Summary
Bu protokol, fare üstün servikal ve yıldız gangliyonunun diseksiyonu, hücre ayrışması, kriyoprezervasyon, çekirdek izolasyonu ve hashtag barkodlaması dahil olmak üzere tek çekirdekli dizileme için ayrıntılı, düşük girişli numune hazırlığını açıklar.
Abstract
Kardiyak otonom sinir sistemi, kalp atış hızı ve kardiyak kontraktilitesi gibi kardiyak fonksiyonların kontrolünde çok önemlidir ve sempatik ve parasempatik dallara ayrılır. Normalde, homeostazı korumak için bu iki dal arasında bir denge vardır. Bununla birlikte, miyokard enfarktüsü, kalp yetmezliği ve hipertansiyon gibi kalp hastalığı durumları, olumsuz bir klinik sonuçla ilişkili olan kardiyak innervasyonda rol oynayan hücrelerin yeniden şekillenmesine neden olabilir.
Kardiyak otonom sinir sisteminin histolojik yapısı ve işlevi için çok miktarda veri olmasına rağmen, sağlık ve hastalıktaki moleküler biyolojik mimarisi birçok açıdan hala gizemlidir. Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) gibi yeni teknolojiler, dokuların tek hücreli çözünürlükte genetik karakterizasyonu için umut vaat etmektedir. Bununla birlikte, nispeten büyük nöron boyutu, bu tekniklerin standartlaştırılmış kullanımını engelleyebilir. Burada, bu protokol, sağlık ve hastalıkta kardiyak sempatik nöronların biyolojik mimarisini karakterize etmek için bir yöntem olan damlacık bazlı tek çekirdekli RNA dizilimini (snRNA-seq) kullanır. Yetişkin farelerden disseke edilen bilateral superior servikal (SCG) ve stellat ganglionların (StG) snRNA-sekik'ini gerçekleştirmek için kademeli bir yaklaşım gösterilmiştir.
Bu yöntem, birden fazla bireyden/deneyden alınan örneklerin kısa bir süre içinde bir kerede toplanamadığı durumlarda yeterli RNA kalitesini koruyarak uzun süreli numune muhafazasını sağlar. Çekirdeklerin hashtag oligolarla (HTO'lar) barkodlanması, çoklamanın giderilmesini ve dizileme sonrası farklı gangliyonik örneklerin geri izlenmesini sağlar. Daha sonraki analizler, snRNA-seq tarafından doğrulandığı gibi, sempatik ganglionların nöronal, uydu glial ve endotel hücrelerinin başarılı çekirdek yakalamasını ortaya koydu. Özetle, bu protokol, sempatik ekstrinsik kardiyak gangliyonların snRNA-seksi için, diğer organ ve dokuların innervasyonu çalışmalarında daha geniş uygulama potansiyeline sahip bir yöntem olan kademeli bir yaklaşım sağlar.
Introduction
Otonom sinir sistemi (ANS), çevresel koşullara ve patolojiye adaptasyon da dahil olmak üzere vücut homeostazını koruyan periferik sinir sisteminin çok önemli bir parçasıdır1. Kardiyovasküler, solunum, sindirim ve endokrin sistemler gibi vücuttaki çoklu organ sistemlerinin düzenlenmesinde rol oynar. ANS sempatik ve parasempatik dallara ayrılmıştır. Sempatik sinir sisteminin spinal dalları, sempatik zincirin ganglionlarında, iki taraflı olarak paravertebral pozisyonda bulunan sinapstır. İki taraflı servikal ve torasik ganglionlar, özellikle StG, kardiyak sempatik innervasyona katılan önemli bileşenlerdir. Kardiyak iskemi gibi hastalık durumlarında, nöronal yeniden yapılanma meydana gelebilir ve bu da sempatik bir aşırı hızlanmaile sonuçlanır 2. Nöronal yeniden yapılanma, insanlarda ve diğer bazı hayvan türlerinde 3,4,5,6 yapılan birçok histolojik çalışmada gösterilmiştir. Kardiyak sempatik gangliyonlarda kardiyak iskemiye bağlı nöronal remodellemenin ayrıntılı bir biyolojik karakterizasyonu şu anda eksiktir ve kardiyak sempatik sinir sistemi (SNS) içindeki özelleşmiş nöronal hücre tiplerinin veya alt tiplerinin temel biyolojik özellikleri sağlık ve hastalıkta henüz tam olarak belirlenmemiştir7.
ScRNA-seq gibi yeni teknolojiler, küçük dokuların tek hücre seviyesindegenetik karakterizasyonu için kapılar açmıştır 8,9. Bununla birlikte, nöronların nispeten büyük boyutu, bu tek hücreli tekniklerin insanlarda optimize edilmiş kullanımını engelleyebilir10. Ek olarak, tek hücreli dizileme, sıralama işlemindeki yüksek bir kayıp nedeniyle yeterli bir hücre sayısını geri kazanmak için yüksek verimli bir hücre gerektirir. Bu, bir seansta yakalanması zor olan ve dizileme için yeterli tek hücreyi tanıtmak için birden fazla örnek gerektiren küçük dokuları incelerken zor olabilir. Yakın zamanda geliştirilen damlacık bazlı snRNA-seq teknolojisi (yani, 10x Krom platformu), tek çekirdekler arasındaki biyolojik farklılıkların incelenmesine izin verir11,12. snRNA-seq, Emülsiyonlarda (GEM'ler) Jel Boncuk'ta yakalanamayan büyük hücreler (>30 μm) için scRNA-seq'e göre bir avantaja sahiptir, ayrıca kapsamlı ayrışma ve / veya uzun süreli koruma ile gelişmiş uyumluluk13,14,15.
Heterojenlik, nöronal hücrelerin sayısı ve kardiyak SNS'de zenginleştirilmiş diğer hücreler, sağlık ve hastalık durumlarında ANS'nin karakterizasyonu için önemli hususlardır. Ek olarak, her sempatik ganglionun organa veya bölgeye özgü innervasyonu, SNS'nin karmaşıklığına katkıda bulunur. Ayrıca, sempatik zincirin servikal, stellat ve torasik ganglionlarının kalbin farklı bölgelerini innerve ettiği gösterilmiştir16. Bu nedenle, biyolojik mimarilerini incelemek için bireysel ganglionlardan türetilen gangliyonik hücrelerin tek çekirdekli analizini yapmak gerekir.
Damlacık bazlı snRNA-seq, plaka tabanlı dizileme platformlarından daha düşük maliyetlerle aynı anda birden fazla numuneden binlerce hücreden oluşan bir havuz için transkriptom çapında ekspresyon profillemesine izin verir. Bu yaklaşım, damlacık bazlı snRNA-sek'in hücresel fenotip sınıflandırması ve SCG ve StG içindeki hücrelerin yeni alt popülasyon tanımlaması için daha uygun olmasını sağlar. özellikle, bu protokol, sempatik ekstrinsik kardiyak ganglionların tanımlanması, izolasyonu ve tek çekirdekli RNA dizilimi için kısa ve kademeli bir yaklaşım sağlar; bu, diğer ilgili organ ve dokuları innerve eden ganglionların karakterizasyonu çalışmalarında geniş bir uygulama potansiyeline sahip bir yöntemdir. sağlık ve hastalık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, murin servikal ve / veya servikotorasik (stellat) gangliyonların snRNA-seksi için gerekli tüm adımları açıklar. Dişi ve erkek C57BL/6J fareler (15 haftalık, her cinsiyet için n=2) kullanıldı. Ek bir Wnt1-Cre; mT / mG fare, ganglionları diseksiyon amacıyla görselleştirmek için kullanıldı17,18. Bu ek fare, bir B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J fare ve bir B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J farenin melezlenmesiyle oluşturuldu. Tüm hayvan deneyleri, NIH tarafından yayınlanan ve Leiden Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre gerçekleştirilmiştir (Lisans numarası AVD1160020185325, Leiden, Hollanda). Protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar, yazılımlar ve hayvanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Hazırlıklar
NOT: Tüm adımlar bir hücre kültürü akış kabininde gerçekleştirilir.
- Forseps ve makasları, aletleri 20 dakika boyunca% 70 etanol içine batırarak temizleyin.
- B-27 artı (1x), L-glutamin (2 mM) ve% 1 Antibiyotik-Antimikotik ile desteklenmiş Nörobazal Ortamdan oluşan ganglion ortamını hazırlayın. Ganglion ortamını oda sıcaklığında önceden ısıtın.
- Sindirim çözeltisini hazırlayın:% 0.25 Tripsin-EDTA (1: 1) ve gangliyon ortamında çözünmüş 1.400 U / mL kollajenaz tip 2.
- Çekirdek izolasyonu için taze, soğuk (4 °C) hücre yıkama tamponu (%0,4 sığır serum albümini [BSA]) ve lizis tamponu (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 ve %0,1 iyonik olmayan deterjan, nükleaz içermeyen suda 40 U/mL RNAse) hazırlayın.
- Çekirdek yıkama tamponu hazırlayın (%2.0 BSA ve 0.2U/μL RNaz İnhibitörü ile 1x fosfat tamponlu salin [PBS]).
- ST boyama tamponunu (ST-SB) hazırlayın (nükleaz içermeyen suda 10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl,21 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, %2 BSA, %0,02 Ara-20).
2. Yetişkin fare superior servikal ganglionların (SCG) diseksiyonu
- Fareleri ötenazi yapın ve buz üzerinde tutun.
NOT: Bu çalışmada, toplam 4 C57BL6/J faresi CO2 boğulması ile ötenazi yapılmıştır. Alternatif olarak, izofluran, diğer çalışma amaçları için büyük miktarda kan toplanması gerektiğinde ekssanguinasyon ile takip edilebilir. - Fareyi pimlerle bir diseksiyon panosuna sabitleyin ve kürk dağılımını en aza indirmek için% 70 etanol ile doldurun (tıraş gerekli değildir).
- Bir stereomikroskop altında, makasla orta hat kesimi yaparak boyun bölgesinin derisini açın, submandibuler bezleri bir kenara taşıyın ve ortak karotis arteri ve çatallanmasını ortaya çıkarmak ve bulmak için sternomastoid kası çıkarın (Şekil 1A, B, oka bakınız).
- Sağ ve sol karotis arter bifurkasyonunu ve ona bağlı dokuyu diseke edin. Her disseke edilmiş doku parçasını soğuk PBS içeren ayrı bir 3,5 cm Petri kabına aktarın.
- Karotis bifurkasyonuna bağlı SCG'yi arayın. Petri kabındaki arteri ve diğer bağlı dokuları çıkararak SCG'yi daha da temizleyin (Şekil 1E).
3. Yetişkin fare yıldız ganglionlarının (StG) diseksiyonu
- StG'yi diseke etmek için, karında bir orta hat kesimi yapın, ardından diyaframı ve ventral torasik duvarı açın.
- Dorsal toraksı ortaya çıkarmak için kalbi ve akciğerleri çıkarın. İlk kaburga seviyesindeki musculus colli longus'a (MCL) sol ve sağ StG anterolateral olanı arayın (Şekil 1C, D, kesikli çizgilerle gösterilir).
- Forseps ile hem sol hem de sağ StG'yi disseke edin ve ayrı ayrı soğuk PBS içeren 3,5 cm Petri kaplarına aktarın (Şekil 1F).
4. Fare gangliyonik hücrelerinin izolasyonu ve kriyoprezervasyonu
4-6 arası adımlar Şekil 2'de özetlenmiştir.
- 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini forseps ile ayırmak için tüm bireysel SCG ve StG'yi dikkatlice aktarın.
NOT: Ganglionları aktarmak için pipet uçlarını kullanmayın, çünkü ganglionlar plastik pipet uçlarının duvarına yapışmaya eğilimlidir. - Her bir mikrosantrifüj tüpüne 500 μL% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 40 dakika boyunca 37 ° C'de sallanan bir su banyosunda inkübe edin.
NOT: Bu adım, bundan sonra kollajenaz tip 2 çözeltisinde sindirimi ve hücre salınımını kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. - Her numune için 5 mL ganglion ortamı içeren 15 mL'lik bir tüp hazırlayın. Ganglionların mikrosantrifüj tüplerinin dibine yerleşmesine izin verin. Çok az gangliyonik hücre içeren süpernatanı toplayın, süpernatantı hazırlanan 15 mL tüplere aktarın ve her tüpü etiketleyin. Alternatif olarak, biraz zaman kazanmak için, tripsin-EDTA süpernatantını toplanmadan aspire edin, çünkü içinde çok az ayrışmış hücre tespit edilebilir.
NOT: Ganglianın çıkarılmasını önlemek için mikrosantrifüj tüpünde az miktarda tripsin-EDTA çözeltisi (~ 10-30 μL) bırakılabilir. Bu adımda pipetlemeden kaçının, çünkü ganglionlara zarar verebilir ve daha sonra gangliyonik hücrelerin düşük çıkışına neden olabilir. - Her bir mikrosantrifüj tüpüne 500 μL kollajenaz tip 2 çözeltisi ekleyin ve 35-40 dakika boyunca 37 ° C'de sallanan bir su banyosunda inkübe edin. Ganglionu 35 dakika sonra askıya almaya çalışın; ganglion hala sağlamsa ve ayrışmazsa, inkübasyon süresini uzatın veya gerektiğinde kollajenaz tip 2 çözeltisinin konsantrasyonunu artırın.
NOT: Kuluçka süresi ganglion boyutuna bağlı olarak değişebilir. - Gangliyonları kollajenaz çözeltisinde ~ 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek veya doku kümeleri artık tespit edilinceye kadar yeniden askıya alın.
- Hücre süspansiyonunu, gangliyon kültür ortamını ve tripsin-EDTA süspansiyonunu aynı gangliondan içeren daha önce kullanılan 15 mL tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunu sallanan kova rotorlu santrifüjle oda sıcaklığında 10 dakika, 300 × g boyunca döndürün. Hücre süpernatını dikkatlice atın.
NOT: Gangliyonik hücreler tek bir gangliondan ayrıştığından, hücre peleti gözle tespit edilemeyecek kadar küçük olabilir; hücre peletinin yanlışlıkla çıkarılmasını önlemek için tüpte az miktarda süpernatant bırakılabilir. - Gangliyonik hücreleri 270 μL fetal sığır serumunda (FBS, düşük endotoksin) yeniden askıya alın ve her hücre-FBS süspansiyonunu 1 mL kriyovyal içine aktarın.
- Hücreleri saymak için, gangliyonik hücre süspansiyonunun 5 μL'sini% 0.4 tripan mavisi boya ile 5 μL'lik karıştırın ve karışımı bir hemositometreye yükleyin. Toplam ve canlı hücre sayılarını mikroskop altında sayın.
NOT: Hücre canlılığı (canlı hücre sayısı / toplam hücre sayısı = canlılık), bu ayrışma protokolü ile genellikle% 90'ın üzerindedir. Tek bir ganglionun (SCG veya StG) canlı hücre sayısı, gangliyon 12 ila 16 haftalık bir fareden izole edildiğinde genellikle 9.000-60.000 hücre aralığındadır. - Kriyovallerdeki her hücre-FBS süspansiyonuna 30 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin, iyice karıştırın ve kriyovyalleri oda sıcaklığında tutulan bir hücre dondurma kabına aktarın. Kriyovsal yüklü kabı gece boyunca -80 ° C'de saklayın ve dizilemeden önce uzun süre korunmak için kriyovyalleri ertesi gün sıvı nitrojene aktarın.
5. Çekirdek izolasyonu
NOT: Dört fareden izole edilen sol ve sağ SCG (toplam 8 örnek), aşağıdaki çekirdek izolasyonu ve dizileme hazırlığında örnek olarak kullanılmıştır. Tüm prosedür boyunca her şeyi buz üzerinde tutun. Küçük çekirdek peletlerinin görünmezliği nedeniyle, tüm prosedür boyunca süpernatant giderimini kolaylaştırmak için sallanan kovalara sahip bir santrifüj şiddetle tavsiye edilir.
- Üstüne bir süzgeç (30 μm) ile 15 mL tüpler hazırlayın ve süzgeci ganglion ortamın 1 mL'si ile hazırlayın.
- Kriyovalleri sıvı azottan çıkarın ve hemen 37 ° C'de bir su banyosunda çözün. Kriyovalde küçük bir buz topağı bırakıldığında, kriyovyalleri su banyosundan çıkarın.
- Gangliyonik hücreleri, gangliyon ortamının 1 mL'sini her kriyovyalin içine bırakarak ve elle dikkatlice sallayarak geri kazanın. İsteğe bağlı: Hücre iyileşmesini değerlendirmek için, iyileşmeden sonra hücre süspansiyonunu karıştırın ve adım 4.8'de açıklandığı gibi canlı hücre sayımı için 5 μL hücre süspansiyonu alın.
- Her gangliyonik hücre süspansiyonunu ayrı bir süzgeç üzerine yükleyin (adım 5.1'de hazırlanmış) ve her süzgeci 4-5 mL ganglion ortamı ile durulayın.
- Süzülmüş hücre süspansiyonunu 300 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj edin, süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücreleri 50 μL hücre yıkama tamponunda yeniden askıya alın.
- Hücre süspansiyonunu düşük bağlayıcı bir DNA / RNA 0.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Hücre süspansiyonunu 500 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Hücre peletinin yerinden çıkmasını önlemek için tüpün dibine dokunmadan süpernatantın 45 μL'sini çıkarın.
- 45 μL soğutulmuş Lizis Arabelleği ekleyin ve 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak yavaşça yukarı ve aşağı pipet uygulayın.
- Hücreleri buz üzerinde 8 dakika boyunca inkübe edin.
- Her tüpe 50 μL soğuk çekirdek yıkama tamponu ekleyin. Karıştırmayın.
- Çekirdek süspansiyonunu 4 °C'de 5 dakika boyunca 600 × g'da santrifüj yapın.
- Çekirdek peletini bozmadan süpernatantın 95 μL'sini çıkarın.
- Pelet üzerine 45 μL soğutulmuş çekirdek yıkama tamponu ekleyin. İsteğe bağlı: 5 μL çekirdek süspansiyonu alın, saymak için 5 μL% 0.4 tripan mavisi ile karıştırın ve bir hemositometre ile mikroskop altında çekirdeklerin kalitesini kontrol edin.
- Çekirdek süspansiyonunu 4 °C'de 5 dakika boyunca 600 × g'da santrifüj yapın.
- Çekirdek peletinin yerinden çıkmasını önlemek için tüpün dibine dokunmadan süpernatantı çıkarın.
6. Hashtag oligos (HTO'lar) ve çoklama ile çekirdek barkodlama
NOT: HTO boyama basamakları, Gaublomme ve ark.15 tarafından kortikal dokuda önceki uygulamaya göre çok düşük miktarlarda (ganglionik) çekirdeğin nükleer etiketlenmesi için modifiye edilmiş ve optimize edilmiştir.
- Çekirdek peletine 50 μL ST-SB tamponu ekleyin, çekirdekler tamamen yeniden askıya alınana kadar 8-10 kez hafifçe pipet çekin.
- ST-SB / çekirdek karışımının 50 μL'si başına 5 μL Fc Bloke edici reaktif ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
- ST-SB / çekirdek karışımının tüpü başına 1 μL (0,5 μg) tek çekirdekli hashtag antikoru ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Daha kısa inkübasyon süresi, temsili sonuçlarda gösterildiği gibi, hashtag etiketlemenin daha düşük verimliliğine yol açar. - Her tüpe 100 μL ST-SB ekleyin. Karıştırmayın.
- Çekirdek süspansiyonunu 4 °C'de 5 dakika, 600 × g santrifüj yapın.
- Çekirdek peletini bozmadan süpernatantın 145 μL'sini çıkarın.
- 6.4 ve 6.5 numaralı adımları yineleyin. Çekirdek peletinin yerinden çıkmasını önlemek için süpernatantı tüpün dibine dokunmadan mümkün olduğunca çıkarın.
- Çekirdek peletini 50 μL ST-SB içinde yeniden askıya alın ve çekirdekleri yavaşça karıştırın.
- Çekirdek süspansiyonunun 5 μL'sini alın ve çekirdekleri mikroskop altında saymak için 5 μL% 0.4 tripan mavisi ile karıştırın. Tripan mavisi ile karıştırılmış ve bir hemositometreye yüklenen çekirdeklerin temsili bir görüntüsü için Şekil 3A'ya bakınız.
- Çekirdek süspansiyonunu 4 °C'de 600 × g'da 5 dakika santrifüj yapın.
- Karşılık gelen çekirdek sayısına göre her numune için 1.000-3.000 nüklei/μL'lik bir hedef çekirdek konsantrasyonu elde etmek için ST-SB'deki çekirdekleri yeniden askıya alın.
- İstenilen hücre sayısına ulaşmak için örnekleri bir araya getirin.
NOT: Örneğin, bu deneyde, 8 örnek, hemen ardından 10x Genomik Krom ve snRNA-sek'e geçmek için toplam 25.000 çekirdeğe ulaşmak için eşit olarak bir araya getirildi. Çekirdek sayısı, ganglion 12 ila 16 haftalık bir fareden izole edildiğinde genellikle 6.000-40.000 hücre aralığına düşer. Toplam yüklü çekirdeklerin sadece yarısı damlacık bazlı snRNA-seq ile yakalanabilir. Örneğin, daha fazla kütüphane hazırlama ve dizileme için gerekli olan 10.000 çekirdeğin yakalanmasını sağlamak için 25.000 çekirdek karışımı hazırlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek çekirdekli cDNA kütüphanesi hazırlığı ve snRNA-seq kalite kontrol analizi
Temsili sonuçlar, 25.000 okuma / çekirdek gen ekspresyon kütüphanesi ve 5.000 okuma / çekirdek hashtag kütüphanesi ile tek bir havuzda yakalanan 10.000 çekirdeğin dizileme sonuçlarını açıklamaktadır. Şekil 3B , Biyoanalizör ile kontrol edilen 1. iplik cDNA, gen ekspresyonu (GEX) kütüphanesi ve HTO kütüphanesinin kalite kontrol sonuçlarını göstermektedir. HTO kaynaklı cDNA'ların 180 bp'den küçük olması beklenirken, mRNA kaynaklı cDNA'ların 300 bp'den daha büyük olması beklenir. Yüksek kaliteli bir GEX kitaplığı 300 ila 1.000 bp arasında geniş bir tepe noktası olarak algılanabilir ve HTO kitaplığı 194 bp'lik belirli bir tepe noktası olarak algılanır. Seurat R paket19 daha sonra kalite kontrol ve çıkış yönündeki analizler için kullanıldı.
snRNA-seq verilerinin çoklanması, Seurat yerleşik çoklama çözme stratejisi kullanılarak HTO'ların tanımlanmasıyla gerçekleştirildi. Her HTO için çoklama çözme yeteneği ilk olarak HTO ifade dosyalarıyla görselleştirildi (Ek Şekil S1). Şekil 4A'nın ısı haritasında, tekletler spesifik HTO ekspresyonuna sahip çekirdekler olarak algılanırken, çiftler ve negatifler çoklu veya hiç HTO'nun spesifik olmayan ekspresyonunu gösterir. Not olarak, çekirdeklerin yaklaşık% 33'ü 10 dakikalık bir HTO antikor inkübasyon yaklaşımı kullanılarak negatif olarak tespit edildi. Bir sonraki deneyde inkübasyon süresinin (adım 6.3) 10 dakikadan 30 dakikaya uzatılması, negatif etiketli çekirdeklerde dikkate değer bir azalma olduğunu ortaya koymuştur (Ek Şekil S2). Bu bulgular, antikor inkübasyon süresinin uzatılmasının hashtag verimliliğini artırabileceğini göstermektedir.
Şekil 4B-D'deki keman grafikleri, aykırı değerleri ve düşük kaliteli çekirdekleri tanımlamak için snRNA-seq veri kümesindeki gen sayısını (nFeature_RNA), benzersiz moleküler tanımlayıcıların sayısını (UMI) (nCount_RNA) ve mitokondriyal sayımların yüzdesini (percent.mt) göstermektedir. Çekirdekler yalnızca aşağıdaki kriterler karşılandığında aşağı akış analizine dahil edildi: i) 500'nFeature_RNA > ve 20.000'nCount_RNA <; ii) percent.mt < %5; iii) bireysel çekirdek tek bir HTO'nun net ifadesini gösterdi. Gen ekspresyon sayıları Seurat'ta varsayılan yöntem kullanılarak normalleştirildi: 875 (% 2.71) gen oldukça değişken genler olarak tespit edildi (Şekil 4E). snRNA-seq GEX ölçeklendirildi, gerçekleştirildi ve dirsek grafiği, aşağı akış analizleri için kullanılacak ana bileşenlerin dahil edilmesini değerlendirmek için kullanıldı (Şekil 4F). Toplamda 18 PC dahil edildi. Kümeleme 0,4 çözünürlükle gerçekleştirildi.
Çekirdekler kümelendi ve 12 ayrı kümenin görselleştirilmesi için boyut küçültme (UMAP) gerçekleştirildi (Şekil 5A). Küme başına medyan ham gen sayısı 991.5 ile 4.586 arasında değişmektedir (Ek Şekil S3A, B). HTO antikorlarının UMAP içindeki bölünmesini görselleştirmek, ganglionların net bir dağılımını ortaya koymakta ve tüm kümelerin her ganglionda sunulduğunu göstermektedir (Şekil 5B). HTO numune ayrımının doğruluğunu doğrulamak için, erkek örnekleri ve dişi örnekleri tanımlamak için X Aktif Olmayan Spesifik Transkript (Xist, inaktif dişi X kromozomunda eksprese edilen) ekspresyonu değerlendirildi (Şekil 5C). Xist ifadesi, HTO 1-4 etiketli örneklerin dişi örnekler olduğunu ve HTO 5-8 etiketli örneklerin erkek örnekler olduğunu gösteren hashtag etiketlemesine uygundu. Bu, küratörlü HTO etiketlemesinin oldukça spesifik olduğunu göstermektedir.
Dizileme verilerinin kalitesini ve çözünürlüğünü mevcut yöntemle daha da doğrulamak için, önce sempatik nöronların bazı önemli transkriptleri incelenmiştir. Sonuçlar, küme 5 ve 7'de Th, Dbh ve Snap25'i yüksek oranda eksprese eden sempatik nöronların varlığını göstermektedir (Şekil 5D-F). 0-3 kümelerinde S100b ekspresyonu ile uydu glial hücreleri tespit edildi (Şekil 5G)20. Küme 4'te yüksek Pecam1 ekspresyonuna sahip endotel hücreleri (Şekil 5H) ve küme 8'de yüksek Acta2 ekspresyonuna sahip stromal hücreler saptandı (Şekil 5I). Bu sonuçlar, snRNA-seq kullanılarak sempatik ganglionun nöronal, uydu glial, endotel ve stromal hücrelerinin başarılı çekirdek yakalamasını desteklemektedir.
Resim 1: Yetişkin fare superior servikal gangliyonları ve yıldız gangliyonlarının diseksiyonu . (A) SCG'nin yerinin parlak alan görüntüsü. (B) Görselleştirmeyi kolaylaştırmak için bir Wnt1Cre;mT/mG fare kullanıldı. Yıldız işaretleri SCG'yi (eGFP +), ok uçları karotis arterin çatallanmasını gösterir. Sol panel, faz kontrast görüntüsü; sağ panel, floresan görüntü. (C) StG. (D) Yıldız işaretleri StG'yi (eGFP+), kesikli çizgiler MCL'yi gösterir. Sol panel, faz kontrast görüntüsü; sağ panel, floresan görüntü. (E) Disseke edilmiş ganglionlar, bir stereomikroskop altında daha fazla temizlik için ayrı ayrı bir Petri kabına aktarılır. (F) Sol panel, karotis arter hala bağlı olan disseke SCG. Kesikli anahat SCG'yi gösterir. Sağ panel, disseke edilmiş ve temizlenmiş StG, kesikli anahat ile belirtildiği gibi ters üçgen şeklindedir. Ölçek çubuğu = 1.000 μm. Kısaltmalar: SCG = superior servikal ganglionlar; StG = yıldız gangliyonu; MCL = musculus colli longus; eGFP = gelişmiş yeşil floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: snRNA-seq için numune hazırlama ve hashtag boyama tabanlı çoklama iş akışı. Akış şeması, snRNA-sek için gerçekleştirilen gangliyonik hücrelerin (turuncu), çekirdek izolasyonunun (mavi) ve hashtag antikor boyama ve çoklamasının (yeşil) ayrışmasından sonraki adımları göstermektedir. Kısaltmalar: FBS = fetal sığır serumu; ST-SB = ST boyama tamponu; snRNA-seq = tek çekirdekli RNA dizilimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Çekirdek izolasyonunun kalite kontrolü ve gen ekspresyon kütüphanesi hazırlığı . (A) HTO boyalı çekirdeklerin faz-kontrast görüntüsü. Çekirdekler oklarla gösterilir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) 1. iplik cDNA (üstte), GEX kütüphanesinin (ortada) ve HTO kütüphanesinin (altta) biyoanalizör sonuçları. Kısaltmalar: GEX = gen ekspresyonu; HTO = hashtag oligo. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hashtag oligo etiketleme verimliliğinin kalite kontrolü ve snRNA-seq'in kalite kontrolü. (A) Hashtag antikorları ile 10 dakikalık bir inkübasyon süresi ile elde edilen HTO boyama ısı haritası. (B-D) Genlerin sayısını gösteren kalite kontrol metriklerinin keman grafikleri (nFeature_RNA, B); UMI'lerin sayısı (nCount_RNA, C); mitokondriyal sayımların yüzdesi (percent.mt, D). (E) Dizilenen toplam 32.285 genin 875'i (%2.71), dağılım grafiğinde görselleştirildiği gibi oldukça değişken özellikler olarak tanımlanmıştır. (F) Kümeleme için kullanılan gerçek sinyalin dahil edilmesini belirlemek için PC'lerin dirsek grafiği. Kısaltmalar: snRNA-seq = tek çekirdekli RNA dizilimi; HTO = hashtag oligo; PC'ler = ana bileşenler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kümelenmiş snRNA-seq veri kümesinin snRNA-seq (A) UMAP grafiğinin analizinin temsili sonuçları. (B) Havuza alınmış HTO örneklerinin dağılımını görselleştiren UMAP grafiği. (C) Çoklamadan sonra kadın örneklerini doğrulayan keman grafiği (yüksek Xist ifadesi). (D-I) Seçilen işaretleyici genleri gösteren UMAP grafikleri; kümeler, kırmızı daireler içinde belirtilen karşılık gelen genleri yüksek oranda ifade eder: D-F, Sempatik nöronlar (Th, Dbh, Snap25); (G) Uydu glial hücreleri (S100b); (H) Endotel hücreleri (Pecam1); (I) Stromal hücreler (Acta2). Kısaltmalar: snRNA-seq = tek çekirdekli RNA dizilimi; HTO = hashtag oligo; UMAP = tekdüze manifold yaklaşımı ve projeksiyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: Temsili tek çekirdekli dizileme sonucunun kalite kontrol metrikleri. Kullanılan hashtag antikorlarının çoklama yeteneğini görselleştiren bireysel örneklerin HTO ekspresyon profilleri. Kısaltma: HTO = hashtag oligo. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S2: 30 dakika boyunca HTO antikorları ile inkübe edilen sonraki örneklerin HTO ekspresyonu ısı haritası. HTO demultipleks işleminden sonra negatif etiketli çekirdek sayısının Şekil 4A ile karşılaştırılması, antikor inkübasyon süresini uzattıktan sonra çekirdek etiketlemesinde belirgin bir iyileşme olduğunu göstermektedir. Kısaltma: HTO = hashtag oligo. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S3: Küme başına gen ekspresyonunun medyan ve kantilleri. (A) Her kümenin medyan sıfır olmayan ham gen ekspresyonu. (B) Her kümenin sıfır olmayan ham gen ekspresyonunun tanımlayıcı istatistikleri. Q1: 25. yüzdelik, Q3: 75.yüzdelik. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, i) yetişkin fare üstün servikal ve sempatik gangliyonlarının diseksiyonu, ii) gangliyonik hücrelerin izolasyonu ve kriyoprezervasyonu, iii) çekirdek izolasyonu ve iv) çoklama amacıyla HTO etiketleme ile nükleus barkodlaması ve snRNA-sek konularına odaklanan ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.
Bu protokolle, yaygın olarak kullanılan tripsin ve kollajenaz kullanılarak bireysel gangliyonların ayrıştırılmasıyla sempatik gangliyonik hücreler kolayca elde edilebilir. İzole gangliyonik hücrelerin uzun süreli korunması, çözülmeden sonra yüksek kalitede iyileşme gösteren% 10 DMSO ile desteklenmiş FBS'deki hücrelerin dondurulmasıyla da kolayca elde edilir. Ayrıca, geleneksel tek hücreli RNA dizilimi ile karşılaştırıldığında, tek murin sempatik ganglionların damlacık bazlı snRNA-seksinin HTO boyama tabanlı çekirdek-barkodlama uygulamasıyla birlikte kullanılması aşağıdaki avantajlara sahiptir: i) numuneler, tüm numuneler daha fazla çekirdek izolasyonu için hazır olana kadar uzun süre korunabilir; ii) Birden fazla küçük boyutlu gangliondan izole edilen iyi kalitede çekirdekler, ayrı numune hazırlamanın neden olduğu bir parti etkisi olmaksızın dizileme için bir araya getirilebilir; iii) çekirdek barkodlarını kullanarak sıralamadan sonra farklı gangliyonik kökeni geriye doğru izleme yeteneği; ve iv) sadece tek bir kütüphane hazırlığına ihtiyaç duyulduğundan maliyet etkinliği. Önemli olarak, tarif edilen izolasyon ve hücre kültürü protokolü, hem murin servikal hem de stellat gangliyonlar için tek bir üniform yöntem sağlar ve dorsal kök gangliyonları ve diğer türler, örneğin insan gangliyonları gibi diğer ganglionlara potansiyel olarak uygulanabilir.
ScRNA-seq'in en büyük avantajlarından biri, (yeni) hücre tiplerini tanımlayabilme ve toplu RNA-seq tarafından tespit edilemeyen nadir hücre popülasyonlarını ortaya çıkarma yeteneğidir. Damlacık bazlı scRNA-seq platformu, daha fazla hücrenin yakalanmasını kolaylaştırır. Böylece, hücre (alt) tiplerinin ve büyük bir hücre popülasyonunun transkripsiyonel heterojenliğinin, plaka tabanlı bir dizileme platformuna kıyasla toplu bir görünümünü sağlayabilir. Bununla birlikte, damlacık bazlı (örneğin, 10x Krom) platform, 50 μm'den büyük hücreler için uygun değildir ve insan nöronları (~ 100 μm) gibi büyük hücrelerdeki uygulamasını sınırlar. snRNA-seq tekniğinin mevcudiyeti, bir çekirdeğin küçük boyutu nedeniyle bu dezavantajın üstesinden gelir. Dahası, snRNA-seq, nöronlar ve donmuş dokular gibi birbirine yüksek oranda bağlı ve düşük verimli hücrelerin gen ekspresyon çalışmaları için yararlı bir yöntemdir.
Çekirdekleri önceden hücre ayrışması olmadan dokulardan doğrudan izole etmek mümkün olsa da, verimin ilk önce ganglionu tek hücrelere (sıvı azotta korunabilen) ayrıştıran iki aşamalı bir çekirdek izolasyon yöntemi alması ve ardından çekirdek izolasyonu için yararlı olmuştur. Bir fare sempatik ganglionunun küçük boyutu nedeniyle, iki aşamalı çekirdek izolasyon yöntemi kullanılarak tek adımlı çekirdek izolasyon yaklaşımından daha fazla çekirdeğin elde edildiği bulunmuştur. cDNA, kütüphane ve dizileme analizlerinin kalite kontrolü, iyi çekirdek/RNA kalitesini gösterir. Ek olarak, toplu sıralamadan önce numuneler farklı zaman noktalarında toplanabildiği ve depolanabildiği için lojistik iyileştirilmiştir. Tek çekirdekli analiz ayrıca nöronların ve glial hücrelerin başarılı bir şekilde iyileşmesini ve yakalanmasını ortaya koymuştur, bu da tarif edilen iki aşamalı çekirdek izolasyon yaklaşımının küçük dokulardaki uygulama için daha uygun olabileceğini düşündürmektedir.
Bu protokolün bir diğer avantajı, barkodlu antikorlarla çoklama21'dir. Fare sempatik ganglionu küçük bir dokudur (ortalama boyut 0.1mm3) ve bireysel bir gangliondan türetilen düşük hücre sayısı, damlacık bazlı dizileme için tek başına yetersizdir. Bununla birlikte, farklı farelerin birkaç ganglionunu veya aynı farenin farklı ganglionlarını bir araya getirmek, bireysel fare bilgilerinin veya bireysel ganglion bilgilerinin kaybına neden olacaktır. Bir çözüm olarak, HTO boyama adımının gerçekleştirilmesi kolaydır ve çekirdek havuzundan önce farklı farelerden veya farklı ganglionlardan türetilen çekirdeklerin barkodlu etiketlenmesini sağlar. HTO demultipleksinin doğruluğu, bu protokolde, bilinen kadın çekirdek popülasyonlarında eşleşen Xist ekspresyonu ile doğrulanmıştır. Bu nedenle, barkodlu antikorlarla çekirdek çoklaması, parti etkilerini azaltır ve sıralama maliyetini düşürür.
snRNAseq'in potansiyel bir sınırlaması, nükleustaki RNA bileşimi ile sitoplazma arasında, nöronal aktivitelere erken yanıt ile ilişkili olarak çekirdekte yeni ortaya çıkan transkriptlerin doğal varlığından dolayı farklılıklar olabileceği olabilir22,23. Çekirdek ve sitoplazma, hücre döngüsü durumu24'e bağlı olarak transkriptlerde de farklılık gösterebilir. Bireysel bir çekirdekte (~7.000 gen) bir hücreden (~11.000 gen) daha az transkript tespit edildi14. Bu nedenle, scRNA-seq ve snRNA-seq, transkript düzeyinde farklı sonuçlar verebilir. Bununla birlikte, scRNA-seq ve snRNA-seq arasındaki karşılaştırma, beyin dokusunun nöronal hücre tiplerini ayırt etmek için benzer bir yetenek göstermiştir14. snRNA-seq ile oldukça benzer hücre tipleri veya alt tipleri arasındaki ayrımı geliştirmek için, scRNA-seq'e kıyasla daha düşük gen algılama yeteneğini telafi etmek için daha fazla çekirdeğe ihtiyaç duyulabilir. Ayrıca, HTO demultipleksinin doğruluğu yeterli olsa da, tüm çekirdekler HTO özgüllüğü göstermediğinden bazı verilerin kaybı kaçınılmazdır. Antikor inkübasyonunun daha fazla optimizasyonu, HTO'ların çift veya negatif ekspresyonuna sahip çekirdek sayısını en aza indirebilir.
Birlikte ele alındığında, bu protokol, ganglion izolasyonundan düşük hücre girişinin çekirdek hazırlanmasına kadar takip edilmesi kolay bir iş akışı yoluyla sempatik ganglionlardan nöronal çekirdeklerin dizilenmesi için deneysel prosedürü ve ardından snRNA-sek için HTO boyama tabanlı çekirdek etiketlemesini sağlar. Protokol, murin ve diğer türlerdeki çeşitli ganglionlara kolayca uygulanabilecek ve uygulanabilecek tüm önemli adımlara ayrıntılı bir genel bakış sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Susan L. Kloet'e (İnsan Genetiği Bölümü, LUMC, Leiden, Hollanda) deneysel tasarımdaki ve faydalı tartışmalardaki yardımları için teşekkür ederiz. Emile J. de Meijer'e (İnsan Genetiği Bölümü, LUMC, Leiden, Hollanda) tek çekirdekli RNA izolasyonu ve dizileme için kütüphane hazırlığı konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO) [016.196.346 to M.R.M.J.] tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and reagents | |||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 0.4% trypan blue dye | Bio-Rad | 1450021 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004176 | use 1,400 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 67685 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| Fetal bovine serum (low endotoxin) | Biowest | S1810-500 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Cell wash buffer |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Cell wash buffer |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Nucleus Lysis buffer |
| Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent) | Sigma-Aldrich | 74385 | Nucleus Lysis buffer |
| Nuclease free water (not DEPC-treated) | Invitrogen | AM9937 | Nucleus Lysis buffer |
| Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus Lysis buffer |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | Nucleus Lysis buffer |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | Nucleus Lysis buffer |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Nucleus wash |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Nucleus wash |
| Protector RNase Inhibitor,40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus wash |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Calcium chloride solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Nuclease free water (not DEPC treated) | Invitrogen | AM9937 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Sodium Chloride Solution, 5M | Sigma-Aldrich | 59222C | ST staining buffer (ST-SB) |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST staining buffer (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody | Biolegend | 682205 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody | Biolegend | 682207 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody | Biolegend | 682209 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody | Biolegend | 682225 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody | Biolegend | 682227 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody | Biolegend | 682229 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody | Biolegend | 682231 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody | Biolegend | 682233 | Hashtag antibody |
| TruStain FcX (human) | Biolegend | 422302 | FC receptor blocking solution |
| Equipment and consumables | |||
| Bright-Line Hemacytometer | Merck | Z359629-1EA | |
| Centrifuge 5702/R A-4-38 | Eppendorf | EP022629905 | |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | EP0030108035-250EA | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish | Corning | 351008 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 10773501 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine science tools | 11252-40 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine science tools | 14091-09 | |
| Ice Pan, rectangular 4 L Orange | Corning | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Leica | Microscope | |
| Moria MC50 Scissors | Fine science tools | 15370-50 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine science tools | 15012-12 | |
| Olympus CK2 ULWCD | Olympus | Microscope | |
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| Preseparation Filters (30 µm) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| Shaking water bath | GFL | 1083 | |
| Silicon plate | RubberBV | 3530 | Dissection board |
| Software and packages | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| R programming | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #007576 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Code for the data analysis | |||
| https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE |
References
- McCorry, L. K.
- Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Cardiology Research and Practice. 2015, 698368 (2015).
- Ajijola, O. A., et al. Extracardiac neural remodeling in humans with cardiomyopathy. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 5 (5), 1010 (2012).
- Nguyen, B. L., et al. Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 143-148 (2012).
- Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
- Han, S., et al. Electroanatomic remodeling of the left stellate ganglion after myocardial infarction. Journals of the American College of Cardiology. 59 (10), 954-961 (2012).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Svensson, V., Vento-Tormo, R., Teichmann, S. A. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nature Protocols. 13 (4), 599-604 (2018).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
- Kokubun, S., et al. Distribution of TRPV1 and TRPV2 in the human stellate ganglion and spinal cord. Neuroscience Letters. 590, 6-11 (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communication. 10 (1), 2832 (2019).
- Petrany, M. J., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers. Nature Communication. 11 (1), 6374 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648 (2018).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
- Zandstra, T. E., et al. Asymmetry and heterogeneity: part and parcel in cardiac autonomic innervation and function. Frontiers in Physiology. 12, 665298 (2021).
- Lewis, A. E., Vasudevan, H. N., O'Neill, A. K., Soriano, P., Bush, J. O. The widely used Wnt1-Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling. Developmental Biology. 379 (2), 229-234 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. bioRxiv. , (2018).
- Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 11022 (2016).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
- Grindberg, R. V., et al.
