend | 682209 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody | Biolegend | 682225 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody | Biolegend | 682227 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody | Biolegend | 682229 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody | Biolegend | 682231 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody | Biolegend | 682233 | Hashtag antibody |
| TruStain FcX (human) | Biolegend | 422302 | FC receptor blocking solution |
| Equipment and consumables | |||
| Bright-Line Hemacytometer | Merck | Z359629-1EA | |
| Centrifuge 5702/R A-4-38 | Eppendorf | EP022629905 | |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | EP0030108035-250EA | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish | Corning | 351008 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 10773501 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine science tools | 11252-40 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine science tools | 14091-09 | |
| Ice Pan, rectangular 4 L Orange | Corning | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Leica | Microscope | |
| Moria MC50 Scissors | Fine science tools | 15370-50 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine science tools | 15012-12 | |
| Olympus CK2 ULWCD | Olympus | Microscope | |
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| Preseparation Filters (30 µm) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| Shaking water bath | GFL | 1083 | |
| Silicon plate | RubberBV | 3530 | Dissection board |
| Software and packages | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| R programming | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #007576 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Code for the data analysis | |||
| https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE |
References
- McCorry, L. K.
- Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Cardiology Research and Practice. 2015, 698368 (2015).
- Ajijola, O. A., et al. Extracardiac neural remodeling in humans with cardiomyopathy. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 5 (5), 1010 (2012).
- Nguyen, B. L., et al. Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 143-148 (2012).
- Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
- Han, S., et al. Electroanatomic remodeling of the left stellate ganglion after myocardial infarction. Journals of the American College of Cardiology. 59 (10), 954-961 (2012).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Svensson, V., Vento-Tormo, R., Teichmann, S. A. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nature Protocols. 13 (4), 599-604 (2018).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
- Kokubun, S., et al. Distribution of TRPV1 and TRPV2 in the human stellate ganglion and spinal cord. Neuroscience Letters. 590, 6-11 (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communication. 10 (1), 2832 (2019).
- Petrany, M. J., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers. Nature Communication. 11 (1), 6374 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648 (2018).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
- Zandstra, T. E., et al. Asymmetry and heterogeneity: part and parcel in cardiac autonomic innervation and function. Frontiers in Physiology. 12, 665298 (2021).
- Lewis, A. E., Vasudevan, H. N., O'Neill, A. K., Soriano, P., Bush, J. O. The widely used Wnt1-Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling. Developmental Biology. 379 (2), 229-234 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. bioRxiv. , (2018).
- Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 11022 (2016).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
- Grindberg, R. V., et al.
