Summary
Dit protocol beschrijft de gedetailleerde, low-input monstervoorbereiding voor single-nucleus sequencing, inclusief de dissectie van muis superieure cervicale en stellate ganglia, celdissociatie, cryopreservatie, nucleus isolatie en hashtag barcoding.
Abstract
Het cardiale autonome zenuwstelsel is cruciaal bij het beheersen van de hartfunctie, zoals hartslag en cardiale contractiliteit, en is verdeeld in sympathische en parasympathische takken. Normaal gesproken is er een balans tussen deze twee takken om de homeostase te behouden. Hartaandoeningen zoals myocardinfarct, hartfalen en hypertensie kunnen echter de remodellering van cellen veroorzaken die betrokken zijn bij cardiale innervatie, wat gepaard gaat met een ongunstige klinische uitkomst.
Hoewel er enorme hoeveelheden gegevens zijn voor de histologische structuur en functie van het cardiale autonome zenuwstelsel, is de moleculair biologische architectuur in gezondheid en ziekte in veel opzichten nog steeds raadselachtig. Nieuwe technologieën zoals single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) zijn veelbelovend voor de genetische karakterisering van weefsels met eencellige resolutie. De relatief grote omvang van neuronen kan echter het gestandaardiseerde gebruik van deze technieken belemmeren. Hier maakt dit protocol gebruik van droplet-gebaseerde single-nucleus RNA-sequencing (snRNA-seq), een methode om de biologische architectuur van cardiale sympathische neuronen in gezondheid en ziekte te karakteriseren. Een stapsgewijze aanpak is aangetoond om snRNA-seq uit te voeren van de bilaterale superieure cervicale (SCG) en stellate ganglia (StG) ontleed van volwassen muizen.
Deze methode maakt langdurige monsterbewaring mogelijk, met behoud van een adequate RNA-kwaliteit wanneer monsters van meerdere individuen / experimenten niet allemaal tegelijk binnen een korte periode kunnen worden verzameld. Het coderen van de kernen met hashtag oligo's (HTO's) maakt demultiplexing en het traceren van verschillende ganglionische monsters na sequencing mogelijk. Latere analyses onthulden succesvolle kernopname van neuronale, satellietgliale en endotheelcellen van de sympathische ganglia, zoals gevalideerd door snRNA-seq. Samenvattend biedt dit protocol een stapsgewijze benadering voor snRNA-seq van sympathische extrinsieke cardiale ganglia, een methode die het potentieel heeft voor bredere toepassing in studies naar de innervatie van andere organen en weefsels.
Introduction
Het autonome zenuwstelsel (ANS) is een cruciaal onderdeel van het perifere zenuwstelsel dat de homeostase van het lichaam handhaaft, inclusief de aanpassing aan omgevingsomstandigheden en pathologie1. Het is betrokken bij de regulatie van meerdere orgaansystemen in het hele lichaam, zoals het cardiovasculaire, respiratoire, spijsverterings- en endocriene systeem. De ANS is verdeeld in sympathieke en parasympathische takken. Spinale takken van het sympathische zenuwstelsel synaps in ganglia van de sympathische keten, bilateraal gelegen in een paravertebrale positie. De bilaterale cervicale en thoracale ganglia, met name de StG, zijn belangrijke componenten die deelnemen aan cardiale sympathische innervatie. In ziektetoestanden, zoals cardiale ischemie, kan neuronale remodellering optreden, wat resulteert in een sympathische overdrive2. De neuronale remodellering is aangetoond in meerdere histologische studies bij mensen en verschillende andere diersoorten 3,4,5,6. Een gedetailleerde biologische karakterisering van cardiale ischemie-geïnduceerde neuronale remodellering in cardiale sympathische ganglia ontbreekt momenteel, en de fundamentele biologische kenmerken van gespecialiseerde neuronale celtypen of subtypen binnen het cardiale sympathische zenuwstelsel (SNS) zijn nog niet volledig bepaald in gezondheid en ziekte7.
Nieuwe technologieën, zoals scRNA-seq, hebben poorten geopend voor de genetische karakterisering van kleine weefsels op een eencellig niveau 8,9. De relatief grote omvang van neuronen kan echter het geoptimaliseerde gebruik van deze eencellige technieken bij mensen belemmeren10. Bovendien vereist single-cell sequencing een hoge doorvoer van cellen om een voldoende celnummer te herstellen als gevolg van een hoog verlies in het sequencingproces. Dit kan een uitdaging zijn bij het bestuderen van kleine weefsels die moeilijk in één sessie te vangen zijn en meerdere monsters vereisen om voldoende afzonderlijke cellen te introduceren voor sequencing. De recent ontwikkelde druppelgebaseerde snRNA-seq-technologie (d.w.z. het 10x Chromium-platform) maakt de studie van biologische verschillen tussen enkele kernen11,12 mogelijk. snRNA-seq heeft een voordeel ten opzichte van scRNA-seq voor grote cellen (>30 μm), die mogelijk niet worden gevangen in Gel Bead in Emulsions (GEMs), evenals verbeterde compatibiliteit met uitgebreide dissociatie en / of langdurige conservering 13,14,15.
Heterogeniteit, het aantal neuronale cellen en andere cellen verrijkt in de cardiale SNS zijn belangrijke aspecten voor de karakterisering van de ANS in gezondheids- en ziektetoestanden. Daarnaast draagt de orgaan- of regiospecifieke innervatie door elk sympathisch ganglion bij aan de complexiteit van het SNS. Bovendien is aangetoond dat cervicale, stellaire en thoracale ganglia van de sympathische keten verschillende regio's van het hart innerveren16. Daarom is het noodzakelijk om single-nucleus analyse van ganglionaire cellen afgeleid van individuele ganglia uit te voeren om hun biologische architectuur te bestuderen.
Druppelgebaseerde snRNA-seq maakt transcriptoombrede expressieprofilering mogelijk voor een pool van duizenden cellen uit meerdere monsters tegelijk met lagere kosten dan op platen gebaseerde sequencingplatforms. Deze aanpak maakt het mogelijk om op druppels gebaseerde snRNA-seq meer geschikt te maken voor cellulaire fenotypeclassificatie en nieuwe subpopulatie-identificatie van cellen binnen de SCG en de StG. Met name biedt dit protocol een beknopte stapsgewijze benadering voor de identificatie, isolatie en single-nucleus RNA-sequencing van sympathische extrinsieke cardiale ganglia, een methode die het potentieel heeft voor een brede toepassing in studies van de karakterisering van ganglia die andere gerelateerde organen en weefsels innerveren in gezondheid en ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol beschrijft alle stappen die nodig zijn voor de snRNA-seq van murine cervicale en/of cervicothoracale (stellaat) ganglia. Vrouwelijke en mannelijke C57BL/6J muizen (15 weken oud, n = 2 voor elk geslacht) werden gebruikt. Een extra Wnt1-Cre;mT/mG muis werd gebruikt om de ganglia te visualiseren voor dissectie doeleinden 17,18. Deze extra muis werd gegenereerd door de kruising van een B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J muis en een B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J muis. Alle dierproeven zijn uitgevoerd volgens de Guide for Care and Use of Laboratory Animals gepubliceerd door NIH en goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Universiteit Leiden (Licentienummer AVD1160020185325, Leiden, Nederland). Zie de Tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, apparatuur, software en dieren die in het protocol worden gebruikt.
1. Voorbereidingen
OPMERKING: Alle stappen worden uitgevoerd in een celkweekstroomkast.
- Reinig de tang en schaar door de instrumenten gedurende 20 minuten onder te dompelen in 70% ethanol.
- Bereid het ganglionmedium bestaande uit Neurobasaal Medium aangevuld met B-27 plus (1x), L-glutamine (2 mM) en 1% Antibioticum-Antimycotisch. Verwarm het ganglionmedium voor op kamertemperatuur.
- Bereid de digestieoplossing voor: 0,25% Trypsine-EDTA (1:1) en 1.400 E/ml collagenase type 2 opgelost in het ganglionmedium.
- Bereid verse, koude (4 °C) celwasbuffer (0,4% runderserumalbumine [BSA]) en lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 en 0,1% niet-ionisch reinigingsmiddel, 40 E/ml RNAse in nucleasevrij water) voor op de kernisolatie.
- Bereid nucleus wash buffer (1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing [PBS] met 2,0% BSA en 0,2U/μL RNase Inhibitor).
- Bereid ST-kleuringsbuffer (ST-SB) voor (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 2% BSA, 0,02% Tween-20 in nucleasevrij water).
2. Dissectie van volwassen muis superieure cervicale ganglia (SCG)
- Euthanaseer de muizen en houd ze op ijs.
OPMERKING: In de huidige studie werden in totaal 4 C57BL6 / J-muizen geëuthanaseerd door CO 2-verstikking. Als alternatief kan isofluraan worden gebruikt, gevolgd door exsanguinatie wanneer een grote hoeveelheid bloed moet worden verzameld voor andere onderzoeksdoeleinden. - Bevestig de muis op een dissectiebord met pinnen en gebruik het met 70% ethanol om de verspreiding van de vacht te minimaliseren (scheren is niet nodig).
- Open onder een stereomicroscoop de huid van het nekgebied door een middellijnsnede te maken met een schaar, beweeg de submandibulaire klieren opzij en verwijder de sternomastoïde spier om de gemeenschappelijke halsslagader en de bifurcatie ervan bloot te leggen en te lokaliseren (figuur 1A, B, zie pijl).
- Ontleed de rechter en linker halsslagader bifurcatie en het weefsel dat eraan vastzit. Breng elk ontleed stukje weefsel over in een apart petrischaaltje van 3,5 cm met koude PBS.
- Zoek naar de SCG die aan de halsslagaderbiafurcatie is bevestigd. Reinig de SCG verder door de slagader en ander aangehecht weefsel in de petrischaal te verwijderen (figuur 1E).
3. Dissectie van volwassen muis stellaat ganglia (StG)
- Om de StG te ontleden, maak je een middellijnsnede in de buik, gevolgd door het openen van het diafragma en de ventrale thoracale wand.
- Verwijder het hart en de longen om de dorsale thorax bloot te leggen. Zoek naar de linker en rechter StG anterolaterale naar de musculus colli longus (MCL) ter hoogte van de eerste rib (Figuur 1C, D, aangegeven door stippellijnen).
- Ontleed zowel linker- als rechter StG met een tang en breng ze afzonderlijk over in petrischalen van 3,5 cm met koude PBS (figuur 1F).
4. Isolatie en cryopreservatie van ganglionaire cellen van muizen
Stap 4-6 zijn samengevat in figuur 2.
- Breng alle afzonderlijke SCG en StG voorzichtig over in afzonderlijke microcentrifugebuizen van 1,5 ml met een tang.
OPMERKING: Gebruik geen pipetpunten om de ganglia over te brengen, omdat de ganglia gevoelig zijn om zich aan de wand van plastic pipetpunten te hechten. - Voeg 500 μL 0,25% trypsine-EDTA-oplossing toe aan elke microcentrifugebuis en incubeer in een schudwaterbad bij 37 °C gedurende 40 minuten.
OPMERKING: Deze stap is bedoeld om de spijsvertering en celafgifte hierna in de collagenase type 2-oplossing te vergemakkelijken. - Bereid voor elk monster een buis van 15 ml met 5 ml ganglionmedium. Laat de ganglia zich op de bodem van de microcentrifugebuizen nestelen. Verzamel het supernatant, dat zeer weinig ganglionaire cellen bevat, breng het supernatant over naar de voorbereide buizen van 15 ml en label elke buis. Als alternatief, om wat tijd te besparen, aspirateer het trypsine-EDTA supernatant zonder verzameling, omdat er zeer weinig gedissocieerde cellen in kunnen worden gedetecteerd.
OPMERKING: Een kleine hoeveelheid trypsine-EDTA-oplossing (~ 10-30 μL) kan in de microcentrifugebuis worden achtergelaten om verwijdering van de ganglia te voorkomen. Vermijd pipetteren bij deze stap omdat het de ganglia kan beschadigen en daarna kan leiden tot een lage output van ganglionaire cellen. - Voeg 500 μL collagenase type 2-oplossing toe aan elke microcentrifugebuis en incubeer in een schudwaterbad bij 37 °C gedurende 35-40 minuten. Probeer het ganglion na 35 minuten opnieuw op te suspenderen; als het ganglion nog intact is en niet dissociëert, verlengt u de incubatietijd of verhoogt u de concentratie collagenase type 2-oplossing indien nodig.
OPMERKING: De incubatietijd kan variëren afhankelijk van de grootte van het ganglion. - Resuspend de ganglia in collagenase-oplossing door ~10 keer op en neer te pipetteren of totdat weefselklonten niet langer worden gedetecteerd.
- Breng de celsuspensie over naar de eerder gebruikte buis van 15 ml die het gangliacultuurmedium en de trypsine-EDTA-suspensie uit hetzelfde ganglion bevat. Draai de celsuspensie met een zwenkbakrotorcentrifuge gedurende 10 minuten, 300 × g bij kamertemperatuur. Gooi het celsupernatant voorzichtig weg.
OPMERKING: Omdat de ganglionaire cellen zijn gedissocieerd van een enkel ganglion, kan de celkorrel te klein zijn om met het oog te detecteren; een kleine hoeveelheid supernatant kan in de buis worden achtergelaten om te voorkomen dat de celkorrel per ongeluk wordt verwijderd. - Resuspend de ganglionaire cellen in 270 μL foetaal runderserum (FBS, laag endotoxine) en breng elke cel-FBS-suspensie over in een cryoviaal van 1 ml.
- Om de cellen te tellen, meng 5 μL van de ganglionaire celsuspensie met 5 μL van 0,4% trypan blauwe kleurstof en laad het mengsel in een hemocytometer. Tel het totale aantal en levende cellen onder een microscoop.
OPMERKING: De levensvatbaarheid van de cel (levend celgetal/totaal aantal cellen = levensvatbaarheid %) is meestal meer dan 90% met dit dissociatieprotocol. Het aantal levende cellen van een enkel ganglion (SCG of StG) valt meestal binnen het bereik van 9.000-60.000 cellen wanneer het ganglion wordt geïsoleerd uit een muis van 12 tot 16 weken. - Voeg 30 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan elke cel-FBS-suspensie in de cryovialen, meng goed en breng de cryovialen over in een celbevriezingscontainer, die op kamertemperatuur wordt bewaard. Bewaar de cryoviaal geladen container 's nachts bij -80 °C en breng de cryovialen de volgende dag over in vloeibare stikstof voor langdurige conservering voordat deze wordt gesequenceerd.
5. Nucleus isolatie
OPMERKING: Links en rechts SCG geïsoleerd uit vier muizen (in totaal 8 monsters) werden gebruikt als voorbeeld in de volgende nucleus isolatie en sequencing voorbereiding. Houd alles op ijs tijdens de hele procedure. Vanwege de onzichtbaarheid van kleine kernpellets wordt een centrifuge met zwaaiende emmers ten zeerste aanbevolen om de verwijdering van supernatanten gedurende de hele procedure te vergemakkelijken.
- Bereid 15 ml buizen met een zeef (30 μm) erop en prerins de zeef met 1 ml van het ganglionmedium.
- Haal de cryovialen uit vloeibare stikstof en ontdooi ze onmiddellijk in een waterbad bij 37 °C. Wanneer er een kleine pellet ijs in het cryoviaal achterblijft, haal je de cryovialen uit het waterbad.
- Herstel de ganglionaire cellen door 1 ml van het ganglionmedium in elk cryoviaal te laten vallen terwijl je voorzichtig met de hand schudt. Optioneel: Om het celherstel te evalueren, mengt u de celsuspensie na herstel en neemt u 5 μL celsuspensie uit voor het tellen van levende cellen, zoals beschreven in stap 4.8.
- Laad elke ganglionaire celsuspensie op een aparte zeef (bereid in stap 5.1) en spoel elke zeef af met 4-5 ml ganglionmedium.
- Centrifugeer de gespannen celsuspensie gedurende 5 minuten bij 300 × g, verwijder het supernatant voorzichtig en resuspend de cellen in 50 μL celwasbuffer.
- Breng de celsuspensie over naar een laagbindende DNA/RNA 0,5 ml microcentrifugebuis.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verwijder 45 μL van het supernatant zonder de bodem van de buis aan te raken om te voorkomen dat de celkorrel losraakt.
- Voeg 45 μL gekoelde Lysis Buffer toe en pipetteer voorzichtig op en neer met een pipetpunt van 200 μL.
- Incubeer de cellen gedurende 8 minuten op ijs.
- Voeg 50 μL koude nucleus wasbuffer toe aan elke buis. Niet mengen.
- Centrifugeer de kernsuspensie bij 600 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verwijder 95 μL van het supernatant zonder de kernkorrel te verstoren.
- Voeg 45 μL gekoelde nucleus wasbuffer toe aan de pellet. Optioneel: Neem 5 μL kernsuspensie, meng met 5 μL van 0,4% trypan blauw om te tellen en controleer de kwaliteit van kernen onder een microscoop met een hemocytometer.
- Centrifugeer de kernsuspensie bij 600 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant zonder de bodem van de buis aan te raken om te voorkomen dat de kernkorrel losraakt.
6. Nucleus barcoding met hashtag oligo's (HTO's) en multiplexing
OPMERKING: HTO-kleuringsstappen werden aangepast en geoptimaliseerd voor nucleaire etikettering van zeer lage hoeveelheden (ganglionische) kernen volgens de vorige toepassing in corticale weefsel door Gaublomme et al.15.
- Voeg 50 μL ST-SB-buffer toe aan de kernkorrel, pipetteer voorzichtig 8-10 keer totdat de kernen volledig zijn geresuspendeerd.
- Voeg 5 μL Fc Blocking-reagens toe per 50 μL van het ST-SB/kernmengsel en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
- Voeg 1 μL (0,5 μg) single-nucleus hashtag antilichaam toe per buis van het ST-SB/kernenmengsel en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
OPMERKING: Kortere incubatietijd leidt tot een lagere efficiëntie van hashtag-etikettering, zoals aangetoond in de representatieve resultaten. - Voeg 100 μL ST-SB toe aan elke buis. Niet mengen.
- Centrifugeer de kernsuspensie gedurende 5 min, 600 × g bij 4 °C.
- Verwijder 145 μL van het supernatant zonder de kernkorrel te verstoren.
- Herhaal stap 6.4 en 6.5. Verwijder het supernatant zoveel mogelijk zonder de bodem van de buis aan te raken om te voorkomen dat de kernkorrel losraakt.
- Resuspend de kernkorrel in 50 μL ST-SB en meng de kernen voorzichtig.
- Neem 5 μL van de nucleus suspensie en meng deze met 5 μL van 0,4% trypan blauw om de kernen onder een microscoop te tellen. Zie figuur 3A voor een representatief beeld van kernen gemengd met trypanblauw en geladen in een hemocytometer.
- Centrifugeer de kernsuspensie gedurende 5 minuten bij 600 × g bij 4 °C.
- Resuspend de kernen in ST-SB om een doelkernconcentratie van 1.000-3.000 kernen/μL voor elk monster te bereiken volgens het overeenkomstige aantal kernen.
- Bundel de monsters om het gewenste aantal cellen te bereiken.
OPMERKING: In dit experiment werden bijvoorbeeld 8 monsters gelijkelijk samengevoegd om een totaal van 25.000 kernen te bereiken om daarna onmiddellijk over te gaan tot 10x Genomics Chromium en snRNA-seq. Het aantal kernen valt meestal binnen het bereik van 6.000-40.000 cellen wanneer het ganglion wordt geïsoleerd uit een muis van 12 tot 16 weken. Slechts ongeveer de helft van de totale geladen kernen kan worden opgevangen door op druppels gebaseerde snRNA-seq. Zo werd een mengsel van 25.000 kernen bereid om 10.000 kernen af te vangen, wat nodig is voor verdere bibliotheekvoorbereiding en sequencing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kwaliteitscontroleanalyse van de single-nucleus cDNA bibliotheekvoorbereiding en snRNA-seq
Representatieve resultaten beschrijven sequencingresultaten van 10.000 gevangen kernen in een enkele pool met een 25.000 reads / nucleus genexpressiebibliotheek en een 5.000 reads / nucleus hashtag bibliotheek. Figuur 3B illustreert de kwaliteitscontroleresultaten van de1e streng cDNA, genexpressie (GEX) bibliotheek en HTO bibliotheek, die werden gecontroleerd met Bioanalyzer. De HTO-afgeleide cDNA's zullen naar verwachting kleiner zijn dan 180 bp, terwijl mRNA-afgeleide cDNA's groter zijn dan 300 bp. Een hoogwaardige GEX-bibliotheek kan worden gedetecteerd als een brede piek van 300 tot 1.000 bp, en de HTO-bibliotheek wordt gedetecteerd als een specifieke piek van 194 bp. Cell Ranger werd gebruikt voor demultiplexing, fastq-bestandsgeneratie en leesuitlijning door standaardinstelling. Seurat R pakket19 werd vervolgens gebruikt voor kwaliteitscontrole en downstream analyses.
Demultiplexing van de snRNA-seq-gegevens werd uitgevoerd door HTO's te identificeren met behulp van de ingebouwde demultiplexingstrategie van Seurat. De demultiplexing-mogelijkheid voor elke HTO werd voor het eerst gevisualiseerd met HTO-expressiebestanden (aanvullende figuur S1). In de heatmap van figuur 4A worden singlets gedetecteerd als kernen met specifieke HTO-expressie, terwijl doubletten en negatieven niet-specifieke expressie van meerdere of geen HTO's vertonen. Van belang is dat ongeveer 33% van de kernen als negatieven werden gedetecteerd met behulp van een 10 min HTO-antilichaamincubatiebenadering. Verlenging van de incubatietijd (stap 6.3) van 10 min naar 30 min in een volgend experiment toonde een opmerkelijke afname van negatief gelabelde kernen (aanvullende figuur S2). Deze bevindingen geven aan dat het verlengen van de incubatietijd van antilichamen de efficiëntie van hashtags kan verbeteren.
Vioolplots in figuur 4B-D tonen het aantal genen (nFeature_RNA), het aantal unieke moleculaire identifiers (UMI) (nCount_RNA) en het percentage mitochondriale tellingen (percent.mt) binnen de snRNA-seq dataset om uitschieters en kernen van lage kwaliteit te identificeren. Kernen werden alleen in de stroomafwaartse analyse opgenomen wanneer aan de volgende criteria werd voldaan: i) nFeature_RNA > 500 en nCount_RNA < 20.000; ii) percent.mt < 5%; iii) de individuele kern vertoonde een duidelijke expressie van een enkele HTO. Genexpressietellingen werden genormaliseerd met behulp van de standaardmethode in Seurat: 875 (2,71%) genen werden gedetecteerd als zeer variabele genen (figuur 4E). snRNA-seq GEX werd geschaald, werd uitgevoerd en de elleboogplot werd gebruikt om de opname van hoofdcomponenten te beoordelen die zouden worden gebruikt voor downstream-analyses (figuur 4F). In totaal werden 18 pc's opgenomen. Clustering werd uitgevoerd met een resolutie van 0,4.
De kernen werden geclusterd en dimensiereductie (UMAP) werd uitgevoerd voor visualisatie van de 12 individuele clusters (figuur 5A). Het mediane ruwe gentelling per cluster varieert tussen 991,5 en 4.586 (aanvullende figuur S3A, B). Het visualiseren van de verdeling van de HTO-antilichamen binnen de UMAP onthult een duidelijke verdeling van ganglia, wat aangeeft dat alle clusters in elk ganglion worden gepresenteerd (figuur 5B). Om de nauwkeurigheid van de segregatie van HTO-monsters te valideren, werd de expressie van X Inactive Specific Transcript (Xist, uitgedrukt in het inactieve vrouwelijke X-chromosoom) beoordeeld om de mannelijke monsters en de vrouwelijke monsters te identificeren (figuur 5C). Xist-expressie was in overeenstemming met de hashtag-etikettering, waaruit bleek dat HTO 1-4 gelabelde monsters vrouwelijke monsters waren en HTO 5-8 gelabelde monsters mannelijke monsters. Dit suggereert dat de samengestelde HTO-etikettering zeer specifiek is.
Om de kwaliteit en resolutie van de sequencinggegevens met de huidige methode verder te verifiëren, werden eerst enkele belangrijke transcripten van sympathische neuronen onderzocht. De resultaten tonen de aanwezigheid van sympathische neuronen die Th, Dbh en Snap25 sterk tot expressie brengen in clusters 5 en 7 (figuur 5D-F). Satellietgliacellen werden gedetecteerd met de expressie van S100b in clusters 0-3 (Figuur 5G)20. Endotheelcellen werden gedetecteerd in cluster 4 met een hoge expressie van Pecam1 (figuur 5H) en stromale cellen in cluster 8 met een hoge expressie van Acta2 (figuur 5I). Deze resultaten ondersteunen de succesvolle kernopname van neuronale, satellietgliale, endotheel- en stromale cellen van het sympathische ganglion met behulp van snRNA-seq.
Figuur 1: Dissectie van volwassen muis superieure cervicale ganglia en stellate ganglia. (A) Brightfield afbeelding van de locatie van de SCG. (B) Om visualisatie te vergemakkelijken, werd een Wnt1Cre;mT/mG muis gebruikt. Sterretjes geven de SCG (eGFP+) aan, pijlpunten geven de bifurcatie van de halsslagader aan. Linkerpaneel, fasecontrastafbeelding; rechterpaneel, fluorescerend beeld. (C) Brightfield-afbeelding van de locatie van de StG. (D) Sterretjes geven de StG (eGFP+) aan, stippellijnen geven het MCL aan. Linkerpaneel, fasecontrastafbeelding; rechterpaneel, fluorescerend beeld. (E) Ontleedde ganglia worden afzonderlijk overgebracht in een petrischaal voor verdere reiniging onder een stereomicroscoop. (F) Linker paneel, de ontleedde SCG met de halsslagader nog bevestigd. Stippelrand geeft de SCG aan. Rechterpaneel, de ontleed en schoongemaakte StG heeft de vorm van een omgekeerde driehoek, zoals aangegeven door de onderbroken omtrek. Schaalbalk = 1.000 μm. Afkortingen: SCG = superior cervical ganglia; StG = stellate ganglia; MCL = musculus colli longus; eGFP = versterkt groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Workflow van monstervoorbereiding en op hashtag-kleuring gebaseerde multiplexing voor snRNA-seq. Het stroomdiagram toont de stappen van de dissociatie van ganglionaire cellen (oranje), kernisolatie (blauw) en hashtag antilichaamkleuring en multiplexing (groen) die worden uitgevoerd voor snRNA-seq. Afkortingen: FBS = foetaal runderserum; ST-SB = ST kleurbuffer; snRNA-seq = single-nucleus RNA sequencing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwaliteitscontrole van kernisolatie en genexpressiebibliotheekvoorbereiding. (A) Fasecontrastbeeld van de HTO-gekleurde kernen. Kernen worden aangegeven met pijlen. Schaalbalk = 100 μm. (B) Bioanalyzerresultaten van1e streng cDNA (boven), GEX-bibliotheek (midden) en HTO-bibliotheek (onder). Afkortingen: GEX = genexpressie; HTO = hashtag oligo. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kwaliteitscontrole van de hashtag oligo labeling efficiëntie en kwaliteitscontrole van snRNA-seq. (A) Heatmap van HTO-kleuring bereikt met een incubatietijd van 10 min met hashtag-antilichamen. (B-D) Vioolplots van kwaliteitscontrolestatistieken die het aantal genen weergeven (nFeature_RNA, B); het aantal UMI's (nCount_RNA, C); het percentage mitochondriale tellingen (percent.mt, D). (E) Van de in totaal 32.285 gesequencede genen werden 875 (2,71%) geïdentificeerd als zeer variabele kenmerken zoals gevisualiseerd in de scatter plot. (F) Elleboogplot van pc's om de opname van het werkelijke signaal te bepalen dat wordt gebruikt voor clustering. Afkortingen: snRNA-seq = single-nucleus RNA sequencing; HTO = hashtag oligo; Pc's = hoofdcomponenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve resultaten van de analyse van snRNA-seq. (A) UMAP plot van de geclusterde snRNA-seq dataset. (B) UMAP-plot die de verdeling van de gepoolde HTO-monsters visualiseert. (C) Vioolplot validerende vrouwelijke samples (hoge Xist expressie) na demultiplexing. (D-I) UMAP-plots met geselecteerde markergenen; de clusters brengen in hoge mate de overeenkomstige genen tot expressie die binnen de rode cirkels zijn aangegeven: D-F, Sympathische neuronen (Th, Dbh, Snap25); G) satellietgliacellen (S100b); h) endotheelcellen (Pecam1); (I) Stromale cellen (Acta2). Afkortingen: snRNA-seq = single-nucleus RNA sequencing; HTO = hashtag oligo; UMAP = uniforme variëteit benadering en projectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Kwaliteitscontrolestatistieken van een representatief single-nucleus sequencingresultaat. HTO-expressieprofielen van individuele monsters die het demultiplexing-vermogen van de gebruikte hashtag-antilichamen visualiseren. Afkorting: HTO = hashtag oligo. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: HTO-expressie heatmap van volgende monsters geïncubeerd met HTO-antilichamen gedurende 30 minuten. Vergelijking van het aantal negatief gelabelde kernen na HTO-demultiplexing met figuur 4A toont een duidelijke verbetering van de nucleuslabeling na verlenging van de incubatietijd van het antilichaam. Afkorting: HTO = hashtag oligo. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: Mediaan en kwantielen van genexpressie per cluster. (A) Mediane niet-nul nul ruwe genexpressie van elk cluster. (B) Beschrijvende statistieken van niet-nulzijnde ruwe genexpressie van elk cluster. Q1: 25e percentiel, Q3: 75e percentiel. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven dat zich richt op i) de dissectie van superieure cervicale en stellaat sympathische ganglia bij volwassen muizen, ii) de isolatie en cryopreservatie van de ganglionaire cellen, iii) kernisolatie en iv) nucleus-barcoding met HTO-labeling voor multiplexingdoeleinden en snRNA-seq.
Met dit protocol kunnen sympathische ganglionaire cellen gemakkelijk worden verkregen door individuele ganglia te dissociëren met behulp van veelgebruikte trypsine en collagenase. Langetermijnbehoud van geïsoleerde ganglionaire cellen wordt ook gemakkelijk bereikt door cellen in FBS te bevriezen, aangevuld met 10% DMSO, dat een hoge kwaliteit van herstel na het ontdooien vertoonde. Bovendien heeft het gebruik van op druppels gebaseerde snRNA-seq van single murine sympathetic ganglia in combinatie met de toepassing van op HTO-kleuring gebaseerde nucleus-barcoding, in vergelijking met conventionele single-cell RNA-sequencing, de volgende voordelen: i) monsters kunnen lang worden bewaard totdat alle monsters klaar zijn voor verdere kernisolatie; ii) kernen van goede kwaliteit die zijn geïsoleerd uit meerdere kleine ganglia's kunnen worden samengevoegd voor sequencing zonder een batcheffect veroorzaakt door gescheiden monstervoorbereiding; iii) het vermogen om de afzonderlijke ganglionaire oorsprong na sequencing te traceren met behulp van nucleus barcodes; en iv) kosteneffectiviteit, aangezien slechts één bibliotheekvoorbereiding nodig is. Belangrijk is dat het beschreven isolatie- en celkweekprotocol een enkele uniforme methode biedt voor zowel muriene cervicale als stellaire ganglia en mogelijk van toepassing is op andere ganglia, zoals dorsale wortelganglia en andere soorten, bijvoorbeeld menselijke ganglia.
Een van de grote voordelen van scRNA-seq is de mogelijkheid om (nieuwe) celtypen te identificeren en zeldzame celpopulaties te onthullen die niet konden worden gedetecteerd door bulk RNA-seq. Het op druppels gebaseerde scRNA-seq-platform vergemakkelijkt het vangen van meer cellen. Het kan dus een geaggregeerd beeld geven van de cel (sub)types en transcriptionele heterogeniteit van een grote celpopulatie in vergelijking met een op platen gebaseerd sequencingplatform. Het op druppels gebaseerde (bijv. 10x Chromium) platform is echter niet geschikt voor cellen groter dan 50 μm, waardoor de toepassing ervan in grote cellen zoals menselijke neuronen (~ 100 μm) wordt beperkt. De beschikbaarheid van de snRNA-seq techniek overwint dit nadeel vanwege de kleine omvang van een kern. Bovendien is snRNA-seq een nuttige methode voor genexpressiestudies van sterk onderling verbonden en laagrenderende cellen zoals neuronen en bevroren weefsels.
Hoewel het mogelijk is om kernen direct uit weefsels te isoleren zonder voorafgaande celdissociatie, was het gunstig voor de opbrengst om een tweestaps kernisolatiemethode te nemen die eerst het ganglion dissocieert in afzonderlijke cellen (die kunnen worden bewaard in vloeibare stikstof) gevolgd door de kernisolatie. Vanwege de kleine omvang van een muissympathisch ganglion, werd gevonden dat meer kernen werden verkregen met behulp van een tweestaps nucleus-isolatiemethode dan met een éénstaps nucleus-isolatiebenadering. De kwaliteitscontrole van de cDNA-, bibliotheek- en sequencinganalyses wijst op een goede kern/RNA-kwaliteit. Bovendien is de logistiek verbeterd, omdat monsters kunnen worden verzameld en opgeslagen op verschillende tijdstippen vóór collectieve sequencing. Single-nucleus analyse onthulde ook het succesvolle herstel en de vangst van neuronen en gliacellen, wat suggereert dat de beschreven tweestaps nucleus-isolatiebenadering mogelijk beter geschikt is voor de toepassing in kleine weefsels.
Een ander voordeel van dit protocol is de multiplexing met barcodes21. Het sympathische ganglion van de muis is een klein weefsel (gemiddelde grootte 0,1 mm3) en het lage aantal cellen afgeleid van een individueel ganglion is onvoldoende voor op druppels gebaseerde sequencing op zichzelf. Het samenvoegen van verschillende ganglia van verschillende muizen of verschillende ganglia van dezelfde muis zal echter het verlies van individuele muisinformatie of individuele ganglioninformatie veroorzaken. Als oplossing is de HTO-kleuringsstap eenvoudig uit te voeren en maakt het mogelijk om kernen met streepjescode te labelen die zijn afgeleid van verschillende muizen of verschillende ganglia vóór nucleus pooling. De nauwkeurigheid van HTO-demultiplexing wordt in dit protocol geverifieerd door gematchte Xist-expressie in bekende vrouwelijke kernpopulaties. Nucleus multiplexing met barcode-antilichamen vermindert daarom batcheffecten en verlaagt de sequencingkosten.
Een mogelijke beperking van snRNAseq zou kunnen zijn dat er verschillen kunnen zijn tussen de RNA-samenstelling in de kern en cytoplasma als gevolg van de natuurlijke aanwezigheid van ontluikende transcripten in de kern, geassocieerd met vroege respons op neuronale activiteiten22,23. De kern en het cytoplasma kunnen ook verschillen in transcripties, afhankelijk van de celcyclustoestand24. Er werden minder transcripten gedetecteerd in een individuele kern (~7.000 genen) dan in een cel (~11.000 genen)14. Daarom kunnen scRNA-seq en snRNA-seq verschillende resultaten opleveren op transcriptniveau. Niettemin toonde de vergelijking tussen scRNA-seq en snRNA-seq een vergelijkbaar vermogen om neuronale celtypen van hersenweefsel te onderscheiden14. Om de discriminatie tussen sterk vergelijkbare celtypen of subtypen door snRNA-seq te verbeteren, kunnen meer kernen nodig zijn om het lagere gendetectievermogen te compenseren in vergelijking met scRNA-seq. Bovendien, hoewel de nauwkeurigheid van HTO-demultiplexing voldoende is, is het verlies van sommige gegevens onvermijdelijk omdat niet alle kernen HTO-specificiteit vertonen. Verdere optimalisatie van de antilichaamincubatie zou het aantal kernen met dubbele of negatieve expressie van HTO's kunnen minimaliseren.
Alles bij elkaar biedt dit protocol de experimentele procedure voor het sequentiëren van neuronale kernen van sympathische ganglia door middel van een eenvoudig te volgen workflow vanaf ganglionisolatie tot kernvoorbereiding van lage input van cellen, gevolgd door HTO-kleuring-gebaseerde nucleus labeling voor snRNA-seq. Het protocol biedt een gedetailleerd overzicht van alle belangrijke stappen die gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd en toegepast op verschillende ganglia in muizen en andere soorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Susan L. Kloet (Afdeling Humane Genetica, LUMC, Leiden) voor haar hulp bij experimenteel ontwerp en nuttige discussies. Wij danken Emile J. de Meijer (Afdeling Humane Genetica, LUMC, Leiden) voor de hulp bij single-nucleus RNA isolatie en bibliotheekvoorbereiding voor sequencing. Dit werk wordt ondersteund door de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO) [016.196.346 naar M.R.M.J.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and reagents | |||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 0.4% trypan blue dye | Bio-Rad | 1450021 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004176 | use 1,400 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 67685 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| Fetal bovine serum (low endotoxin) | Biowest | S1810-500 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Cell wash buffer |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Cell wash buffer |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Nucleus Lysis buffer |
| Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent) | Sigma-Aldrich | 74385 | Nucleus Lysis buffer |
| Nuclease free water (not DEPC-treated) | Invitrogen | AM9937 | Nucleus Lysis buffer |
| Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus Lysis buffer |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | Nucleus Lysis buffer |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | Nucleus Lysis buffer |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Nucleus wash |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Nucleus wash |
| Protector RNase Inhibitor,40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus wash |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Calcium chloride solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Nuclease free water (not DEPC treated) | Invitrogen | AM9937 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Sodium Chloride Solution, 5M | Sigma-Aldrich | 59222C | ST staining buffer (ST-SB) |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST staining buffer (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody | Biolegend | 682205 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody | Biolegend | 682207 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody | Biolegend | 682209 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody | Biolegend | 682225 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody | Biolegend | 682227 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody | Biolegend | 682229 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody | Biolegend | 682231 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody | Biolegend | 682233 | Hashtag antibody |
| TruStain FcX (human) | Biolegend | 422302 | FC receptor blocking solution |
| Equipment and consumables | |||
| Bright-Line Hemacytometer | Merck | Z359629-1EA | |
| Centrifuge 5702/R A-4-38 | Eppendorf | EP022629905 | |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | EP0030108035-250EA | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish | Corning | 351008 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 10773501 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine science tools | 11252-40 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine science tools | 14091-09 | |
| Ice Pan, rectangular 4 L Orange | Corning | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Leica | Microscope | |
| Moria MC50 Scissors | Fine science tools | 15370-50 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine science tools | 15012-12 | |
| Olympus CK2 ULWCD | Olympus | Microscope | |
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| Preseparation Filters (30 µm) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| Shaking water bath | GFL | 1083 | |
| Silicon plate | RubberBV | 3530 | Dissection board |
| Software and packages | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| R programming | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #007576 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Code for the data analysis | |||
| https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE |
References
- McCorry, L. K.
- Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Cardiology Research and Practice. 2015, 698368 (2015).
- Ajijola, O. A., et al. Extracardiac neural remodeling in humans with cardiomyopathy. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 5 (5), 1010 (2012).
- Nguyen, B. L., et al. Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 143-148 (2012).
- Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
- Han, S., et al. Electroanatomic remodeling of the left stellate ganglion after myocardial infarction. Journals of the American College of Cardiology. 59 (10), 954-961 (2012).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Svensson, V., Vento-Tormo, R., Teichmann, S. A. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nature Protocols. 13 (4), 599-604 (2018).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
- Kokubun, S., et al. Distribution of TRPV1 and TRPV2 in the human stellate ganglion and spinal cord. Neuroscience Letters. 590, 6-11 (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communication. 10 (1), 2832 (2019).
- Petrany, M. J., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers. Nature Communication. 11 (1), 6374 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648 (2018).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
- Zandstra, T. E., et al. Asymmetry and heterogeneity: part and parcel in cardiac autonomic innervation and function. Frontiers in Physiology. 12, 665298 (2021).
- Lewis, A. E., Vasudevan, H. N., O'Neill, A. K., Soriano, P., Bush, J. O. The widely used Wnt1-Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling. Developmental Biology. 379 (2), 229-234 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. bioRxiv. , (2018).
- Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 11022 (2016).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
- Grindberg, R. V., et al.
