Summary
Questo protocollo descrive la preparazione dettagliata e a basso input del campione per il sequenziamento a nucleo singolo, compresa la dissezione dei gangli cervicali e stellati superiori del topo, la dissociazione cellulare, la crioconservazione, l'isolamento del nucleo e il codice a barre hashtag.
Abstract
Il sistema nervoso autonomo cardiaco è cruciale nel controllo della funzione cardiaca, come la frequenza cardiaca e la contrattilità cardiaca, ed è diviso in rami simpatici e parasimpatici. Normalmente, c'è un equilibrio tra questi due rami per mantenere l'omeostasi. Tuttavia, stati di malattia cardiaca come infarto miocardico, insufficienza cardiaca e ipertensione possono indurre il rimodellamento delle cellule coinvolte nell'innervazione cardiaca, che è associata a un esito clinico avverso.
Sebbene ci siano grandi quantità di dati per la struttura istologica e la funzione del sistema nervoso autonomo cardiaco, la sua architettura biologica molecolare in salute e malattia è ancora enigmatica in molti aspetti. Nuove tecnologie come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) sono promettenti per la caratterizzazione genetica dei tessuti a risoluzione unicellulare. Tuttavia, le dimensioni relativamente grandi dei neuroni possono impedire l'uso standardizzato di queste tecniche. Qui, questo protocollo sfrutta il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo basato su goccioline (snRNA-seq), un metodo per caratterizzare l'architettura biologica dei neuroni simpatici cardiaci in salute e malattia. È stato dimostrato che un approccio graduale esegue snRNA-seq dei gangli cervicali superiori bilaterali (SCG) e stellati (StG) sezionati da topi adulti.
Questo metodo consente la conservazione del campione a lungo termine, mantenendo un'adeguata qualità dell'RNA quando i campioni di più individui / esperimenti non possono essere raccolti tutti in una volta in un breve periodo di tempo. La codifica a barre dei nuclei con oligo hashtag (HTO) consente il demultiplexing e il trace-back di campioni gangliari distinti dopo il sequenziamento. Analisi successive hanno rivelato la cattura dei nuclei di successo delle cellule neuronali, gliali satelliti ed endoteliali dei gangli simpatici, come convalidato da snRNA-seq. In sintesi, questo protocollo fornisce un approccio graduale per snRNA-seq di gangli cardiaci estrinseci simpatici, un metodo che ha il potenziale per un'applicazione più ampia negli studi sull'innervazione di altri organi e tessuti.
Introduction
Il sistema nervoso autonomo (ANS) è una parte cruciale del sistema nervoso periferico che mantiene l'omeostasi del corpo, compreso l'adattamento alle condizioni ambientali e alla patologia1. È coinvolto nella regolazione di più sistemi di organi in tutto il corpo come i sistemi cardiovascolare, respiratorio, digestivo ed endocrino. L'ANS è diviso in rami simpatici e parasimpatici. Rami spinali della sinapsi del sistema nervoso simpatico nei gangli della catena simpatica, situati bilateralmente in posizione paravertebrale. I gangli cervicali e toracici bilaterali, in particolare l'StG, sono componenti importanti che partecipano all'innervazione simpatica cardiaca. Negli stati patologici, come l'ischemia cardiaca, può verificarsi un rimodellamento neuronale, con conseguente overdrive simpatico2. Il rimodellamento neuronale è stato dimostrato in molteplici studi istologici sull'uomo e su diverse altre specie animali 3,4,5,6. Attualmente manca una caratterizzazione biologica dettagliata del rimodellamento neuronale indotto da ischemia cardiaca nei gangli simpatici cardiaci e le caratteristiche biologiche fondamentali di tipi o sottotipi di cellule neuronali specializzate all'interno del sistema nervoso simpatico cardiaco (SNS) non sono ancora completamente determinate in salute e malattia7.
Nuove tecnologie, come scRNA-seq, hanno aperto porte per la caratterizzazione genetica di piccoli tessuti a livello di singola cellula 8,9. Tuttavia, le dimensioni relativamente grandi dei neuroni possono impedire l'uso ottimizzato di queste tecniche a singola cellula negli esseri umani10. Inoltre, il sequenziamento a singola cellula richiede un elevato rendimento di cellule per recuperare un numero di cellule sufficiente a causa di un'elevata perdita nel processo di sequenziamento. Ciò potrebbe rivelarsi difficile quando si studiano piccoli tessuti che sono difficili da catturare in una sessione e richiedono più campioni per introdurre abbastanza singole cellule per il sequenziamento. La tecnologia snRNA-seq basata su goccioline recentemente sviluppata (cioè la piattaforma 10x Chromium) consente lo studio delle differenze biologiche tra i singoli nuclei 11,12. snRNA-seq detiene un vantaggio rispetto a scRNA-seq per le cellule di grandi dimensioni (>30 μm), che potrebbero non essere catturate in Gel Bead in Emulsions (GEMs), nonché una migliore compatibilità con dissociazione estesa e / o conservazione prolungata 13,14,15.
L'eterogeneità, il numero di cellule neuronali e altre cellule arricchite nel SNS cardiaco sono aspetti importanti per la caratterizzazione dell'ANS negli stati di salute e malattia. Inoltre, l'innervazione specifica dell'organo o della regione da parte di ciascun ganglio simpatico contribuisce alla complessità del SNS. Inoltre, i gangli cervicali, stellati e toracici della catena simpatica hanno dimostrato di innervare diverse regioni del cuore16. Pertanto, è necessario eseguire l'analisi a nucleo singolo di cellule gangliari derivate da singoli gangli per studiare la loro architettura biologica.
Lo snRNA-seq basato su goccioline consente la profilazione dell'espressione a livello di trascrittoma per un pool di migliaia di cellule da più campioni contemporaneamente con costi inferiori rispetto alle piattaforme di sequenziamento basate su piastre. Questo approccio consente a snRNA-seq basato su goccioline di essere più adatto per la classificazione del fenotipo cellulare e l'identificazione di nuove sottopopolazioni di cellule all'interno del SCG e del StG. In particolare, questo protocollo fornisce un approccio graduale conciso per l'identificazione, l'isolamento e il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo dei gangli cardiaci estrinseci simpatici, un metodo che ha il potenziale per un'ampia applicazione negli studi sulla caratterizzazione dei gangli che innervano altri organi e tessuti correlati in salute e malattia.
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Protocol
Questo protocollo descrive tutti i passaggi necessari per lo snRNA-seq dei gangli murini cervicali e/o cervicotoracici (stellati). Sono stati utilizzati topi C57BL / 6J femminili e maschili (15 settimane, n = 2 per ogni sesso). Un ulteriore mouse Wnt1-Cre;mT/mG è stato utilizzato per visualizzare i gangli per scopi di dissezione17,18. Questo mouse aggiuntivo è stato generato dall'incrocio di un mouse B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J e di un mouse B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dal NIH e approvata dal Comitato etico animale dell'Università di Leida (numero di licenza AVD1160020185325, Leida, Paesi Bassi). Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, le attrezzature, il software e gli animali utilizzati nel protocollo.
1. Preparativi
NOTA: tutti i passaggi vengono eseguiti in un armadio del flusso di coltura cellulare.
- Pulire pinze e forbici immergendo gli strumenti in etanolo al 70% per 20 min.
- Preparare il mezzo gangliare costituito da Neurobasal Medium integrato con B-27 plus (1x), L-glutammina (2 mM) e 1% Antibiotico-Antimicotico. Preriscaldare il mezzo gangliare a temperatura ambiente.
- Preparare la soluzione di digestione: 0,25% di tripsina-EDTA (1:1) e 1.400 U/mL di collagenasi di tipo 2 disciolta nel mezzo gangliare.
- Preparare tampone di lavaggio cellulare fresco e freddo (4 °C) (0,4% albumina sierica bovina [BSA]) e tampone di lisi (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 e detergente non ionico allo 0,1%, 40 U/mL RNAsi in acqua priva di nucleasi) per l'isolamento del nucleo.
- Preparare il tampone di lavaggio del nucleo (1x soluzione salina tamponata con fosfato [PBS] con BSA al 2,0% e inibitore della RNasi 0,2U/μL).
- Preparare il tampone di colorazione ST (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 2% BSA, 0,02% Tween-20 in acqua priva di nucleasi).
2. Dissezione dei gangli cervicali superiori del topo adulto (SCG)
- Eutanasia dei topi e tenerli sul ghiaccio.
NOTA: Nel presente studio, un totale di 4 topi C57BL6 / J sono stati eutanasizzati dall'asfissia di CO2 . In alternativa, l'isoflurano può essere utilizzato seguito da dissanguamento quando è necessario raccogliere una grande quantità di sangue per altri scopi di studio. - Fissare il mouse su un pannello di dissezione con perni e bagnarlo con etanolo al 70% per ridurre al minimo la dispersione della pelliccia (la rasatura non è necessaria).
- Sotto uno stereomicroscopio, aprire la pelle della regione del collo facendo un taglio della linea mediana con le forbici, spostare le ghiandole sottomandibolari da parte e rimuovere il muscolo sternomastoideo per esporre e localizzare l'arteria carotide comune e la sua biforcazione (Figura 1A, B, vedi freccia).
- Sezionare la biforcazione dell'arteria carotide destra e sinistra e il tessuto ad essa collegato. Trasferire ogni pezzo di tessuto sezionato in una capsula di Petri separata di 3,5 cm contenente PBS freddo.
- Cerca l'SCG attaccato alla biforcazione carotidea. Pulire ulteriormente l'SCG rimuovendo l'arteria e altro tessuto attaccato nella capsula di Petri (Figura 1E).
3. Dissezione dei gangli stellati del topo adulto (StG)
- Per sezionare lo StG, fai un taglio della linea mediana nell'addome, seguito dall'apertura del diaframma e della parete toracica ventrale.
- Rimuovere il cuore e i polmoni per esporre il torace dorsale. Cerca l'anterolaterale StG sinistro e destro al musculus colli longus (MCL) a livello della prima costola (Figura 1C, D, indicata da linee tratteggiate).
- Sezionare sia l'StG sinistro che quello destro con una pinza e trasferirli separatamente su piastre di Petri da 3,5 cm contenenti PBS freddo (Figura 1F).
4. Isolamento e crioconservazione delle cellule gangliari di topo
I passaggi da 4 a 6 sono riepilogati nella Figura 2.
- Trasferire con cura tutti i singoli SCG e StG per separare i tubi microcentrifuga da 1,5 ml con pinza.
NOTA: non utilizzare punte di pipette per trasferire i gangli perché i gangli sono inclini ad aderire alla parete delle punte delle pipette di plastica. - Aggiungere 500 μL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% a ciascun tubo di microcentrifuga e incubare in un bagno d'acqua agitato a 37 °C per 40 minuti.
NOTA: Questo passaggio ha lo scopo di facilitare la digestione e il rilascio cellulare in seguito nella soluzione di collagenasi di tipo 2. - Preparare un tubo da 15 ml contenente 5 mL di substrato gangliare per ciascun campione. Lasciare che i gangli si depositino sul fondo dei tubi della microcentrifuga. Raccogliere il surnatante, che contiene pochissime cellule gangliari, trasferire il surnatante ai tubi da 15 ml preparati ed etichettare ogni tubo. In alternativa, per risparmiare un po 'di tempo, aspirare il surnatante tripsina-EDTA senza raccolta poiché pochissime cellule dissociate possono essere rilevate in esso.
NOTA: Una piccola quantità di soluzione di tripsina-EDTA (~10-30 μL) può essere lasciata nel tubo microcentrifuga per evitare la rimozione dei gangli. Evitare il pipettaggio in questa fase perché potrebbe danneggiare i gangli e portare a una bassa produzione di cellule gangliari in seguito. - Aggiungere 500 μL di soluzione di collagenasi di tipo 2 in ogni tubo di microcentrifuga e incubare a bagno d'acqua agitato a 37 °C per 35-40 minuti. Prova a risospendare il ganglio dopo 35 minuti; se il ganglio è ancora intatto e non si dissocia, prolungare il tempo di incubazione o aumentare la concentrazione di collagenasi di tipo 2, se necessario.
NOTA: Il tempo di incubazione potrebbe variare a seconda delle dimensioni del ganglio. - Risospesciare i gangli in soluzione di collagenasi tubando su e giù ~ 10 volte o fino a quando i grumi di tessuto non vengono più rilevati.
- Trasferire la sospensione cellulare sul tubo da 15 ml precedentemente utilizzato che contiene il terreno di coltura dei gangli e la sospensione di tripsina-EDTA dallo stesso ganglio. Ruotare la sospensione cellulare con una centrifuga a rotore a benna oscillante per 10 minuti, 300 × g a temperatura ambiente. Scartare con attenzione il surnatante cellulare.
NOTA: Poiché le cellule gangliari sono dissociate da un singolo ganglio, il pellet cellulare potrebbe essere troppo piccolo per essere rilevato a occhio; una piccola quantità di surnatante può essere lasciata nel tubo per evitare la rimozione accidentale del pellet cellulare. - Risospese le cellule gangliari in 270 μL di siero bovino fetale (FBS, bassa endotossina) e trasferire ogni sospensione cellulare-FBS in un crioviale da 1 mL.
- Per contare le cellule, mescolare 5 μL della sospensione cellulare gangliare con 5 μL di colorante blu tripano allo 0,4% e caricare la miscela in un emocitometro. Contare il numero totale e di cellule vive al microscopio.
NOTA: La vitalità cellulare (conteggio delle cellule vive/conta cellulare totale = vitalità %) è solitamente superiore al 90% con questo protocollo di dissociazione. Il conteggio delle cellule vive di un singolo ganglio (SCG o StG) di solito rientra nell'intervallo di 9.000-60.000 cellule quando il ganglio è isolato da un topo di età compresa tra 12 e 16 settimane. - Aggiungere 30 μL di dimetilsolfossido (DMSO) a ciascuna sospensione cellulare-FBS nei crioviali, mescolare bene e trasferire i crioviali in un contenitore di congelamento cellulare, che viene mantenuto a temperatura ambiente. Conservare il contenitore crioviale caricato a -80 °C durante la notte e trasferire i crioviali in azoto liquido il giorno successivo per una conservazione a lungo termine prima del sequenziamento.
5. Isolamento del nucleo
NOTA: L'SCG sinistro e destro isolati da quattro topi (in totale 8 campioni) sono stati utilizzati come esempio nella seguente preparazione all'isolamento del nucleo e al sequenziamento. Tenere tutto sul ghiaccio durante l'intera procedura. A causa dell'invisibilità dei piccoli pellet a nucleo, una centrifuga con secchi oscillanti è altamente raccomandata per facilitare la rimozione del surnatante durante l'intera procedura.
- Preparare tubi da 15 mL con un colino (30 μm) sulla parte superiore e prerinsere il colino con 1 mL del mezzo gangliare.
- Estrarre i crioviali dall'azoto liquido e scongelarli immediatamente a bagnomaria a 37 °C. Quando un piccolo pellet di ghiaccio viene lasciato nella crioviale, togliere le crioviali dal bagno d'acqua.
- Recuperare le cellule gangliari facendo cadere 1 mL del mezzo gangliare in ogni crioviale mentre si agita attentamente a mano. Facoltativo: per valutare il recupero cellulare, mescolare la sospensione cellulare dopo il recupero e prelevare 5 μL di sospensione cellulare per il conteggio delle cellule vive, come descritto nel passaggio 4.8.
- Caricare ogni sospensione di cellule gangliari su un filtro separato (preparato nella fase 5.1) e risciacquare ogni colino con 4-5 ml di mezzo gangliare.
- Centrifugare la sospensione cellulare tesa per 5 minuti a 300 × g, rimuovere accuratamente il surnatante e risospesere le cellule in 50 μL di tampone di lavaggio cellulare.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrifugale DNA/RNA da 0,5 mL a basso legame.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 5 min a 4 °C.
- Rimuovere 45 μL del surnatante senza toccare il fondo del tubo per evitare di spostare il pellet cellulare.
- Aggiungere 45 μL di Lysis Buffer refrigerato e pipettare delicatamente su e giù utilizzando una punta della pipetta da 200 μL.
- Incubare le cellule per 8 minuti sul ghiaccio.
- Aggiungere 50 μL di tampone di lavaggio a nucleo freddo a ciascun tubo. Non mescolare.
- Centrifugare la sospensione del nucleo a 600 × g per 5 min a 4 °C.
- Rimuovere 95 μL del surnatante senza interrompere il nucleo del pellet.
- Aggiungere 45 μL di tampone di lavaggio a nucleo refrigerato al pellet. Opzionale: prendere 5 μL di sospensione del nucleo, mescolare con 5 μL di 0,4% di tripano blu per contare e controllare la qualità dei nuclei al microscopio con un emocitometro.
- Centrifugare la sospensione del nucleo a 600 × g per 5 min a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante senza toccare il fondo del tubo per evitare di spostare il nucleo pellet.
6. Nucleus barcoding con hashtag oligos (HTO) e multiplexing
NOTA: le fasi di colorazione HTO sono state modificate e ottimizzate per l'etichettatura nucleare di quantità molto basse di nuclei (gangliari) secondo la precedente applicazione nel tessuto corticale di Gaublomme et al.15.
- Aggiungere 50 μL di tampone ST-SB al pellet del nucleo, pipettare delicatamente 8-10 volte fino a quando i nuclei non sono completamente risospesi.
- Aggiungere 5 μL di reagente fc blocking per 50 μL della miscela ST-SB/nuclei e incubare per 10 minuti sul ghiaccio.
- Aggiungere 1 μL (0,5 μg) di anticorpo hashtag a nucleo singolo per tubo del mix ST-SB/nuclei e incubare per 30 minuti sul ghiaccio.
NOTA: tempi di incubazione più brevi portano a una minore efficienza dell'etichettatura degli hashtag, come dimostrato nei risultati rappresentativi. - Aggiungere 100 μL di ST-SB a ciascun tubo. Non mescolare.
- Centrifugare la sospensione del nucleo per 5 min, 600 × g a 4 °C.
- Rimuovere 145 μL del surnatante senza interrompere il nucleo pellet.
- Ripetere i passaggi 6.4 e 6.5. Rimuovere il surnatante il più possibile senza toccare il fondo del tubo per evitare di spostare il nucleo pellet.
- Risospendare il nucleo del pellet in 50 μL di ST-SB e mescolare delicatamente i nuclei.
- Prendi 5 μL della sospensione del nucleo e mescolala con 5 μL di 0,4% di tripano blu per contare i nuclei al microscopio. Vedere la Figura 3A per un'immagine rappresentativa di nuclei mescolati con tripano blu e caricati in un emocitometro.
- Centrifugare la sospensione del nucleo per 5 min a 600 × g a 4 °C.
- Sospendere i nuclei in ST-SB per raggiungere una concentrazione target di nucleo di 1.000-3.000 nuclei/ μL per ciascun campione in base alla corrispondente conta dei nuclei.
- Raggruppare i campioni per ottenere il numero desiderato di celle.
NOTA: Ad esempio, in questo esperimento, 8 campioni sono stati ugualmente raggruppati per ottenere un totale di 25.000 nuclei per procedere immediatamente a 10x Genomics Chromium e snRNA-seq in seguito. Il numero di nuclei di solito rientra nell'intervallo di 6.000-40.000 cellule quando il ganglio è isolato da un topo di età compresa tra 12 e 16 settimane. Solo circa la metà dei nuclei caricati totali può essere catturata da snRNA-seq a base di goccioline. Ad esempio, è stata preparata una miscela di 25.000 nuclei per garantire la cattura di 10.000 nuclei, necessaria per un'ulteriore preparazione e sequenziamento della libreria.
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Representative Results
Analisi del controllo qualità della preparazione della libreria di cDNA a nucleo singolo e snRNA-seq
I risultati rappresentativi descrivono i risultati del sequenziamento di 10.000 nuclei catturati in un singolo pool con una libreria di espressione genica di 25.000 letture / nucleo e una libreria di hashtag di 5.000 letture / nucleo. La Figura 3B illustra i risultati del controllo di qualità del cDNA del 1° filamento, della libreria di espressione genica (GEX) e della libreria HTO, che sono stati controllati con Bioanalyzer. I cDNA derivati dall'HTO dovrebbero essere inferiori a 180 bp, mentre i cDNA derivati dall'mRNA sono più grandi di 300 bp. Una libreria GEX di alta qualità può essere rilevata come un ampio picco da 300 a 1.000 bp e la libreria HTO viene rilevata come un picco specifico di 194 bp. Cell Ranger è stato utilizzato per il demultiplexing, la generazione di file fastq e l'allineamento di lettura per impostazione predefinita. Il pacchetto Seurat R19 è stato successivamente utilizzato per il controllo di qualità e le analisi a valle.
Il demultiplexing dei dati snRNA-seq è stato eseguito identificando gli HTC utilizzando la strategia di demultiplexing integrata di Seurat. La capacità di demultiplexing per ogni HTO è stata visualizzata per la prima volta con i file di espressione HTO (Figura supplementare S1). Nella mappa di calore della Figura 4A, i singoletti sono rilevati come nuclei con espressione HTO specifica, mentre doppietti e negativi mostrano un'espressione non specifica di HTO multipli o assenti. Da notare, circa il 33% dei nuclei sono stati rilevati come negativi utilizzando un approccio di incubazione degli anticorpi HTO di 10 minuti. Il prolungamento del tempo di incubazione (fase 6.3) da 10 min a 30 min in un esperimento successivo ha rivelato una notevole diminuzione dei nuclei etichettati negativamente (Figura supplementare S2). Questi risultati indicano che prolungare il tempo di incubazione degli anticorpi può migliorare l'efficienza degli hashtag.
I grafici di violino nella Figura 4B-D dimostrano il numero di geni (nFeature_RNA), il numero di identificatori molecolari univoci (UMI) (nCount_RNA) e la percentuale di conteggi mitocondriali (percent.mt) all'interno del set di dati snRNA-seq per identificare valori anomali e nuclei di bassa qualità. I nuclei sono stati inclusi nell'analisi a valle solo quando sono stati soddisfatti i seguenti criteri: i) nFeature_RNA > 500 e nCount_RNA < 20.000; ii) percent.mt < 5%; iii) il singolo nucleo ha mostrato una chiara espressione di un singolo HTO. I conteggi dell'espressione genica sono stati normalizzati utilizzando il metodo predefinito in Seurat: 875 (2,71%) geni sono stati rilevati come geni altamente variabili (Figura 4E). snRNA-seq GEX è stato scalato, è stato eseguito e il diagramma del gomito è stato utilizzato per valutare l'inclusione dei componenti principali che sarebbero stati utilizzati per le analisi a valle (Figura 4F). In totale, sono stati inclusi 18 PC. Il clustering è stato eseguito con una risoluzione di 0,4.
I nuclei sono stati raggruppati e la riduzione dimensionale (UMAP) è stata eseguita per la visualizzazione dei 12 singoli cluster (Figura 5A). La conta genica grezza mediana per cluster varia tra 991,5 e 4.586 (Figura supplementare S3A, B). La visualizzazione della divisione degli anticorpi HTO all'interno dell'UMAP rivela una chiara distribuzione dei gangli, indicando che tutti i cluster sono presentati in ciascun ganglio (Figura 5B). Per convalidare l'accuratezza della segregazione del campione HTO, è stata valutata l'espressione di X Inactive Specific Transcript (Xist, espressa nel cromosoma X femminile inattivo) per identificare i campioni maschili e i campioni femminili (Figura 5C). L'espressione di Xist era conforme all'etichettatura dell'hashtag, mostrando che i campioni etichettati HTO 1-4 erano campioni femminili e i campioni etichettati HTO 5-8 erano campioni maschili. Ciò suggerisce che l'etichettatura HTO curata è altamente specifica.
Per verificare ulteriormente la qualità e la risoluzione dei dati di sequenziamento con il presente metodo, sono stati prima esaminati alcuni trascritti chiave dei neuroni simpatici. I risultati mostrano la presenza di neuroni simpatici che esprimono altamente Th, Dbh e Snap25 nei cluster 5 e 7 (Figura 5D-F). Le cellule gliali satelliti sono state rilevate con l'espressione di S100b in cluster 0-3 (Figura 5G)20. Le cellule endoteliali sono state rilevate nel cluster 4 con un'alta espressione di Pecam1 (Figura 5H) e cellule stromali nel cluster 8 con un'alta espressione di Acta2 (Figura 5I). Questi risultati supportano la cattura nucleica di successo delle cellule neuronali, satelliti gliali, endoteliali e stromali del ganglio simpatico utilizzando snRNA-seq.
Figura 1: Dissezione di gangli cervicali superiori di topo adulto e gangli stellati. (A) Immagine brightfield della posizione del SCG. (B) Per facilitare la visualizzazione, è stato utilizzato un mouse Wnt1Cre;mT/mG. Gli asterischi indicano l'SCG (eGFP+), le punte di freccia indicano la biforcazione dell'arteria carotide. Pannello di sinistra, immagine a contrasto di fase; pannello di destra, immagine fluorescente. (C) Immagine Brightfield della posizione del StG. (D) Gli asterischi indicano l'StG (eGFP+), le linee tratteggiate indicano l'MCL. Pannello di sinistra, immagine a contrasto di fase; pannello di destra, immagine fluorescente. (E) I gangli sezionati vengono trasferiti separatamente in una capsula di Petri per un'ulteriore pulizia sotto uno stereomicroscopio. (F) Pannello di sinistra, l'SCG sezionato con l'arteria carotide ancora attaccata. Il contorno tratteggiato indica l'SCG. Pannello di destra, il StG sezionato e pulito ha la forma di un triangolo invertito, come indicato dal contorno tratteggiato. Barra della scala = 1.000 μm. Abbreviazioni: SCG = gangli cervicali superiori; StG = gangli stellati; MCL = musculus colli longus; eGFP = proteina fluorescente verde potenziata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Flusso di lavoro di preparazione del campione e multiplexing basato sulla colorazione dell'hashtag per snRNA-seq. Il diagramma di flusso illustra i passaggi dalla dissociazione delle cellule gangliari (arancione), l'isolamento del nucleo (blu) e la colorazione e il multiplexing degli anticorpi hashtag (verde) che vengono effettuati per snRNA-seq. Abbreviazioni: FBS = siero bovino fetale; ST-SB = tampone di colorazione ST; snRNA-seq = sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Controllo di qualità dell'isolamento del nucleo e preparazione della libreria di espressione genica. (A) Immagine a contrasto di fase dei nuclei colorati con HTO. I nuclei sono indicati con frecce. Barra di scala = 100 μm. (B) Risultati del bioanalizzatore di cDNA a 1° filamento (in alto), libreria GEX (al centro) e libreria HTO (in basso). Abbreviazioni: GEX = espressione genica; HTO = hashtag oligo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Controllo di qualità dell'efficienza dell'etichettatura oligo hashtag e controllo di qualità di snRNA-seq. (A) Heatmap della colorazione HTO ottenuta con un tempo di incubazione di 10 min con anticorpi hashtag. (B-D) Grafici a violino di metriche di controllo qualità che descrivono il numero di geni (nFeature_RNA, B); il numero di UMI (nCount_RNA, C); la percentuale di conta mitocondriale (percent.mt, D). (E) Dei 32.285 geni totali sequenziati, 875 (2,71%) sono stati identificati come caratteristiche altamente variabili come visualizzato nel grafico a dispersione. (F) Diagramma a gomito dei PC per determinare l'inclusione del segnale reale utilizzato per il clustering. Abbreviazioni: snRNA-seq = sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo; HTO = hashtag oligo; PC = componenti principali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risultati rappresentativi dell'analisi del grafico SnRNA-seq. (A) UMAP del set di dati cluster snRNA-seq. (B) Grafico UMAP che visualizza la distribuzione dei campioni HTO raggruppati. (C) Trama per violino che convalida campioni femminili (alta espressione Xist) dopo demultiplexing. (D-I) Grafici UMAP che mostrano geni marcatori selezionati; i cluster esprimono altamente i geni corrispondenti che sono indicati all'interno dei cerchi rossi: D-F, Neuroni simpatici (Th, Dbh, Snap25); G) cellule gliali satelliti (S100b); H) cellule endoteliali (Pecam1); (I) Cellule stromali (Acta2). Abbreviazioni: snRNA-seq = sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo; HTO = hashtag oligo; UMAP = approssimazione e proiezione uniforme della varietà. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare S1: Metriche di controllo della qualità di un risultato rappresentativo di sequenziamento a nucleo singolo. Profili di espressione HTO di singoli campioni che visualizzano la capacità di demultiplexing degli anticorpi hashtag utilizzati. Abbreviazione: HTO = hashtag oligo. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Mappa termica dell'espressione HTO dei campioni successivi incubati con anticorpi HTO per 30 min. Il confronto del numero di nuclei con marca negativa dopo demultiplexing HTO con la Figura 4A mostra un netto miglioramento dell'etichettatura del nucleo dopo aver prolungato il tempo di incubazione degli anticorpi. Abbreviazione: HTO = hashtag oligo. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S3: Mediana e quantili di espressione genica per cluster. (A) Espressione genica mediana non zero grezza di ciascun cluster. (B) Statistiche descrittive dell'espressione genica grezza diversa da zero di ciascun cluster. Q1: 25° percentile, Q3: 75° percentile. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Qui, viene descritto un protocollo dettagliato che si concentra su i) la dissezione dei gangli simpatici cervicali e stellati superiori del topo adulto, ii) l'isolamento e la crioconservazione delle cellule gangliari, iii) l'isolamento del nucleo e iv) il nucleo-barcoding con etichettatura HTO per scopi multiplexing e snRNA-seq.
Con questo protocollo, le cellule gangliari simpatiche possono essere facilmente ottenute dissociando i singoli gangli usando tripsina e collagenasi comunemente usate. La conservazione a lungo termine delle cellule gangliari isolate è anche facilmente ottenibile congelando le cellule in FBS integrate con il 10% di DMSO, che ha mostrato un'alta qualità di recupero dopo lo scongelamento. Inoltre, rispetto al sequenziamento convenzionale dell'RNA a singola cellula, l'uso di snRNA-seq a base di goccioline di singoli gangli simpatici murini combinato con l'applicazione di codifica a barre nucleo basata sulla colorazione HTO presenta i seguenti vantaggi: i) i campioni possono essere conservati a lungo fino a quando tutti i campioni sono pronti per un ulteriore isolamento del nucleo; ii) nuclei di buona qualità isolati da più gangli di piccole dimensioni possono essere raggruppati per il sequenziamento senza un effetto batch causato da una preparazione separata del campione; iii) la capacità di risalire alla distinta origine gangliare dopo il sequenziamento utilizzando codici a barre del nucleo; e iv) economicità, poiché è necessaria una sola preparazione della biblioteca. È importante sottolineare che il protocollo di isolamento e coltura cellulare descritto fornisce un unico metodo uniforme sia per i gangli cervicali murini che per quelli stellati ed è potenzialmente applicabile ad altri gangli, come i gangli della radice dorsale e altre specie, ad esempio i gangli umani.
Uno dei principali vantaggi di scRNA-seq è la capacità di identificare (nuovi) tipi di cellule e di rivelare rare popolazioni cellulari che non possono essere rilevate dall'RNA-seq di massa. La piattaforma scRNA-seq basata su goccioline facilita la cattura di più cellule. Può quindi fornire una visione aggregata dei (sotto)tipi cellulari e dell'eterogeneità trascrizionale di una grande popolazione cellulare rispetto a una piattaforma di sequenziamento basata su piastre. Tuttavia, la piattaforma basata su goccioline (ad esempio, 10x Chromium) non è adatta per cellule di dimensioni superiori a 50 μm, limitandone l'applicazione in cellule di grandi dimensioni come i neuroni umani (~ 100 μm). La disponibilità della tecnica snRNA-seq supera questo inconveniente a causa delle piccole dimensioni di un nucleo. Inoltre, snRNA-seq è un metodo utile per studi di espressione genica di cellule altamente interconnesse e a basso rendimento come neuroni e tessuti congelati.
Sebbene sia possibile isolare direttamente i nuclei dai tessuti senza previa dissociazione cellulare, è stato utile per la resa adottare un metodo di isolamento del nucleo in due fasi che prima dissocia il ganglio in singole cellule (che possono essere conservate in azoto liquido) seguito dall'isolamento del nucleo. A causa delle piccole dimensioni di un ganglio simpatico di topo, è stato scoperto che sono stati ottenuti più nuclei utilizzando un metodo di isolamento del nucleo in due fasi rispetto a un approccio di isolamento del nucleo in un solo passaggio. Il controllo di qualità del cDNA, della libreria e delle analisi di sequenziamento indica una buona qualità dei nuclei/RNA. Inoltre, la logistica è migliorata, poiché i campioni possono essere raccolti e conservati in diversi punti temporali prima del sequenziamento collettivo. L'analisi a nucleo singolo ha anche rivelato il successo del recupero e della cattura di neuroni e cellule gliali, suggerendo che l'approccio descritto di isolamento del nucleo in due fasi potrebbe essere più adatto per l'applicazione in piccoli tessuti.
Un altro vantaggio di questo protocollo è il multiplexing con anticorpi a barre21. Il ganglio simpatico del topo è un tessuto minuscolo (dimensione media 0,1 mm3) e il basso numero di cellule derivate da un singolo ganglio è insufficiente per il sequenziamento basato su goccioline da solo. Tuttavia, il raggruppamento di diversi gangli di topi diversi o gangli diversi dello stesso topo causerà la perdita di informazioni individuali sul topo o di singole informazioni sul ganglio. Come soluzione, la fase di colorazione HTO è facile da eseguire e consente l'etichettatura con codice a barre di nuclei derivati da topi diversi o gangli diversi prima del raggruppamento del nucleo. L'accuratezza del demultiplexing HTO è verificata in questo protocollo dall'espressione Xist abbinata in popolazioni di nuclei femminili noti. Il multiplexing del nucleo con anticorpi con codice a barre, quindi, riduce gli effetti del lotto e abbassa il costo del sequenziamento.
Una potenziale limitazione di snRNAseq potrebbe essere che ci possono essere differenze tra la composizione dell'RNA nel nucleo e il citoplasma a causa della presenza naturale di trascritti nascenti nel nucleo, associati alla risposta precoce alle attività neuronali22,23. Il nucleo e il citoplasma possono anche differire nei trascritti a seconda dello stato del ciclo cellulare24. Sono stati rilevati meno trascritti in un singolo nucleo (~ 7.000 geni) che in una cellula (~ 11.000 geni)14. Pertanto, scRNA-seq e snRNA-seq possono produrre risultati diversi a livello di trascrizione. Tuttavia, il confronto tra scRNA-seq e snRNA-seq ha dimostrato una capacità simile di discriminare i tipi di cellule neuronali del tessuto cerebrale14. Per migliorare la discriminazione tra tipi di cellule o sottotipi altamente simili da snRNA-seq, potrebbero essere necessari più nuclei per compensare la minore capacità di rilevamento genico rispetto a scRNA-seq. Inoltre, sebbene l'accuratezza del demultiplexing HTO sia sufficiente, la perdita di alcuni dati è inevitabile in quanto non tutti i nuclei mostrano specificità HTO. Un'ulteriore ottimizzazione dell'incubazione degli anticorpi potrebbe ridurre al minimo il numero di nuclei con doppia o negativa espressione di HTC.
Nel loro insieme, questo protocollo fornisce la procedura sperimentale per il sequenziamento dei nuclei neuronali dai gangli simpatici mediante un flusso di lavoro facile da seguire a partire dall'isolamento gangliare alla preparazione dei nuclei a basso input di cellule, seguito dall'etichettatura del nucleo basata sulla colorazione HTO per snRNA-seq. Il protocollo fornisce una panoramica dettagliata di tutti i passaggi chiave che possono essere facilmente eseguiti e applicati a vari gangli in murine e altre specie.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Ringraziamo Susan L. Kloet (Dipartimento di Genetica Umana, LUMC, Leida, Paesi Bassi) per il suo aiuto nella progettazione sperimentale e nelle discussioni utili. Ringraziamo Emile J. de Meijer (Dipartimento di Genetica Umana, LUMC, Leida, Paesi Bassi) per l'aiuto con l'isolamento dell'RNA a nucleo singolo e la preparazione della libreria per il sequenziamento. Questo lavoro è supportato dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) [016.196.346 to M.R.M.J.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and reagents | |||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 0.4% trypan blue dye | Bio-Rad | 1450021 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004176 | use 1,400 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 67685 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| Fetal bovine serum (low endotoxin) | Biowest | S1810-500 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Cell wash buffer |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Cell wash buffer |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Nucleus Lysis buffer |
| Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent) | Sigma-Aldrich | 74385 | Nucleus Lysis buffer |
| Nuclease free water (not DEPC-treated) | Invitrogen | AM9937 | Nucleus Lysis buffer |
| Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus Lysis buffer |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | Nucleus Lysis buffer |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | Nucleus Lysis buffer |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Nucleus wash |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Nucleus wash |
| Protector RNase Inhibitor,40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus wash |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Calcium chloride solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Nuclease free water (not DEPC treated) | Invitrogen | AM9937 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Sodium Chloride Solution, 5M | Sigma-Aldrich | 59222C | ST staining buffer (ST-SB) |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST staining buffer (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody | Biolegend | 682205 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody | Biolegend | 682207 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody | Biolegend | 682209 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody | Biolegend | 682225 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody | Biolegend | 682227 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody | Biolegend | 682229 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody | Biolegend | 682231 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody | Biolegend | 682233 | Hashtag antibody |
| TruStain FcX (human) | Biolegend | 422302 | FC receptor blocking solution |
| Equipment and consumables | |||
| Bright-Line Hemacytometer | Merck | Z359629-1EA | |
| Centrifuge 5702/R A-4-38 | Eppendorf | EP022629905 | |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | EP0030108035-250EA | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish | Corning | 351008 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 10773501 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine science tools | 11252-40 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine science tools | 14091-09 | |
| Ice Pan, rectangular 4 L Orange | Corning | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Leica | Microscope | |
| Moria MC50 Scissors | Fine science tools | 15370-50 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine science tools | 15012-12 | |
| Olympus CK2 ULWCD | Olympus | Microscope | |
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| Preseparation Filters (30 µm) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| Shaking water bath | GFL | 1083 | |
| Silicon plate | RubberBV | 3530 | Dissection board |
| Software and packages | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| R programming | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #007576 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Code for the data analysis | |||
| https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE |
References
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