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Medicine

एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए माउस सहानुभूति गैन्ग्लिया के बारकोडेड एंटीबॉडी के साथ कम इनपुट न्यूक्लियस अलगाव और मल्टीप्लेक्सिंग

Published: March 23, 2022 doi: 10.3791/63397
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1, 2, 1, 3, 1,2
1Department of Anatomy & Embryology, Leiden University Medical Center, 2Department of Cardiology, Leiden University Medical Center, 3Department of Medical Statistics and Bioinformatics, Leiden University Medical Center

Summary

यह प्रोटोकॉल एकल-नाभिक अनुक्रमण के लिए विस्तृत, कम इनपुट नमूना तैयारी का वर्णन करता है, जिसमें माउस बेहतर ग्रीवा और तारामय गैन्ग्लिया, सेल पृथक्करण, क्रायोप्रिजर्वेशन, नाभिक अलगाव और हैशटैग बारकोडिंग के विच्छेदन शामिल हैं।

Abstract

कार्डियक ऑटोनोमिक तंत्रिका तंत्र हृदय समारोह को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण है, जैसे हृदय गति और हृदय संकुचन, और सहानुभूति और पैरासिम्पेथेटिक शाखाओं में विभाजित है। आम तौर पर, होमियोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए इन दो शाखाओं के बीच संतुलन होता है। हालांकि, मायोकार्डियल रोधगलन, दिल की विफलता और उच्च रक्तचाप जैसे हृदय रोग राज्य कार्डियक संरक्षण में शामिल कोशिकाओं के रीमॉडेलिंग को प्रेरित कर सकते हैं, जो प्रतिकूल नैदानिक परिणाम से जुड़ा हुआ है।

यद्यपि कार्डियक स्वायत्त तंत्रिका तंत्र की हिस्टोलॉजिकल संरचना और कार्य के लिए विशाल मात्रा में डेटा हैं, स्वास्थ्य और बीमारी में इसकी आणविक जैविक वास्तुकला अभी भी कई पहलुओं में गूढ़ है। एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण (एससीआरएनए-सीक्यू) जैसी उपन्यास प्रौद्योगिकियां एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर ऊतकों के आनुवंशिक लक्षण वर्णन के लिए वादा करती हैं। हालांकि, न्यूरॉन्स का अपेक्षाकृत बड़ा आकार इन तकनीकों के मानकीकृत उपयोग में बाधा डाल सकता है। यहां, यह प्रोटोकॉल छोटी बूंद-आधारित एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण (एसएनआरएनए-सीक्यू) का शोषण करता है, जो स्वास्थ्य और बीमारी में कार्डियक सहानुभूति न्यूरॉन्स की जैविक वास्तुकला को चिह्नित करने के लिए एक विधि है। वयस्क चूहों से विच्छेदित द्विपक्षीय बेहतर ग्रीवा (एससीजी) और तारामय गैन्ग्लिया (एसटीजी) के एसएनआरएनए-सीक्यू करने के लिए एक चरणबद्ध दृष्टिकोण का प्रदर्शन किया जाता है।

यह विधि दीर्घकालिक नमूना संरक्षण को सक्षम बनाती है, एक पर्याप्त आरएनए गुणवत्ता को बनाए रखती है जब कई व्यक्तियों / प्रयोगों से नमूने कम समय के भीतर एक ही बार में एकत्र नहीं किए जा सकते हैं। हैशटैग ओलिगोस (एचटीओ) के साथ नाभिक को बारकोडिंग करने से डिमल्टीप्लेक्सिंग और अनुक्रमण के बाद अलग-अलग गैंग्लियनिक नमूनों का ट्रेस-बैक सक्षम हो जाता है। बाद के विश्लेषणों से सहानुभूति गैन्ग्लिया के न्यूरोनल, उपग्रह ग्लियल और एंडोथेलियल कोशिकाओं के सफल नाभिक कैप्चर का पता चला, जैसा कि एसएनआरएनए-सीक्यू द्वारा मान्य है। संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल सहानुभूति बाह्य कार्डियक गैन्ग्लिया के एसएनआरएनए-सीक्यू के लिए एक चरणबद्ध दृष्टिकोण प्रदान करता है, एक ऐसी विधि जिसमें अन्य अंगों और ऊतकों के संरक्षण के अध्ययन में व्यापक अनुप्रयोग की क्षमता है।

Introduction

स्वायत्त तंत्रिका तंत्र (एएनएस) परिधीय तंत्रिका तंत्र का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है जो शरीर के होमियोस्टेसिस को बनाए रखता है, जिसमें पर्यावरणीय परिस्थितियों औरविकृति विज्ञान के अनुकूलन शामिल हैं। यह कार्डियोवैस्कुलर, श्वसन, पाचन और अंतःस्रावी प्रणालियों जैसे पूरे शरीर में कई अंग प्रणालियों के विनियमन में शामिल है। एएनएस को सहानुभूतिपूर्ण और पैरासिम्पेथेटिक शाखाओं में विभाजित किया गया है। सहानुभूति श्रृंखला के गैन्ग्लिया में सहानुभूति तंत्रिका तंत्र सिनैप्स की रीढ़ की हड्डी की शाखाएं, एक पैरावर्टेब्रल स्थिति में द्विपक्षीय रूप से स्थित हैं। द्विपक्षीय गर्भाशय ग्रीवा और थोरैसिक गैन्ग्लिया, विशेष रूप से एसटीजी, कार्डियक सहानुभूति संरक्षण में भाग लेने वाले महत्वपूर्ण घटक हैं। रोग राज्यों में, जैसे कि कार्डियक इस्किमिया, न्यूरोनल रीमॉडेलिंग हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप सहानुभूतिपूर्ण ओवरड्राइव2 होता है। न्यूरोनल रीमॉडेलिंग को मनुष्यों और कई अन्य पशु प्रजातियों 3,4,5,6 में कई हिस्टोलॉजिकल अध्ययनों में प्रदर्शित किया गया है। कार्डियक सहानुभूति गैन्ग्लिया में कार्डियक इस्किमिया-प्रेरित न्यूरोनल रीमॉडेलिंग के एक विस्तृत जैविक लक्षण वर्णन में वर्तमान में कमी है, और कार्डियक सहानुभूति तंत्रिका तंत्र (एसएनएस) के भीतर विशेष न्यूरोनल सेल प्रकारों या उपप्रकारों की मौलिक जैविक विशेषताओं को अभी तक स्वास्थ्य और रोग 7 में पूरी तरह से निर्धारित नहींकिया गया है।

एससीआरएनए-सीक्यू जैसी उपन्यास प्रौद्योगिकियों ने एकल-कोशिका स्तर 8,9 पर छोटे ऊतकों के आनुवंशिक लक्षण वर्णन के लिए प्रवेश द्वार खोले हैं। हालांकि, न्यूरॉन्स का अपेक्षाकृत बड़ा आकार मनुष्यों में इन एकल-कोशिका तकनीकों के अनुकूलित उपयोग में बाधा डाल सकताहै 10. इसके अलावा, एकल-सेल अनुक्रमण अनुक्रमण प्रक्रिया में उच्च हानि के कारण पर्याप्त सेल संख्या को पुनर्प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं के एक उच्च-थ्रूपुट की आवश्यकता होती है। छोटे ऊतकों का अध्ययन करते समय यह चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है जो एक सत्र में कैप्चर करना मुश्किल होता है और अनुक्रमण के लिए पर्याप्त एकल कोशिकाओं को पेश करने के लिए कई नमूनों की आवश्यकता होती है। हाल ही में विकसित छोटी बूंद-आधारित एसएनआरएनए-सीक्यू तकनीक (यानी, 10 एक्स क्रोमियम प्लेटफॉर्म) एकल नाभिक11,12 के बीच जैविक मतभेदों के अध्ययन की अनुमति देती है। एसएनआरएनए-सीक्यू बड़ी कोशिकाओं (>30 μm) के लिए एससीआरएनए-सीक्यू पर एक लाभ रखता है, जिसे इमल्शन (जीईएम) में जेल बीड में कैप्चर नहीं किया जा सकता है, साथ ही व्यापक पृथक्करण और / या लंबे समय तक संरक्षण 13,14,15 के साथ बेहतर संगतता।

विषमता, न्यूरोनल कोशिकाओं की संख्या, और कार्डियक एसएनएस में समृद्ध अन्य कोशिकाएं स्वास्थ्य और रोग राज्यों में एएनएस के लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण पहलू हैं। इसके अलावा, प्रत्येक सहानुभूति नाड़ीग्रन्थि द्वारा अंग- या क्षेत्र-विशिष्ट संरक्षण एसएनएस की जटिलता में योगदान देता है। इसके अलावा, सहानुभूति श्रृंखला के गर्भाशय ग्रीवा, तारामय और थोरैसिक गैन्ग्लिया को हृदय16 के विभिन्न क्षेत्रों को आंतरिक करने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, उनके जैविक वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए व्यक्तिगत गैन्ग्लिया से प्राप्त गैंग्लियन कोशिकाओं का एकल-नाभिक विश्लेषण करना आवश्यक है।

ड्रॉपलेट-आधारित एसएनआरएनए-सीक्यू प्लेट-आधारित अनुक्रमण प्लेटफार्मों की तुलना में कम लागत के साथ एक साथ कई नमूनों से हजारों कोशिकाओं के पूल के लिए ट्रांसक्रिप्टोम-वाइड अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग की अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण छोटी बूंद-आधारित एसएनआरएनए-सीक्यू को सेलुलर फेनोटाइप वर्गीकरण और एससीजी और एसटीजी के भीतर कोशिकाओं की नई उप-जनसंख्या पहचान के लिए अधिक उपयुक्त होने में सक्षम बनाता है विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल सहानुभूति बाह्य हृदय गैन्ग्लिया की पहचान, अलगाव और एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए एक संक्षिप्त चरणबद्ध दृष्टिकोण प्रदान करता है, एक विधि जिसमें गैन्ग्लिया के लक्षण वर्णन के अध्ययन में व्यापक अनुप्रयोग की क्षमता है जो अन्य संबंधित अंगों और ऊतकों को आंतरिक बनाने वाले गैन्ग्लिया के लक्षण वर्णन के अध्ययन में एक व्यापक अनुप्रयोग की क्षमता रखता है। स्वास्थ्य और बीमारी।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल मूत्र ग्रीवा और / या सर्विकोथोरैसिक (तारामय) गैन्ग्लिया के एसएनआरएनए-सीक्यू के लिए आवश्यक सभी चरणों का वर्णन करता है। मादा और पुरुष सी 57 बीएल / 6 जे चूहों (15 सप्ताह पुराना, प्रत्येक लिंग के लिए एन = 2) का उपयोग किया गया था। एक अतिरिक्त डब्ल्यूएनटी 1-क्रे; एमटी / एमजी माउस का उपयोग विच्छेदन उद्देश्यों17,18 के लिए गैन्ग्लिया की कल्पना करने के लिए किया गया था। यह अतिरिक्त माउस एक B6.Cg-टीजी (डब्ल्यूएनटी 1-क्रे) 2 एसओआर / जे माउस और बी 6.12 9 (सीजी) -जीटी (आरओएसए) 26सॉर्टम 4 (एसीटीबी-टीडीटोमेटो, -ईजीएफपी) लुओ / जे माउस के क्रॉसब्रीडिंग द्वारा उत्पन्न किया गया था। एनआईएच द्वारा प्रकाशित प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार सभी पशु प्रयोग किए गए थे और लीडेन विश्वविद्यालय की पशु नैतिकता समिति (लाइसेंस संख्या एवीडी 1160020185325, लीडेन, नीदरलैंड) द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, उपकरणों, सॉफ़्टवेयर और जानवरों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. तैयारी

नोट: सभी चरणों को एक सेल संस्कृति प्रवाह कैबिनेट में किया जाता है।

  1. 20 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में उपकरणों विसर्जित करके संदंश और कैंची साफ।
  2. बी -27 प्लस (1 एक्स), एल-ग्लूटामाइन (2 एमएम), और 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक के साथ पूरक न्यूरोबेसल मीडियम से युक्त गैंग्लियन माध्यम तैयार करें। कमरे के तापमान पर गैंग्लियन माध्यम को प्रीवार्म करें।
  3. पाचन समाधान तैयार करें: 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए (1: 1) और 1,400 यू / एमएल कोलेजेनेज टाइप 2 गैंग्लियन माध्यम में भंग हो गए।
  4. नाभिक अलगाव के लिए ताजा, ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) सेल वॉश बफर (0.4% गोजातीय सीरम एल्बुमिन [बीएसए]) और लाइसिस बफर (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 10 एमएम एनएसीएल, 3 एमएम एमजीसीएल2, और 0.1% नॉनियोनिक डिटर्जेंट, न्यूक्लीज-फ्री पानी में 40 यू / एमएल आरएनएएस) तैयार करें।
  5. नाभिक धोने बफर तैयार करें (2.0% बीएसए और 0.2 यू /
  6. एसटी धुंधला बफर (एसटी-एसबी) (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 146 एमएम एनएसीएल, 21 एमएम एमजीसीएल2, 1 एमएम सीएसीएल2, 2% बीएसए, 0.02% ट्वीन -20 न्यूक्लीज-फ्री पानी में) तैयार करें।

2. वयस्क माउस बेहतर ग्रीवा गैन्ग्लिया (एससीजी) के विच्छेदन

  1. चूहों को यूथेनाइज करें और उन्हें बर्फ पर रखें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन में, कुल 4 सी 57 बीएल 6 / जे चूहों को सीओ2 एस्फेक्सिएशन द्वारा यूथेनाइज्ड किया गया था। वैकल्पिक रूप से, आइसोफ्लुरेन का उपयोग एक्सेंगुइनेशन के बाद किया जा सकता है जब अन्य अध्ययन उद्देश्यों के लिए बड़ी मात्रा में रक्त एकत्र करने की आवश्यकता होती है।
  2. पिन के साथ एक विच्छेदन बोर्ड पर माउस को ठीक करें और फर के फैलाव को कम करने के लिए इसे 70% इथेनॉल के साथ बुझाएं (शेविंग आवश्यक नहीं है)।
  3. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, कैंची के साथ एक मिडलाइन कट बनाकर गर्दन क्षेत्र की त्वचा को खोलें, सबमैंडिबुलर ग्रंथियों को एक तरफ ले जाएं, और आम कैरोटिड धमनी और इसके विभाजन (चित्रा 1 ए, बी, तीर देखें) को बेनकाब करने और पता लगाने के लिए स्टर्नोमास्टॉइड मांसपेशियों को हटा दें।
  4. दाएं और बाएं कैरोटिड धमनी द्विभाजन और इससे जुड़े ऊतक को विच्छेदन करें। ठंड पीबीएस युक्त एक अलग 3.5 सेमी पेट्री डिश के लिए ऊतक के प्रत्येक विच्छेदित टुकड़े स्थानांतरण।
  5. कैरोटिड द्विभाजन से जुड़े एससीजी की तलाश करें। पेट्री डिश (चित्रा 1 ई) में धमनी और अन्य संलग्न ऊतक को हटाकर एससीजी को और साफ करें।

3. वयस्क माउस तारामय गैन्ग्लिया (एसटीजी) का विच्छेदन

  1. एसटीजी को विच्छेदित करने के लिए, पेट में एक मिडलाइन कट बनाएं, इसके बाद डायाफ्राम और वेंट्रल थोरैसिक दीवार को खोलें।
  2. पृष्ठीय वक्ष बेनकाब करने के लिए दिल और फेफड़ों को हटा दें। पहली पसली (चित्रा 1 सी, डी, धराशायी लाइनों द्वारा इंगित) के स्तर पर मस्कुलस कोली लॉन्गस (एमसीएल) के लिए बाएं और दाएं एसटीजी एंटेरोलेटरल की तलाश करें।
  3. संदंश के साथ दोनों बाएं और दाएं एसटीजी को विच्छेदन करें और अलग से उन्हें ठंडे पीबीएस (चित्रा 1 एफ) युक्त 3.5 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
    ​

4. माउस गैंग्लियनिक कोशिकाओं का अलगाव और क्रायोप्रिजर्वेशन

चरण 4-6 चित्रा 2 में संक्षेप में हैं।

  1. संदंश के साथ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को अलग करने के लिए सभी व्यक्तिगत एससीजी और एसटीजी को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें।
    नोट: गैन्ग्लिया को स्थानांतरित करने के लिए विंदुक युक्तियों का उपयोग न करें क्योंकि गैन्ग्लिया प्लास्टिक विंदुक युक्तियों की दीवार का पालन करने के लिए प्रवण हैं।
  2. प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 500 μL जोड़ें और 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए पानी के स्नान में सेते हैं।
    नोट: इस कदम का उद्देश्य कोलेजेनेस टाइप 2 समाधान में इसके बाद पाचन और सेल रिलीज की सुविधा प्रदान करना है।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए गैंग्लियन माध्यम के 5 एमएल युक्त एक 15 एमएल ट्यूब तैयार करें। गैन्ग्लिया को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के तल पर बसने की अनुमति दें। सतह पर तैरनेवाला, जिसमें बहुत कम गैंग्लियनिक कोशिकाएं होती हैं, तैयार 15 एमएल ट्यूबों में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरित करें, और प्रत्येक ट्यूब को लेबल करें। वैकल्पिक रूप से, कुछ समय बचाने के लिए, संग्रह के बिना ट्रिप्सिन-ईडीटीए सतह पर तैरनेवाला एस्पिरेट करें क्योंकि इसमें बहुत कम अलग-अलग कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है।
    नोट: ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान (~ 10-30 μL) की एक छोटी राशि को गैन्ग्लिया को हटाने से बचने के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में छोड़ा जा सकता है। इस चरण में पाइपिंग से बचें क्योंकि यह गैन्ग्लिया को नुकसान पहुंचा सकता है और बाद में गैंग्लियन कोशिकाओं के कम उत्पादन का कारण बन सकता है।
  4. प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कोलेजेनेज प्रकार 2 समाधान के 500 μL जोड़ें और 35-40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए पानी के स्नान में सेते हैं। 35 मिनट के बाद गैंग्लियन को फिर से निलंबित करने का प्रयास करें; यदि गैंग्लियन अभी भी बरकरार है और अलग नहीं होता है, तो इनक्यूबेशन समय को लम्बा खींचें या आवश्यक रूप से कोलेजेनेज टाइप 2 समाधान की एकाग्रता में वृद्धि करें।
    नोट: इनक्यूबेशन समय नाड़ीग्रन्थि आकार के आधार पर भिन्न हो सकता है।
  5. ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा कोलेजेनेस समाधान में गैन्ग्लिया को फिर से निलंबित करें ~ 10 बार या जब तक ऊतक झुरमुट का पता नहीं लगाया जाता है।
  6. सेल निलंबन को पहले से उपयोग किए जाने वाले 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें गैन्ग्लिया संस्कृति माध्यम और ट्रिप्सिन-ईडीटीए निलंबन एक ही गैंग्लियन से होता है। कमरे के तापमान पर 10 मिनट, 300 × जी के लिए एक स्विंगिंग बाल्टी रोटर अपकेंद्रित्र के साथ सेल निलंबन को स्पिन करें। ध्यान से सेल सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    नोट: क्योंकि गैंग्लियन कोशिकाओं को एक एकल नाड़ीग्रन्थि से अलग किया जाता है, सेल गोली आंखों से पता लगाने के लिए बहुत छोटी हो सकती है; सेल गोली के आकस्मिक हटाने से बचने के लिए ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला की एक छोटी राशि छोड़ी जा सकती है।
  7. भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस, कम एंडोटॉक्सिन) के 270 μL में गैंग्लियन कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और प्रत्येक सेल-एफबीएस निलंबन को 1 एमएल क्रायोवियल में स्थानांतरित करें।
  8. कोशिकाओं की गणना करने के लिए, गैंग्लियन सेल निलंबन के 5 μL को 0.4% ट्राइपैन ब्लू डाई के 5 μL के साथ मिलाएं और मिश्रण को हेमोसाइटोमीटर में लोड करें। माइक्रोस्कोप के तहत कुल और लाइव-सेल संख्याओं की गणना करें।
    नोट: सेल व्यवहार्यता (लाइव सेल गिनती / कुल सेल गिनती = व्यवहार्यता%) आमतौर पर इस पृथक्करण प्रोटोकॉल के साथ 90% से ऊपर है। एक एकल नाड़ीग्रन्थि (या तो एससीजी या एसटीजी) की लाइव सेल गिनती आमतौर पर 9,000-60,000 कोशिकाओं की सीमा के भीतर आती है जब गैंग्लियन को 12 से 16 सप्ताह की आयु के माउस से अलग किया जाता है।
  9. क्रायोवियल्स में प्रत्येक सेल-एफबीएस निलंबन में डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के 30 μL जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं, और क्रायोवियल्स को सेल फ्रीजिंग कंटेनर में स्थानांतरित करें, जिसे कमरे के तापमान पर रखा जाता है। क्रायोवियल लोडेड कंटेनर को रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और अनुक्रमण से पहले लंबे समय तक संरक्षण के लिए अगले दिन क्रायोवियल्स को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।

5. नाभिक अलगाव

नोट: चार चूहों (कुल 8 नमूनों में) से अलग बाएं और दाएं एससीजी का उपयोग निम्नलिखित नाभिक अलगाव और अनुक्रमण तैयारी में एक उदाहरण के रूप में किया गया था। पूरी प्रक्रिया के दौरान सब कुछ बर्फ पर रखें। छोटे नाभिक छर्रों की अदृश्यता के कारण, स्विंगिंग बाल्टी के साथ एक अपकेंद्रित्र को पूरी प्रक्रिया में सतह पर तैरनेवाला हटाने की सुविधा के लिए अत्यधिक अनुशंसित किया जाता है।

  1. शीर्ष पर एक छलनी (30 μm) के साथ 15 मिलीलीटर ट्यूब तैयार करें और गैंग्लियन माध्यम के 1 एमएल के साथ छलनी prerinse।
  2. तरल नाइट्रोजन से क्रायोवियल्स निकालें और तुरंत उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में पिघलाएं। जब क्रायोवियल में बर्फ की एक छोटी सी गोली छोड़ दी जाती है, तो क्रायोवियल्स को पानी के स्नान से बाहर ले जाएं।
  3. हाथ से ध्यान से मिलाते हुए प्रत्येक क्रायोवियल में गैंग्लियन माध्यम के 1 एमएल को छोड़कर गैंग्लियन कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें। वैकल्पिक: सेल वसूली का मूल्यांकन करने के लिए, वसूली के बाद सेल निलंबन मिश्रण और लाइव सेल गिनती के लिए सेल निलंबन के 5 μL बाहर ले लो, के रूप में चरण 4.8 में वर्णित है।
  4. प्रत्येक गैंग्लियन सेल निलंबन को एक अलग छलनी (चरण 5.1 में तैयार) पर लोड करें और प्रत्येक छलनी को गैंग्लियन माध्यम के 4-5 एमएल के साथ कुल्लाएं।
  5. 300 × जी पर 5 मिनट के लिए तनावपूर्ण सेल निलंबन अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला ध्यान से हटा दें, और सेल धोने बफर के 50 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  6. आरएनए 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सेल निलंबन को स्थानांतरित करें।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
  8. सेल गोली dislodging से बचने के लिए ट्यूब के तल को छूने के बिना सतह पर तैरनेवाला के 45 μL निकालें।
  9. ठंडा लाइसिस बफर के 45 μL जोड़ें और धीरे से एक 200 μL विंदुक टिप का उपयोग कर ऊपर और नीचे विंदुक।
  10. बर्फ पर 8 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते हैं।
  11. प्रत्येक ट्यूब में ठंडे नाभिक धोने बफर के 50 μL जोड़ें। मिश्रण न करें।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 600 × ग्राम पर नाभिक निलंबन अपकेंद्रित्र।
  13. नाभिक गोली को बाधित किए बिना सतह पर तैरनेवाला के 95 μL निकालें।
  14. गोली के लिए ठंडा नाभिक धोने बफर के 45 μL जोड़ें। वैकल्पिक: नाभिक निलंबन के 5 μL लें, गिनती करने के लिए 0.4% ट्राइपैन नीले रंग के 5 μL के साथ मिलाएं, और हेमोसाइटोमीटर के साथ माइक्रोस्कोप के तहत नाभिक की गुणवत्ता की जांच करें।
  15. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 600 × ग्राम पर नाभिक निलंबन अपकेंद्रित्र।
  16. नाभिक गोली dislodging से बचने के लिए ट्यूब के नीचे को छूने के बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें।

6. हैशटैग ओलिगोस (एचटीओ) और मल्टीप्लेक्सिंग के साथ न्यूक्लियस बारकोडिंग

नोट: एचटीओ धुंधला चरणों को संशोधित किया गया था और गौब्लोम एट अल द्वारा कॉर्टिकल ऊतक में पिछले आवेदन के अनुसार बहुत कम मात्रा में (गैंग्लियनिक) नाभिक के परमाणु लेबलिंग के लिए अनुकूलित किया गया था।

  1. नाभिक गोली के लिए एसटी-एसबी बफर के 50 μL जोड़ें, धीरे से 8-10 बार विंदुक जब तक नाभिक पूरी तरह से फिर से निलंबित कर रहे हैं।
  2. नाभिक मिश्रण के प्रति 50 μL एफसी अवरुद्ध अभिकर्मक के 5 μL जोड़ें और बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. नाभिक मिश्रण की ट्यूब प्रति एकल-नाभिक हैशटैग एंटीबॉडी के 1 μL (0.5 μg) जोड़ें और बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: कम इनक्यूबेशन समय हैशटैग लेबलिंग की कम दक्षता की ओर जाता है, जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में प्रदर्शित किया गया है।
  4. प्रत्येक ट्यूब में एसटी-एसबी के 100 μL जोड़ें। मिश्रण न करें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट, 600 × ग्राम के लिए नाभिक निलंबन अपकेंद्रित्र।
  6. नाभिक गोली को बाधित किए बिना सतह पर तैरनेवाला के 145 μL निकालें।
  7. चरण 6.4 और 6.5 दोहराएँ। नाभिक गोली dislodging से बचने के लिए ट्यूब के नीचे को छूने के बिना जितना संभव हो उतना सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  8. एसटी-एसबी के 50 μL में नाभिक गोली को फिर से निलंबित करें, और धीरे-धीरे नाभिक को मिलाएं।
  9. नाभिक निलंबन के 5 μL लें और माइक्रोस्कोप के तहत नाभिक की गणना करने के लिए इसे 0.4% ट्राइपैन नीले रंग के 5 μL के साथ मिलाएं। ट्राइपैन नीले रंग के साथ मिश्रित नाभिक की एक प्रतिनिधि छवि के लिए चित्रा 3 ए देखें और हेमोसाइटोमीटर में लोड किया गया।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 600 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए नाभिक निलंबन अपकेंद्रित्र।
  11. संबंधित नाभिक गिनती के अनुसार प्रत्येक नमूने के लिए 1,000-3,000 नाभिक /
  12. कोशिकाओं की वांछित संख्या को प्राप्त करने के लिए नमूनों पूल।
    नोट: उदाहरण के लिए, इस प्रयोग में, 8 नमूनों को कुल 25,000 नाभिक प्राप्त करने के लिए समान रूप से पूल किया गया था ताकि तुरंत 10 एक्स जीनोमिक्स क्रोमियम और एसएनआरएनए-सीक्यू के बाद आगे बढ़ सकें। नाभिक की गिनती आमतौर पर 6,000-40,000 कोशिकाओं की सीमा के भीतर आती है जब गैंग्लियन को 12 से 16 सप्ताह की आयु के माउस से अलग किया जाता है। कुल लोड किए गए नाभिक के केवल आधे हिस्से को छोटी बूंद-आधारित एसएनआरएनए-सीक्यू द्वारा कैप्चर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 10,000 नाभिक पर कब्जा सुनिश्चित करने के लिए 25,000 नाभिक मिश्रण तैयार किया गया था, जो आगे पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण के लिए आवश्यक है।

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Representative Results

एकल-नाभिक सीडीएनए पुस्तकालय की तैयारी और एसएनआरएनए-सीक्यू का गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण
प्रतिनिधि परिणाम 25,000 रीड्स / नाभिक जीन अभिव्यक्ति पुस्तकालय और 5,000 रीड्स / न्यूक्लियस हैशटैग लाइब्रेरी के साथ एक एकल पूल में 10,000 कैप्चर किए गए नाभिक के अनुक्रमण परिणामों का वर्णन करते हैं। चित्रा 3 बी 1सेंट स्ट्रैंड सीडीएनए, जीन अभिव्यक्ति (जीईएक्स) लाइब्रेरी और एचटीओ लाइब्रेरी के गुणवत्ता नियंत्रण परिणामों को दिखाता है, जिन्हें बायोएनालाइजर के साथ जांचा गया था। एचटीओ-व्युत्पन्न सीडीएनए 180 बीपी से छोटे होने की उम्मीद है, जबकि एमआरएनए-व्युत्पन्न सीडीएनए 300 बीपी से बड़े हैं। एक उच्च गुणवत्ता वाले जीईएक्स लाइब्रेरी को 300 से 1,000 बीपी तक एक व्यापक चोटी के रूप में पता लगाया जा सकता है, और एचटीओ लाइब्रेरी को 194 बीपी के एक विशिष्ट शिखर के रूप में पाया जाता है सेल रेंजर का उपयोग डिमल्टीप्लेक्सिंग, फास्टक फाइल पीढ़ी और डिफ़ॉल्ट सेटिंग द्वारा संरेखण पढ़ने के लिए किया गया था। सेरात आर पैकेज19 का उपयोग बाद में गुणवत्ता नियंत्रण और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए किया गया था।

सेराट अंतर्निहित डीमल्टीप्लेक्सिंग रणनीति का उपयोग करके एचटीओ की पहचान करके एसएनआरएनए-सीक्यू डेटा का डिमल्टीप्लेक्सिंग किया गया था। प्रत्येक एचटीओ के लिए डिमल्टीप्लेक्सिंग क्षमता को पहली बार एचटीओ अभिव्यक्ति फ़ाइलों (पूरक चित्रा एस 1) के साथ कल्पना की गई थी। चित्रा 4 ए के हीटमैप में, एकल को विशिष्ट एचटीओ अभिव्यक्ति के साथ नाभिक के रूप में पाया जाता है, जबकि डबल्स और नकारात्मक कई या कोई एचटीओ की गैर-विशिष्ट अभिव्यक्ति दिखाते हैं। ध्यान दें, नाभिक के लगभग 33% को 10 मिनट एचटीओ एंटीबॉडी इनक्यूबेशन दृष्टिकोण का उपयोग करके नकारात्मक के रूप में पता लगाया गया था। बाद के प्रयोग में 10 मिनट से 30 मिनट तक इनक्यूबेशन समय (चरण 6.3) की लम्बाई नकारात्मक लेबल वाले नाभिक (पूरक चित्रा एस 2) में उल्लेखनीय कमी का पता चला। इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि एंटीबॉडी इनक्यूबेशन समय को लम्बा खींचने से हैशटैग दक्षता में सुधार हो सकता है।

चित्रा 4 बी-डी में वायलिन भूखंड जीन (nFeature_RNA), अद्वितीय आणविक पहचानकर्ताओं (यूएमआई) (nCount_RNA) की संख्या, और एसएनआरएनए-सीक्यू डेटासेट के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल गिनती (percent.mt) के प्रतिशत को प्रदर्शित करते हैं ताकि आउटलायर और कम गुणवत्ता वाले नाभिक की पहचान की जा सके। नाभिक को केवल डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में शामिल किया गया था जब निम्नलिखित मानदंडों को पूरा किया गया था: i) nFeature_RNA > 500 और nCount_RNA < 20,000; ii) percent.mt < 5%; iii) व्यक्तिगत नाभिक ने एक एकल एचटीओ की स्पष्ट अभिव्यक्ति दिखाई। सेराट में डिफ़ॉल्ट विधि का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति की गणना को सामान्यीकृत किया गया था: 875 (2.71%) जीन अत्यधिक चर जीन (चित्रा 4 ई) के रूप में पाए गए थे। एसएनआरएनए-सीक्यू जीईएक्स को स्केल किया गया था, प्रदर्शन किया गया था और कोहनी साजिश का उपयोग प्रमुख घटकों को शामिल करने का आकलन करने के लिए किया गया था जिनका उपयोग डाउनस्ट्रीम विश्लेषण (चित्रा 4 एफ) के लिए किया जाएगा। कुल मिलाकर, 18 पीसी को शामिल किया गया था। क्लस्टरिंग 0.4 के रिज़ॉल्यूशन के साथ किया गया था।

नाभिक क्लस्टर किए गए थे, और आयाम में कमी (यूएमएपी) 12 व्यक्तिगत समूहों (चित्रा 5 ए) के दृश्य के लिए किया गया था। क्लस्टर प्रति औसत कच्चे जीन गिनती 991.5 और 4,586 (पूरक चित्रा एस 3 ए, बी) के बीच भिन्न होती है। यूएमएपी के भीतर एचटीओ एंटीबॉडी के विभाजन को विज़ुअलाइज़ करने से गैन्ग्लिया के स्पष्ट वितरण का पता चलता है, यह दर्शाता है कि सभी समूहों को प्रत्येक गैंग्लियन (चित्रा 5 बी) में प्रस्तुत किया गया है। एचटीओ नमूना अलगाव की सटीकता को मान्य करने के लिए, एक्स निष्क्रिय विशिष्ट प्रतिलेख (एक्सिस्ट, निष्क्रिय महिला एक्स गुणसूत्र में व्यक्त) की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन पुरुष नमूनों और महिला नमूनों (चित्रा 5 सी) की पहचान करने के लिए किया गया था। एक्सिस्ट अभिव्यक्ति हैशटैग लेबलिंग के अनुसार थी, यह दर्शाती है कि एचटीओ 1-4 लेबल वाले नमूने महिला नमूने थे, और एचटीओ 5-8 लेबल वाले नमूने पुरुष नमूने थे। इससे पता चलता है कि क्यूरेटेड एचटीओ लेबलिंग अत्यधिक विशिष्ट है।

वर्तमान विधि के साथ अनुक्रमण डेटा की गुणवत्ता और संकल्प को और सत्यापित करने के लिए, सहानुभूति न्यूरॉन्स के कुछ प्रमुख टेपों की पहली बार जांच की गई थी। परिणाम सहानुभूति न्यूरॉन्स की उपस्थिति दिखाते हैं जो क्लस्टर 5 और 7 (चित्रा 5 डी-एफ) में थ, डीबीएच और स्नैप 25 को अत्यधिक व्यक्त करते हैं। उपग्रह ग्लियाल कोशिकाओं को समूहों 0-3 (चित्रा 5 जी) 20 में एस 100 बी की अभिव्यक्ति के साथ पता लगाया गया था। एंडोथेलियल कोशिकाओं को क्लस्टर 4 में एक्टा 2 (चित्रा 5 आई) की उच्च अभिव्यक्ति के साथ पेकम 1 (चित्रा 5 एच) और क्लस्टर 8 में स्ट्रोमल कोशिकाओं की उच्च अभिव्यक्ति के साथ पाया गया था। ये परिणाम एसएनआरएनए-सीक्यू का उपयोग करके सहानुभूति गैंग्लियन के न्यूरोनल, उपग्रह ग्लियल, एंडोथेलियल और स्ट्रोमल कोशिकाओं के सफल नाभिक कैप्चर का समर्थन करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: वयस्क माउस बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैन्ग्लिया और तारामय गैन्ग्लिया का विच्छेदन( ए) एससीजी के स्थान की ब्राइटफील्ड छवि। (बी) विज़ुअलाइज़ेशन को सुविधाजनक बनाने के लिए, एक डब्ल्यूएनटी 1 सीआरई; एमटी / एमजी माउस का उपयोग किया गया था। तारांकन एससीजी (ईजीएफपी +) को इंगित करते हैं, तीर कैरोटिड धमनी के विभाजन का संकेत देते हैं। बाएं पैनल, चरण विपरीत छवि; सही पैनल, फ्लोरोसेंट छवि। (सी) एसटीजी के स्थान की ब्राइटफील्ड छवि (डी) तारांकन एसटीजी (ईजीएफपी +) को इंगित करते हैं, धराशायी रेखाएं एमसीएल को इंगित करती हैं। बाएं पैनल, चरण विपरीत छवि; सही पैनल, फ्लोरोसेंट छवि। (ई) विच्छेदित गैन्ग्लिया को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत आगे की सफाई के लिए अलग से पेट्री डिश में स्थानांतरित किया जाता है। (एफ) बाएं पैनल, कैरोटिड धमनी के साथ विच्छेदित एससीजी अभी भी संलग्न है। धराशायी रूपरेखा एससीजी को इंगित करती है। सही पैनल, विच्छेदित और साफ एसटीजी में एक उल्टे त्रिकोण का आकार होता है, जैसा कि धराशायी रूपरेखा द्वारा इंगित किया गया है। स्केल बार = 1,000 μm। संक्षेप: एससीजी = बेहतर ग्रीवा गैन्ग्लिया; एसटीजी = तारामय गैन्ग्लिया; एमसीएल = मस्कुलस कोली लॉन्गस; ईजीएफपी = बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एसएनआरएनए-सीक्यू के लिए नमूना तैयारी और हैशटैग धुंधला-आधारित मल्टीप्लेक्सिंग का वर्कफ़्लो। फ़्लोचार्ट में गैंग्लियनिक कोशिकाओं (नारंगी), नाभिक अलगाव (नीला), और हैशटैग एंटीबॉडी धुंधला और मल्टीप्लेक्सिंग (हरा) के पृथक्करण से चरणों को दर्शाया गया है जो एसएनआरएनए-सीक्यू के लिए किए जाते हैं। संक्षेप: एफबीएस = भ्रूण गोजातीय सीरम; एसटी-एसबी = एसटी धुंधला बफर; एसएनआरएनए-सीक्यू = एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: नाभिक अलगाव और जीन अभिव्यक्ति पुस्तकालय तैयारी का गुणवत्ता नियंत्रण (ए) एचटीओ-दाग वाले नाभिक की चरण-विपरीत छवि। नाभिक को तीरों के साथ इंगित किया जाता है। (बी) 1सेंट स्ट्रैंड सीडीएनए (शीर्ष), जीईएक्स लाइब्रेरी (मध्य), और एचटीओ लाइब्रेरी (नीचे) के बायोएनालाइजर परिणाम। संक्षेप: जीईएक्स = जीन अभिव्यक्ति; एचटीओ = हैशटैग ओलिगो। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: हैशटैग ओलिगो लेबलिंग दक्षता का गुणवत्ता नियंत्रण और एसएनआरएनए-सीक्यू का गुणवत्ता नियंत्रण (ए) एचटीओ धुंधला का हीटमैप हैशटैग एंटीबॉडी के साथ 10 मिनट के इनक्यूबेशन समय के साथ हासिल किया गया। (बी-डी) जीन की संख्या को दर्शाते हुए गुणवत्ता नियंत्रण मैट्रिक्स के वायलिन भूखंड (nFeature_RNA, बी); यूएमआई की संख्या (nCount_RNA, सी); माइटोकॉन्ड्रियल गिनती का प्रतिशत (percent.mt, डी)। (ई) अनुक्रमित कुल 32,285 जीनों में से, 875 (2.71%) को स्कैटर प्लॉट में कल्पना के रूप में अत्यधिक चर विशेषताओं के रूप में पहचाना गया था। (एफ) क्लस्टरिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले सच्चे संकेत को शामिल करने का निर्धारण करने के लिए पीसी की कोहनी साजिश। संक्षेप: एसएनआरएनए-सीक्यू = एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण; एचटीओ = हैशटैग ओलिगो; पीसी = प्रमुख घटक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एसएनआरएनए-सीक्यू के विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम (ए) क्लस्टर एसएनआरएनए-सीक्यू डेटासेट के यूएमएपी प्लॉट। (बी) पूल किए गए एचटीओ नमूनों के वितरण की कल्पना करने वाले यूएमएपी प्लॉट। (सी) वायलिन प्लॉट डिमल्टीप्लेक्सिंग के बाद महिला नमूनों (उच्च एक्सिस्ट अभिव्यक्ति) को मान्य करता है। (डी-आई) चयनित मार्कर जीन प्रदर्शित करने वाले यूएमएपी भूखंड; क्लस्टर अत्यधिक संबंधित जीन ों को व्यक्त करते हैं जो लाल हलकों के भीतर इंगित किए जाते हैं: डी-एफ, सहानुभूति न्यूरॉन्स (वें, डीबीएच, स्नैप 25); (जी) उपग्रह ग्लियाल कोशिकाएं (एस 100 बी); (एच) एंडोथेलियल कोशिकाएं (पेकैम 1); (आई) स्ट्रोमल कोशिकाएं (एक्टा 2)। संक्षेप: एसएनआरएनए-सीक्यू = एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण; एचटीओ = हैशटैग ओलिगो; यूमैप = एक समान कई गुना सन्निकटन और प्रक्षेपण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा एस 1: एक प्रतिनिधि एकल-नाभिक अनुक्रमण परिणाम की गुणवत्ता नियंत्रण मीट्रिक। उपयोग किए गए हैशटैग एंटीबॉडी की डिमल्टीप्लेक्सिंग क्षमता को देखने वाले व्यक्तिगत नमूनों के एचटीओ अभिव्यक्ति प्रोफाइल। संक्षिप्त नाम: एचटीओ = हैशटैग ओलिगो। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: 30 मिनट के लिए एचटीओ एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किए गए बाद के नमूनों के एचटीओ अभिव्यक्ति हीटमैप। चित्रा 4 ए के साथ एचटीओ डिमल्टीप्लेक्सिंग के बाद नकारात्मक-लेबल वाले नाभिक की संख्या की तुलना एंटीबॉडी इनक्यूबेशन समय को लम्बा खींचने के बाद नाभिक लेबलिंग का एक उल्लेखनीय सुधार दिखाती है। संक्षिप्त नाम: एचटीओ = हैशटैग ओलिगो। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 3: क्लस्टर प्रति जीन अभिव्यक्ति के औसत और क्वांटाइल्स। (ए) प्रत्येक क्लस्टर की मेडियन गैर-शून्य कच्चे जीन अभिव्यक्ति। (बी) प्रत्येक क्लस्टर के गैर-शून्य कच्चे जीन अभिव्यक्ति के वर्णनात्मक आंकड़े। प्रश्न 1: 25वें प्रतिशतक, क्यू 3: 75वें प्रतिशतक। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां, एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जो i) वयस्क माउस बेहतर ग्रीवा और तारामय सहानुभूति गैन्ग्लिया के विच्छेदन पर केंद्रित है, द्वितीय) गैंग्लियन कोशिकाओं के अलगाव और क्रायोप्रिजर्वेशन, iii) नाभिक अलगाव, और iv) मल्टीप्लेक्सिंग उद्देश्यों और एसएनआरएनए-सीक्यू के लिए एचटीओ लेबलिंग के साथ नाभिक-बारकोडिंग।

इस प्रोटोकॉल के साथ, सहानुभूति गैंग्लियन कोशिकाओं को आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले ट्रिप्सिन और कोलेजेनेज का उपयोग करके व्यक्तिगत गैन्ग्लिया को अलग करके आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। पृथक गैंग्लियनिक कोशिकाओं का दीर्घकालिक संरक्षण भी 10% डीएमएसओ के साथ पूरक एफबीएस में कोशिकाओं को ठंडा करके आसानी से प्राप्त किया जाता है, जिसने विगलन के बाद वसूली की उच्च गुणवत्ता दिखाई। इसके अलावा, पारंपरिक एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण की तुलना में, एचटीओ धुंधला-आधारित नाभिक-बारकोडिंग के आवेदन के साथ संयुक्त एकल मूत्र सहानुभूति गैन्ग्लिया के ड्रॉपलेट-आधारित एसएनआरएनए-सीक्यू के उपयोग के निम्नलिखित फायदे हैं: i) नमूनों को लंबे समय तक संरक्षित किया जा सकता है जब तक कि सभी नमूने आगे नाभिक अलगाव के लिए तैयार न हों; कई छोटे आकार के गैन्ग्लिया से अलग अच्छी गुणवत्ता के नाभिक को अलग-अलग नमूना तैयारी के कारण बैच प्रभाव के बिना अनुक्रमण के लिए एक साथ पूल किया जा सकता है; iii) नाभिक बारकोड का उपयोग करके अनुक्रमण के बाद अलग-अलग गैंग्लियन मूल का पता लगाने की क्षमता; और iv) लागत-प्रभावशीलता, क्योंकि केवल एकल पुस्तकालय तैयारी की आवश्यकता होती है। महत्वपूर्ण रूप से, वर्णित अलगाव और सेल संस्कृति प्रोटोकॉल मूत्र ग्रीवा और तारामय गैन्ग्लिया दोनों के लिए एक एकल समान विधि प्रदान करता है और संभावित रूप से अन्य गैन्ग्लिया, जैसे पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया और अन्य प्रजातियों, जैसे, मानव गैन्ग्लिया पर लागू होता है।

एससीआरएनए-सीक्यू के प्रमुख फायदों में से एक (उपन्यास) सेल प्रकारों की पहचान करने और दुर्लभ सेल आबादी को प्रकट करने की क्षमता है जिसे थोक आरएनए-सीक्यू द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है। छोटी बूंद-आधारित एससीआरएनए-सीक्यू प्लेटफ़ॉर्म अधिक कोशिकाओं को पकड़ने की सुविधा प्रदान करता है। इस प्रकार यह प्लेट-आधारित अनुक्रमण मंच की तुलना में सेल (उप) प्रकारों और एक बड़ी सेल आबादी की ट्रांसक्रिप्शनल विषमता का एक समग्र दृश्य प्रदान कर सकता है। हालांकि, छोटी बूंद-आधारित (उदाहरण के लिए, 10x क्रोमियम) प्लेटफ़ॉर्म 50 μm से बड़ी कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं है, जो मानव न्यूरॉन्स (~ 100 μm) जैसी बड़ी कोशिकाओं में इसके आवेदन को सीमित करता है। एसएनआरएनए-सीक्यू तकनीक की उपलब्धता एक नाभिक के छोटे आकार के कारण इस खामी को दूर करती है। इसके अलावा, एसएनआरएनए-सीक्यू न्यूरॉन्स और जमे हुए ऊतकों जैसे अत्यधिक परस्पर जुड़े और कम उपज वाली कोशिकाओं के जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए एक उपयोगी विधि है।

यद्यपि पूर्व सेल पृथक्करण के बिना ऊतकों से नाभिक को सीधे अलग करना संभव है, उपज के लिए दो-चरणीय नाभिक अलगाव विधि लेना फायदेमंद था जो पहले एकल कोशिकाओं (जिसे तरल नाइट्रोजन में संरक्षित किया जा सकता है) में गैंग्लियन को अलग करता है नाभिक अलगाव के बाद। माउस सहानुभूति नाड़ीग्रन्थि के छोटे आकार के कारण, यह पाया गया कि एक-चरणीय नाभिक अलगाव दृष्टिकोण की तुलना में दो-चरणीय नाभिक अलगाव विधि का उपयोग करके अधिक नाभिक प्राप्त किए गए थे। सीडीएनए, पुस्तकालय और अनुक्रमण विश्लेषण की गुणवत्ता की जांच अच्छे नाभिक / आरएनए गुणवत्ता को इंगित करती है। इसके अलावा, रसद में सुधार किया जाता है, क्योंकि नमूनों को एकत्र किया जा सकता है और सामूहिक अनुक्रमण से पहले अलग-अलग समय बिंदुओं पर संग्रहीत किया जा सकता है। एकल-नाभिक विश्लेषण ने न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं की सफल वसूली और कब्जा करने का भी खुलासा किया, यह सुझाव देते हुए कि वर्णित दो-चरणीय नाभिक अलगाव दृष्टिकोण छोटे ऊतकों में आवेदन के लिए बेहतर अनुकूल हो सकता है।

इस प्रोटोकॉल का एक और लाभ बारकोडेड एंटीबॉडी21 के साथ मल्टीप्लेक्सिंग है। माउस सहानुभूति नाड़ीग्रन्थि एक छोटा ऊतक (औसत आकार 0.1 मिमी3) है, और एक व्यक्तिगत नाड़ीग्रन्थि से व्युत्पन्न कोशिकाओं की कम संख्या अपने आप में छोटी बूंद-आधारित अनुक्रमण के लिए अपर्याप्त है। हालांकि, एक ही माउस के विभिन्न चूहों या अलग-अलग गैन्ग्लिया के कई गैन्ग्लिया पूलिंग से व्यक्तिगत माउस जानकारी या व्यक्तिगत गैंग्लियन जानकारी का नुकसान होगा। एक समाधान के रूप में, एचटीओ धुंधला चरण प्रदर्शन करना आसान है और नाभिक पूलिंग से पहले विभिन्न चूहों या विभिन्न गैन्ग्लिया से प्राप्त नाभिक के बारकोडेड लेबलिंग को सक्षम बनाता है। एचटीओ डीमल्टीप्लेक्सिंग की सटीकता को इस प्रोटोकॉल में ज्ञात महिला नाभिक आबादी में मिलान किए गए एक्सिस्ट अभिव्यक्ति द्वारा सत्यापित किया जाता है। बारकोडेड एंटीबॉडी के साथ न्यूक्लियस मल्टीप्लेक्सिंग, इसलिए, बैच प्रभाव को कम करता है और अनुक्रमण लागत को कम करता है।

एसएनआरएनएसेक की एक संभावित सीमा यह हो सकती है कि नाभिक में नवजात टेप की प्राकृतिक उपस्थिति के कारण नाभिक और साइटोप्लाज्म में आरएनए संरचना के बीच अंतर हो सकता है, जो न्यूरोनल गतिविधियों22,23 के लिए प्रारंभिक प्रतिक्रिया से जुड़ा हुआ है। नाभिक और साइटोप्लाज्म भी सेल चक्र राज्य24 के आधार पर टेप में भिन्न हो सकते हैं। एक कोशिका (~ 11,000 जीन) 14 की तुलना में एक व्यक्तिगत नाभिक (~ 7,000 जीन) में कम टेप का पता चला था। इसलिए, एससीआरएनए-सीक्यू और एसएनआरएनए-सीक्यू एक प्रतिलेख स्तर पर अलग-अलग परिणाम दे सकते हैं। फिर भी, एससीआरएनए-सीक्यू और एसएनआरएनए-सीक्यू के बीच तुलना ने मस्तिष्क के ऊतकों के न्यूरोनल सेल प्रकारों को भेदभाव करने की एक समान क्षमता का प्रदर्शनकिया 14. एसएनआरएनए-सीक्यू द्वारा अत्यधिक समान सेल प्रकार या उपप्रकारों के बीच भेदभाव में सुधार करने के लिए, एससीआरएनए-सीक्यू की तुलना में कम जीन का पता लगाने की क्षमता की क्षतिपूर्ति के लिए अधिक नाभिक की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, हालांकि एचटीओ डिमल्टीप्लेक्सिंग की सटीकता पर्याप्त है, कुछ डेटा का नुकसान अपरिहार्य है क्योंकि सभी नाभिक एचटीओ विशिष्टता नहीं दिखाते हैं। एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के आगे अनुकूलन एचटीओ की डबल या नकारात्मक अभिव्यक्ति के साथ नाभिक की संख्या को कम कर सकता है।

एक साथ लिया गया, यह प्रोटोकॉल नाड़ीग्रन्थि अलगाव से कोशिकाओं के कम इनपुट की नाभिक तैयारी के लिए गैंग्लियन अलगाव से शुरू होने वाले एक आसान-से-पालन वर्कफ़्लो के माध्यम से सहानुभूति गैन्ग्लिया से न्यूरोनल नाभिक को अनुक्रमित करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्रदान करता है, इसके बाद एसएनआरएनए-सीक्यू के लिए एचटीओ धुंधला-आधारित नाभिक लेबलिंग। प्रोटोकॉल उन सभी प्रमुख चरणों का विस्तृत अवलोकन प्रदान करता है जिन्हें आसानी से किया जा सकता है और मूत्र और अन्य प्रजातियों में विभिन्न गैन्ग्लिया पर लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए ब्याज का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम प्रयोगात्मक डिजाइन और उपयोगी चर्चाओं में उनकी मदद के लिए सुसान एल क्लोएट (मानव आनुवंशिकी विभाग, एलयूएमसी, लीडेन, नीदरलैंड) का धन्यवाद करते हैं। हम एकल-नाभिक आरएनए अलगाव और अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय की तैयारी के साथ मदद के लिए एमिल जे डी मीजर (मानव आनुवंशिकी विभाग, एलयूएमसी, लीडेन, नीदरलैंड) का धन्यवाद करते हैं। यह काम नीदरलैंड ऑर्गेनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (एनडब्ल्यूओ) [016.196.346 से एमआरएमजे] द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals and reagents
0.25% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25200056
0.4% trypan blue dye Bio-Rad 1450021
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240096
B-27 Gibco A3582801
Collagenase type 2 Worthington LS004176 use 1,400 U/mL
Dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich 67685
Ethanol absolute ≥99.5% VWR VWRC83813.360
Fetal bovine serum (low endotoxin) Biowest S1810-500
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030024
Neurobasal Medium Gibco 21103049
Bovine Serum Albumin 10% Sigma-Aldrich A1595-50ML Cell wash buffer
DPBS (Ca2+, Mg2+free) Gibco 14190-169 Cell wash buffer
Magnesium Chloride Solution, 1 M Sigma-Aldrich M1028 Nucleus Lysis buffer
Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent) Sigma-Aldrich 74385 Nucleus Lysis buffer
Nuclease free water (not DEPC-treated) Invitrogen AM9937 Nucleus Lysis buffer
Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL Sigma-Aldrich 3335399001 Nucleus Lysis buffer
Sodium Chloride Solution, 5 M Sigma-Aldrich 59222C Nucleus Lysis buffer
Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4 Sigma-Aldrich T2194 Nucleus Lysis buffer
Bovine Serum Albumin 10% Sigma-Aldrich A1595-50ML Nucleus wash
DPBS (Ca2+, Mg2+free) Gibco 14190-169 Nucleus wash
Protector RNase Inhibitor,40 U/µL Sigma-Aldrich 3335399001 Nucleus wash
Bovine Serum Albumin 10% Sigma-Aldrich A1595-50ML ST staining buffer (ST-SB)
Calcium chloride solution, 1 M Sigma-Aldrich 21115-100ML ST staining buffer (ST-SB)
Magnesium Chloride Solution, 1 M Sigma-Aldrich M1028 ST staining buffer (ST-SB)
Nuclease free water (not DEPC treated) Invitrogen AM9937 ST staining buffer (ST-SB)
Sodium Chloride Solution, 5M Sigma-Aldrich 59222C ST staining buffer (ST-SB)
Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4 Sigma-Aldrich T2194 ST staining buffer (ST-SB)
Tween-20 Merck Millipore 822184 ST staining buffer (ST-SB)
TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody Biolegend 682205 Hashtag antibody
TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody Biolegend 682207 Hashtag antibody
TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody Biolegend 682209 Hashtag antibody
TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody Biolegend 682225 Hashtag antibody
TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody Biolegend 682227 Hashtag antibody
TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody Biolegend 682229 Hashtag antibody
TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody Biolegend 682231 Hashtag antibody
TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody Biolegend 682233 Hashtag antibody
TruStain FcX (human) Biolegend 422302 FC receptor blocking solution
Equipment and consumables
Bright-Line Hemacytometer Merck Z359629-1EA
Centrifuge 5702/R A-4-38 Eppendorf  EP022629905
CoolCell LX Cell Freezing Container Corning CLS432003-1EA
Cryovial Thermo Scientific 479-6840
DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube Eppendorf EP0030108035-250EA
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppendorf 30121872
Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish Corning 351008
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher scientific 10773501
Forceps Dumont #5 Fine science tools 11252-40
Hardened Fine Scissors Fine science tools 14091-09
 Ice Pan, rectangular 4 L Orange Corning CLS432106-1EA
Leica MS5 Leica Microscope
Moria MC50 Scissors Fine science tools 15370-50
Noyes Spring Scissors Fine science tools 15012-12
Olympus CK2 ULWCD Olympus Microscope
P10 Gilson F144802
P1000 Gilson F123602
P200 Gilson F123601
Preseparation Filters (30 µm) Miltenyi biotec Miltenyi biotec130-041-407
Shaking water bath GFL 1083
Silicon plate RubberBV 3530 Dissection board
Software and packages
Cell ranger V4.0.0
R programming V4.1.1
R sudio V1.3.1073
Seurat V4.0
tydiverse V1.3.1
Animals
B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse The Jackson Laboratory JAX stock #022501
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse The Jackson Laboratory JAX stock #007576
C57BL/6J mice Charles River
Code for the data analysis
https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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चिकित्सा अंक 181
एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए माउस सहानुभूति गैन्ग्लिया के बारकोडेड एंटीबॉडी के साथ कम इनपुट न्यूक्लियस अलगाव और मल्टीप्लेक्सिंग
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