Summary
Denne protokollen beskriver den detaljerte prøveforberedelsen med lav inngang for sekvensering av enkeltkjerner, inkludert disseksjon av musoverlegne cervical og stellate ganglia, celledissosiasjon, kryopreservering, kjerneisolasjon og hashtag-barkoding.
Abstract
Hjerte autonominervesystemet er avgjørende for å kontrollere hjertefunksjon, for eksempel hjertefrekvens og hjertekontraktilitet, og er delt inn i sympatiske og parasympatiske grener. Normalt er det en balanse mellom disse to grenene for å opprettholde homeostase. Imidlertid kan hjertesykdomstilstander som hjerteinfarkt, hjertesvikt og hypertensjon indusere ombygging av celler involvert i hjerteintroverasjon, som er forbundet med et negativt klinisk utfall.
Selv om det er store mengder data for den histologiske strukturen og funksjonen til hjerte autonominervesystemet, er den molekylære biologiske arkitekturen i helse og sykdom fortsatt gåtefull i mange aspekter. Nye teknologier som encellet RNA-sekvensering (scRNA-seq) holder løfte om genetisk karakterisering av vev ved encellet oppløsning. Imidlertid kan den relativt store størrelsen på nevroner hindre standardisert bruk av disse teknikkene. Her utnytter denne protokollen dråpebasert enkeltkjerne RNA-sekvensering (snRNA-seq), en metode for å karakterisere den biologiske arkitekturen til hjerte-sympatiske nevroner i helse og sykdom. En trinnvis tilnærming er demonstrert for å utføre snRNA-seq av bilateral overlegen cervical (SCG) og stellate ganglia (StG) dissekert fra voksne mus.
Denne metoden muliggjør langsiktig prøvebevaring, og opprettholder en tilstrekkelig RNA-kvalitet når prøver fra flere individer / eksperimenter ikke kan samles inn på en gang innen kort tid. Barkoding av kjernene med hashtag oligos (HTOer) muliggjør demultiplexing og spor-back av distinkte gangitoniske prøver etter sekvensering. Påfølgende analyser avdekket vellykket nukleifangst av nevronale, satellitt glial og endotelceller i den sympatiske ganglia, som validert av snRNA-seq. Oppsummert gir denne protokollen en trinnvis tilnærming for snRNA-seq av sympatisk ekstrinsisk hjerte ganglia, en metode som har potensial for bredere anvendelse i studier av innervering av andre organer og vev.
Introduction
Det autonome nervesystemet (ANS) er en avgjørende del av det perifere nervesystemet som opprettholder kroppens homeostase, inkludert tilpasning til miljøforhold og patologi1. Det er involvert i regulering av flere organsystemer i hele kroppen som kardiovaskulære, respiratoriske, fordøyelses- og endokrine systemer. ANS er delt inn i sympatiske og parasympatiske grener. Spinal grener av det sympatiske nervesystemet synapse i ganglia av den sympatiske kjeden, som ligger bilateralt i en paravertebrale stilling. Den bilaterale cervical og thoracic ganglia, spesielt StG, er viktige komponenter som deltar i hjerte sympatisk innervering. I sykdomstilstander, som hjerte iskemi, kan nevronal ombygging oppstå, noe som resulterer i en sympatisk overdrive2. Den nevronale ombyggingen har blitt demonstrert i flere histologiske studier hos mennesker og flere andre dyrearter 3,4,5,6. En detaljert biologisk karakterisering av hjerte iskemi-indusert nevronal ombygging i hjerte sympatisk ganglia mangler for tiden, og de grunnleggende biologiske egenskapene til spesialiserte nevronale celletyper eller undertyper innen hjerte-sympatisk nervesystem (SNS) er ikke fullt ut bestemt ennå i helse og sykdom7.
Nye teknologier, som scRNA-seq, har åpnet gateways for genetisk karakterisering av små vev på et enkeltcellet nivå 8,9. Imidlertid kan den relativt store størrelsen på nevroner hindre optimalisert bruk av disse encellede teknikkene hos mennesker10. I tillegg krever enkeltcellesekvensering en høy gjennomstrømning av celler for å gjenopprette et tilstrekkelig cellenummer på grunn av høyt tap i sekvenseringsprosessen. Dette kan vise seg utfordrende når du studerer små vev som er vanskelig å fange i en økt og krever flere prøver for å introdusere nok enkeltceller for sekvensering. Den nylig utviklede dråpebaserte snRNA-seq-teknologien (dvs. 10x Chromium-plattformen) gjør det mulig å studere biologiske forskjeller mellom enkeltkjerner11,12. snRNA-seq har en fordel i forhold til scRNA-seq for store celler (>30 μm), som kanskje ikke fanges opp i Gel Bead i Emulsions (GEMs), samt forbedret kompatibilitet med omfattende dissosiasjon og / eller langvarig bevaring 13,14,15.
Heterogenitet, antall nevronceller og andre celler beriket i hjerte-SNS er viktige aspekter for karakteriseringen av ANS i helse- og sykdomstilstander. I tillegg bidrar den organ- eller regionspesifikke innervasjonen ved hver sympatisk ganglion til kompleksiteten i SNS. Videre har cervical, stellate og thoracic ganglia av den sympatiske kjeden vist seg å innervate forskjellige regioner i hjertet16. Derfor er det nødvendig å utføre enkjerneanalyse av gangioniske celler avledet fra individuelle ganglia for å studere deres biologiske arkitektur.
Dråpebasert snRNA-seq tillater transkripsjonsomfattende uttrykksprofilering for et utvalg av tusenvis av celler fra flere prøver samtidig med lavere kostnader enn platebaserte sekvenseringsplattformer. Denne tilnærmingen gjør at dråpebasert snRNA-seq er mer egnet for cellulær fenotypeklassifisering og ny subbefolkningsidentifikasjon av celler i SCG og StG. Spesielt gir denne protokollen en kortfattet trinnvis tilnærming for identifisering, isolasjon og enkeltkjerne RNA-sekvensering av sympatisk ekstrinsisk hjerte ganglia, en metode som har potensial for en bred anvendelse i studier av karakterisering av ganglia innervating andre relaterte organer og vev i helse og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen beskriver alle trinnene som kreves for snRNA-seq av murine cervical og / eller cervicothoracic (stellate) ganglia. Kvinnelige og mannlige C57BL/6J mus (15 uker gamle, n = 2 for hvert kjønn) ble brukt. En ekstra Wnt1-Cre;mT/mG-mus ble brukt til å visualisere ganglia for disseksjonsformål17,18. Denne ekstra musen ble generert ved kryssavling av en B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J-mus og en B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J-mus. Alle dyreforsøk ble utført i henhold til Guide for Care and Use of Laboratory Animals publisert av NIH og godkjent av Animal Ethics Committee ved Leiden University (Lisensnummer AVD1160020185325, Leiden, Nederland). Se materialtabellen for detaljer om alt materiale, utstyr, programvare og dyr som brukes i protokollen.
1. Forberedelser
MERK: Alle trinnene utføres i et cellekulturflytskap.
- Rengjør tang og saks ved å nedsenke instrumentene i 70% etanol i 20 minutter.
- Forbered ganglionmediet bestående av Neurobasal Medium supplert med B-27 pluss (1x), L-glutamin (2 mM) og 1% antibiotika-antimykotika. Prewarm ganglion medium ved romtemperatur.
- Forbered fordøyelsesløsningen: 0,25% Trypsin-EDTA (1:1) og 1400 U / ml kollagenaliser type 2 oppløst i ganglionmediet.
- Forbered fersk, kald (4 °C) cellevaskbuffer (0,4 % bovint serumalbumin [BSA]) og lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 og 0,1 % ikke-ionisk vaskemiddel, 40 U/ml RNAse i nukleasefritt vann) for kjernen.
- Klargjør kjernevaskbuffer (1x fosfatbufret saltvann [PBS] med 2,0 % BSA og 0,2U/μL RNase-hemmer).
- Forbered ST-fargebuffer (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 2% BSA, 0,02% Tween-20 i nukleasefritt vann).
2. Disseksjon av voksen mus overlegen Cervical ganglia (SCG)
- Euthanize musene og hold dem på is.
MERK: I den nåværende studien ble totalt 4 C57BL6/J-mus avlivet av CO 2-kvælning. Alternativt kan isofluran brukes etterfulgt av ekssanguinasjon når en stor mengde blod må samles inn til andre studieformål. - Fest musen på et disseksjonsbrett med pinner og bruk den med 70% etanol for å minimere spredningen av pels (barbering er ikke nødvendig).
- Under et stereomikroskop åpner du huden i nakkeregionen ved å lage en midtlinje kuttet med saks, flytte submandibulære kjertler til side, og fjerne sternomastoidmuskelen for å avsløre og finne den vanlige halspulsåren og dens bifurcation (Figur 1A, B, se pil).
- Disseker høyre og venstre halspulsåre bifurkasjon og vevet festet til den. Overfør hvert dissekerte stykke vev til en separat 3,5 cm Petri-tallerken som inneholder kald PBS.
- Se etter SCG festet til karotisbifurkasjonen. Rengjør SCG ytterligere ved å fjerne arterien og annet vedlagt vev i Petri-parabolen (figur 1E).
3. Disseksjon av voksen mus stellate ganglia (StG)
- For å dissekere StG, gjør en midline kutt i magen, etterfulgt av å åpne membranen og ventral thoracic veggen.
- Fjern hjertet og lungene for å eksponere dorsal thorax. Se etter venstre og høyre StG anterolateral til musculus colli longus (MCL) på nivået av den første ribben (Figur 1C, D, indikert med stiplede linjer).
- Disseker både venstre og høyre StG med tang og overfør dem separat til 3,5 cm Petri-retter som inneholder kald PBS (figur 1F).
4. Isolasjon og kryopreservering av mus gangioniske celler
Trinn 4-6 er oppsummert i figur 2.
- Overfør forsiktig alle individuelle SCG og StG for å skille 1,5 ml mikrosenterrør med tang.
MERK: Ikke bruk pipettespisser til å overføre ganglia fordi ganglia er tilbøyelige til å feste seg til veggen av plastpipettespisser. - Tilsett 500 μL 0,25% trypsin-EDTA-oppløsning til hvert mikrocentrifugerør og inkuber i et ristende vannbad ved 37 °C i 40 minutter.
MERK: Dette trinnet er rettet mot å lette fordøyelsen og celleutløsningen heretter i kollagentype 2-løsningen. - Forbered et 15 ml rør som inneholder 5 ml ganglion medium for hver prøve. La gangliaen slå seg ned på bunnen av mikrocentrifugerørene. Samle supernatanten, som inneholder svært få gangioniske celler, overfør supernatanten til de forberedte 15 ml rørene, og merk hvert rør. Alternativt, for å spare litt tid, aspirere trypsin-EDTA supernatant uten samling, da svært få dissosierte celler kan oppdages i den.
MERK: En liten mengde trypsin-EDTA-oppløsning (~10-30 μL) kan etterlates i mikrocentrifugerøret for å unngå fjerning av ganglia. Unngå pipettering på dette trinnet fordi det kan skade ganglia og føre til lav utgang av gangioniske celler etterpå. - Tilsett 500 μL kollagenalus type 2 oppløsning i hvert mikrosenterrør og inkuber i et ristende vannbad ved 37 °C i 35-40 min. Prøv å gjenopplive ganglion etter 35 min; Hvis ganglion fortsatt er intakt og ikke dissosierer, forlenge inkubasjonstiden eller øke konsentrasjonen av kollagenalisse type 2-løsning etter behov.
MERK: Inkubasjonstiden kan variere avhengig av ganglionstørrelsen. - Resuspend ganglia i kollagenoppløsning ved pipettering opp og ned ~ 10 ganger eller til vevsklumper ikke lenger oppdages.
- Overfør cellefjæringen til det tidligere brukte 15 ml-røret som inneholder gangliakulturmediet og trypsin-EDTA-suspensjonen fra samme ganglion. Spinn ned cellefjæringen med en svingende bøtterotor sentrifuge i 10 min, 300 × g ved romtemperatur. Kast forsiktig cellen supernatant.
MERK: Fordi de gangioniske cellene er dissosiert fra en enkelt ganglion, kan cellepellet være for liten til å oppdage ved øye; en liten mengde supernatant kan bli igjen i røret for å unngå utilsiktet fjerning av cellepellet. - Resuspend ganglionic cellene i 270 μL av foster bovin serum (FBS, lav endotoksin) og overføre hver celle-FBS suspensjon til en 1 ml kryofil.
- For å telle cellene, bland 5 μL av den gangioniske cellefjæringen med 5 μL 0,4% trypanblå fargestoff og last blandingen inn i et hemocytometer. Tell totalt antall og aktive celler under et mikroskop.
MERK: Celle levedyktigheten (antall levende celler/totalt celleantall = levedyktighet %) er vanligvis over 90 % med denne dissosiasjonsprotokollen. Live celletallet til en enkelt ganglion (enten SCG eller StG) faller vanligvis innenfor området 9,000-60,000 celler når ganglion er isolert fra en mus i alderen 12 til 16 uker. - Tilsett 30 μL dimetylsulfoksid (DMSO) til hver celle-FBS-suspensjon i kryoblandene, bland godt og overfør kryoblamene til en cellefrysingsbeholder, som holdes ved romtemperatur. Oppbevar den kryonale ladde beholderen ved -80 °C over natten, og overfør kryopiene til flytende nitrogen neste dag for langvarig bevaring før sekvensering.
5. Kjerneisolasjon
MERK: Venstre og høyre SCG isolert fra fire mus (totalt 8 prøver) ble brukt som eksempel i følgende kjerneisolasjon og sekvenseringspreparat. Hold alt på is under hele prosedyren. På grunn av usynligheten av små kjernepellets, anbefales en sentrifuge med svingende bøtter sterkt for å lette supernatant fjerning gjennom hele prosedyren.
- Forbered 15 ml rør med en sil (30 μm) på toppen og forskyl silen med 1 ml ganglion medium.
- Ta ut kryovialene fra flytende nitrogen og tin dem umiddelbart i et vannbad ved 37 °C. Når en liten ispellet er igjen i kryonalen, ta kryovariene ut av vannbadet.
- Gjenopprett de gangioniske cellene ved å slippe 1 ml av ganglionmediet inn i hvert kryolegeale mens du rister forsiktig for hånd. Valgfritt: For å evaluere cellegjenoppretting, bland cellesuspensjonen etter gjenoppretting og ta 5 μL celleoppheng ut for live-celletelling, som beskrevet i trinn 4.8.
- Last hver gangionisk cellefjæring på en separat sil (fremstilt i trinn 5.1) og skyll hver sil med 4-5 ml ganglionmedium.
- Sentrifuger den anstrengte cellefjæringen i 5 min ved 300 × g, fjern supernatanten forsiktig og resuspend cellene i 50 μL cellevaskbuffer.
- Overfør cellefjæringen til et lavbindende DNA/RNA 0,5 ml mikrosenterrør.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 500 × g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern 45 μL av supernatanten uten å berøre bunnen av røret for å unngå å løsne cellepelleten.
- Tilsett 45 μL kjølt Lysis Buffer og rør forsiktig opp og ned ved hjelp av en 200 μL pipettespiss.
- Inkuber cellene i 8 min på is.
- Tilsett 50 μL kaldkjernevaskbuffer til hvert rør. Ikke bland.
- Sentrifuger nukleusfjæringen ved 600 × g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern 95 μL av supernatanten uten å forstyrre kjernepelleten.
- Tilsett 45 μL kjølt kjernevaskbuffer til pelletsen. Valgfritt: Ta 5 μL kjernefjæring, bland med 5 μL 0,4% trypan blå for å telle, og kontroller kvaliteten på kjernen under et mikroskop med et hemocytometer.
- Sentrifuger nukleusfjæringen ved 600 × g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern supernatanten uten å berøre bunnen av røret for å unngå å løsne kjernepellet.
6. Nukleusbarkoding med hashtag oligos (HTOer) og multipleksing
MERK: HTO-fargingstrinn ble modifisert og optimalisert for kjernefysisk merking av svært lave mengder (ganglionic) kjerner i henhold til den forrige applikasjonen i kortikale vev av Gaublomme et al.15.
- Tilsett 50 μL ST-SB buffer i kjernepellet, forsiktig pipette 8-10 ganger til kjernene er helt resuspendert.
- Tilsett 5 μL fc blokkeringsreagens per 50 μL av ST-SB/nukleiblandingen og inkuber i 10 min på is.
- Tilsett 1 μL (0,5 μg) enkeltkjerne hashtag antistoff per rør av ST-SB/nuclei-blandingen og inkuber i 30 minutter på is.
MERK: Kortere inkubasjonstid fører til lavere effektivitet av hashtag-merking, som vist i de representative resultatene. - Tilsett 100 μL ST-SB i hvert rør. Ikke bland.
- Sentrifuger kjernefjæringen i 5 min. 600 × g ved 4 °C.
- Fjern 145 μL av supernatanten uten å forstyrre kjernepelleten.
- Gjenta trinn 6.4 og 6.5. Fjern supernatanten så mye som mulig uten å berøre bunnen av røret for å unngå å løsne kjernepellet.
- Resuspend kjernen pellet i 50 μL ST-SB, og bland forsiktig kjernen.
- Ta 5 μL av kjernen suspensjon og bland den med 5 μL av 0,4% trypan blå for å telle kjernen under et mikroskop. Se figur 3A for et representativt bilde av kjerner blandet med trypan blå og lastet i et hemocytometer.
- Sentrifuger kjernefjæringen i 5 min ved 600 × g ved 4 °C.
- Resuspend kjernene i ST-SB for å oppnå en målkjernekonsentrasjon på 1000-3000 nuklei / μL for hver prøve i henhold til tilsvarende kjerneantall.
- Slå sammen prøvene for å oppnå ønsket antall celler.
MERK: I dette eksperimentet ble for eksempel 8 prøver likt samlet for å oppnå totalt 25 000 kjerner for umiddelbart å gå videre til 10x Genomics Chromium og snRNA-seq etterpå. Kjernen teller vanligvis faller innenfor området 6,000-40,000 celler når ganglion er isolert fra en mus i alderen 12 til 16 uker. Bare rundt halvparten av de totale lastede kjernene kan fanges opp av dråpebasert snRNA-seq. For eksempel ble en 25.000 kjerneblanding forberedt for å sikre fangst av 10.000 kjerner, noe som er nødvendig for ytterligere bibliotekforberedelse og sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvalitetskontrollanalyse av enkeltkjernen cDNA bibliotek forberedelse og snRNA-seq
Representative resultater beskriver sekvenseringsresultater av 10 000 fanget kjerner i et enkelt basseng med et 25 000 lese-/kjernegenuttrykksbibliotek og et 5000 lese-/kjerne-hashtag-bibliotek. Figur 3B illustrerer kvalitetskontrollresultatene fra biblioteket 1st strand cDNA, genuttrykk (GEX) og HTO-biblioteket, som ble sjekket med Bioanalyzer. De HTO-avledede cDNAene forventes å være mindre enn 180 bp, mens mRNA-avledede cDNAer er større enn 300 bp. Et GEX-bibliotek av høy kvalitet kan oppdages som en bred topp fra 300 til 1000 bp, og HTO-biblioteket oppdages som en bestemt topp på 194 bp. Cell Ranger ble brukt til demultiplexing, fastq-filgenerering og lesejustering som standardinnstilling. Seurat R pakke19 ble senere brukt til kvalitetskontroll og nedstrømsanalyser.
Demultiplexing av snRNA-seq-dataene ble utført ved å identifisere HTOer ved hjelp av Seurat innebygd demultiplexing strategi. Demultiplexing evne for hver HTO ble først visualisert med HTO uttrykk filer (Supplerende figur S1). I varmekartet i figur 4A oppdages singlets som kjerner med spesifikt HTO-uttrykk, mens dobler og negativer viser ikke-spesifikke uttrykk for flere eller ingen HTO-er. Vær oppmerksom på at omtrent 33% av kjernene ble oppdaget som negativer ved hjelp av en 10 min HTO antistoffinkubasjonstilnærming. Forlengelse av inkubasjonstiden (trinn 6.3) fra 10 min til 30 min i et påfølgende eksperiment avslørte en bemerkelsesverdig reduksjon i negativt merkede kjerner (Tilleggsfigur S2). Disse funnene indikerer at forlenget inkubasjonstid for antistoff kan forbedre hashtag-effektiviteten.
Fiolinplott i figur 4B-D viser antall gener (nFeature_RNA), antall unike molekylære identifikatorer (UMI) (nCount_RNA) og prosentandelen av mitokondrietall (percent.mt) innenfor snRNA-seq-datasettet for å identifisere outliers og nuklei av lav kvalitet. Nuclei ble bare inkludert i nedstrømsanalysen da følgende kriterier ble oppfylt: i) nFeature_RNA > 500 og nCount_RNA < 20 000; ii) percent.mt < 5%; iii) den enkelte kjernen viste klart uttrykk for en enkelt HTO. Genuttrykkstall ble normalisert ved hjelp av standardmetoden i Seurat: 875 (2,71 %) gener ble påvist som svært variable gener (figur 4E). snRNA-seq GEX ble skalert, ble utført og albueplottet ble brukt til å vurdere inkludering av hovedkomponenter som skulle brukes til nedstrømsanalyser (figur 4F). Totalt ble 18 PCer inkludert. Klynger ble utført med en oppløsning på 0,4.
Kjernene ble gruppert, og dimensjonsreduksjon (UMAP) ble utført for visualisering av de 12 individuelle klyngene (figur 5A). Median rå genantall per klynge varierer mellom 991,5 og 4586 (Supplerende figur S3A, B). Visualisering av oppdelingen av HTO-antistoffene i UMAP avslører en klar fordeling av ganglia, noe som indikerer at alle klynger presenteres i hver ganglion (figur 5B). For å validere nøyaktigheten av HTO-prøvesegregering ble uttrykket for X Inaktiv spesifikk transkripsjon (Xist, uttrykt i det inaktive kvinnelige X-kromosomet) vurdert for å identifisere de mannlige prøvene og de kvinnelige prøvene (figur 5C). Xist-uttrykket var i samsvar med hashtag-merkingen, som viste at HTO 1-4 merkede prøver var kvinnelige prøver, og HTO 5-8 merkede prøver var mannlige prøver. Dette antyder at den kuraterte HTO-merkingen er svært spesifikk.
For ytterligere å verifisere kvaliteten og oppløsningen av sekvenseringsdataene med den nåværende metoden, ble noen viktige transkripsjoner av sympatiske nevroner først undersøkt. Resultatene viser tilstedeværelsen av sympatiske nevroner som høyst uttrykker Th, Dbh og Snap25 i klynge 5 og 7 (figur 5D-F). Satellitt glialceller ble oppdaget med uttrykket S100b i klynger 0-3 (figur 5G)20. Endotelceller ble påvist i klynge 4 med høyt uttrykk for Pecam1 (figur 5H) og stromale celler i klynge 8 med høyt uttrykk for Acta2 (figur 5I). Disse resultatene støtter vellykket nuklei fangst av nevronal, satellitt glial, endotelial, og stromal celler av sympatisk ganglion ved hjelp av snRNA-seq.
Figur 1: Disseksjon av voksen mus overlegen cervical ganglia og stellate ganglia. (A) Brightfield bilde av plasseringen av SCG. (B) For å lette visualiseringen ble det brukt en Wnt1Cre;mT/mG-mus. Stjerner indikerer SCG (eGFP+), pilspisser indikerer bifurkasjonen av halspulsåren. Venstre panel, fasekontrastbilde; høyre panel, fluorescerende bilde. (C) Brightfield bilde av plasseringen av StG. (D) Stjerner indikerer StG (eGFP +), stiplede linjer indikerer MCL. Venstre panel, fasekontrastbilde; høyre panel, fluorescerende bilde. (E) Dissekert ganglia overføres til en Petri-tallerken separat for videre rengjøring under et stereomikroskop. (F) Venstre panel, den dissekerte SCG med halspulsåren fortsatt festet. Stiplet omriss angir SCG. Høyre panel, dissekert og rengjort StG har formen av en omvendt trekant, som angitt av den stiplede konturen. Skalastang = 1000 μm. Forkortelser: SCG = overlegen cervical ganglia; StG = stellate ganglia; MCL = musculus colli longus; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Arbeidsflyt for prøvepreparering og hashtag-fargeleggingsbasert multipleksing for snRNA-seq. Flytskjemaet skildrer trinnene fra dissosiasjon av gangitoniske celler (oransje), kjerneisolasjon (blå) og hashtag antistofffarging og multipleksing (grønn) som utføres for snRNA-seq. Forkortelser: FBS = foster bovint serum; ST-SB = ST farging buffer; snRNA-seq = enkeltkjerne RNA-sekvensering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvalitetskontroll av kjerneisolasjon og klargjøring av genuttrykksbibliotek. (A) Fasekontrastbilde av HTO-farget kjerner. Nuclei er indikert med piler. Skalastang = 100 μm. (B) Bioanalyzer resultater av 1m tråd cDNA (topp), GEX bibliotek (midten) og HTO bibliotek (bunn). Forkortelser: GEX = genuttrykk; HTO = hashtag oligo. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kvalitetskontroll av hashtag-oligo-merkingseffektiviteten og kvalitetskontroll av snRNA-seq. (A) Varmekart over HTO-farging oppnådd med en inkubasjonstid på 10 minutter med hashtag-antistoffer. (BD) Fiolinplott av kvalitetskontrollmålinger som viser antall gener (nFeature_RNA, B); antall UMIer (nCount_RNA, C); prosentandelen mitokondrietall (percent.mt, D). (E) Av de totalt 32 285 genene som ble sekvensert, ble 875 (2,71 %) identifisert som svært variable trekk som visualisert i scatter-plottet. (F) Albueplott av PCer for å bestemme inkludering av ekte signal som brukes til klynger. Forkortelser: snRNA-seq = single-nucleus RNA sekvensering; HTO = hashtag oligo; PCer = hovedkomponenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative resultater av analysen av SnRNA-seq. (A) UMAP-plottet til det grupperte snRNA-seq-datasettet. (B) UMAP-plott som visualiserer fordelingen av de samlede HTO-prøvene. (C) Fiolinplott som validerer kvinnelige prøver (høyt Xist-uttrykk) etter demultiplexing. (D-I) UMAP-plott som viser utvalgte markørgener; klyngene uttrykker sterkt de tilsvarende genene som er angitt i de røde sirklene: D-F, sympatiske nevroner (Th, Dbh, Snap25); (G) Satellitt glialceller (S100b); (H) Endotelceller (Pecam1); (I) Stromale celler (Acta2). Forkortelser: snRNA-seq = single-nucleus RNA sekvensering; HTO = hashtag oligo; UMAP = ensartet manifold-tilnærming og projeksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur S1: Kvalitetskontrollmålinger for et representativt sekvenseringsresultat med én kjerne. HTO-uttrykksprofiler for individuelle prøver som visualiserer demultiplexing evnen til de brukte hashtag-antistoffene. Forkortelse: HTO = hashtag oligo. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S2: HTO-uttrykksvarmekart over påfølgende prøver inkubert med HTO-antistoffer i 30 min. Sammenligning av antall negativt merkede kjerner etter HTO-demultiplexing med figur 4A viser en markert forbedring av kjernemerking etter forlengelse av antistoffinkubasjonstiden. Forkortelse: HTO = hashtag oligo. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S3: Median og kvantiler av genuttrykk per klynge. (A) Median nonzero rå genuttrykk for hver klynge. (B) Beskrivende statistikk over ikke-null rå genuttrykk for hver klynge. Q1: 25. persentil , Q3: 75. persentil . Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrives en detaljert protokoll som fokuserer på i) disseksjonen av voksen mus overlegen cervical og stellate sympatisk ganglia, ii) isolasjon og kryopreservering av gangitoniske celler, iii) kjerneisolasjon, og iv) kjerne-barkoding med HTO-merking for multipleksingsformål og snRNA-seq.
Med denne protokollen kan sympatiske gangioniske celler lett oppnås ved å dissosiere individuelle ganglia ved hjelp av vanlig brukt trypsin og kollagenaliser. Langsiktig bevaring av isolerte gangioniske celler oppnås også lett ved å fryse celler i FBS supplert med 10% DMSO, som viste høy kvalitet på utvinning etter opptining. Videre, sammenlignet med konvensjonell encellet RNA-sekvensering, har bruk av dråpebasert snRNA-seq av enkelt murine sympatisk ganglia kombinert med anvendelsen av HTO-fargingsbasert kjernebarkoding følgende fordeler: i) prøver kan bevares i lang tid til alle prøver er klare for ytterligere kjerneisolasjon; ii) kjerner av god kvalitet isolert fra flere små størrelser ganglia kan samles sammen for sekvensering uten en batch effekt forårsaket av separert prøve forberedelse; iii) evnen til å spore tilbake den distinkte gangioniske opprinnelsen etter sekvensering ved hjelp av nukleus strekkoder; og iv) kostnadseffektivitet, siden bare enkeltbiblioteksforberedelse er nødvendig. Det er viktig at den beskrevne isolasjons- og cellekulturprotokollen gir en enkelt ensartet metode for både murine cervical og stellate ganglia og er potensielt anvendelig for andre ganglia, for eksempel dorsal rot ganglia og andre arter, for eksempel menneskelig ganglia.
En av de viktigste fordelene med scRNA-seq er evnen til å identifisere (nye) celletyper og å avsløre sjeldne cellepopulasjoner som ikke kunne oppdages av bulk RNA-seq. Den dråpebaserte scRNA-seq-plattformen letter fangst av flere celler. Det kan dermed gi en samlet visning av celletypene (sub)typer og transkripsjonell heterogenitet av en stor cellepopulasjon sammenlignet med en platebasert sekvenseringsplattform. Den dråpebaserte (f.eks. 10x Chromium)-plattformen er imidlertid ikke egnet for celler større enn 50 μm, noe som begrenser bruken i store celler som menneskelige nevroner (~ 100 μm). Tilgjengeligheten av snRNA-seq-teknikken overvinner denne ulempen på grunn av den lille størrelsen på en kjerne. Videre er snRNA-seq en nyttig metode for genuttrykksstudier av svært sammenkoblede og lavavkastningsceller som nevroner og frosne vev.
Selv om det er mulig å isolere kjerner direkte fra vev uten tidligere celledissosiasjon, var det gunstig for utbyttet å ta en to-trinns kjerneisolasjonsmetode som først dissosierer ganglionen i enkeltceller (som kan bevares i flytende nitrogen) etterfulgt av kjernenisolasjon. På grunn av den lille størrelsen på en mus sympatisk ganglion, ble det funnet at flere kjerner ble oppnådd ved hjelp av en to-trinns kjerneisolasjonsmetode enn med en ett-trinns kjerneisolasjonstilnærming. Kvalitetskontrollen av cDNA-, bibliotek- og sekvenseringsanalysene indikerer god kjerne-/RNA-kvalitet. I tillegg forbedres logistikken, siden prøver kan samles inn og lagres på forskjellige tidspunkter før kollektiv sekvensering. Enkjerneanalyse avslørte også vellykket gjenoppretting og fangst av nevroner og glialceller, noe som tyder på at den beskrevne to-trinns kjernenisolasjonsmetoden kan være bedre egnet for applikasjonen i små vev.
En annen fordel med denne protokollen er multipleksing med strekkodede antistoffer21. Musen sympatisk ganglion er et lite vev (gjennomsnittlig størrelse 0,1 mm3), og det lave antall celler avledet fra en individuell ganglion er utilstrekkelig for dråpebasert sekvensering av seg selv. Men å samle flere ganglia av forskjellige mus eller forskjellige ganglia av samme mus vil føre til tap av enten individuell museinformasjon eller individuell ganglion informasjon. Som en løsning er HTO-fargingstrinnet enkelt å utføre og muliggjør strekkodet merking av kjerner avledet fra forskjellige mus eller forskjellige ganglia før kjernepooling. Nøyaktigheten av HTO demultiplexing er verifisert i denne protokollen av matchet Xist uttrykk i kjente kvinnelige kjerner populasjoner. Nucleus multipleksing med strekkodede antistoffer reduserer derfor batcheffekter og senker sekvenseringskostnadene.
En potensiell begrensning av snRNAseq kan være at det kan være forskjeller mellom RNA-sammensetningen i kjernen og cytoplasma på grunn av den naturlige tilstedeværelsen av ekkel transkripsjoner i kjernen, forbundet med tidlig respons på nevronale aktiviteter22,23. Kjernen og cytoplasma kan også variere i transkripsjoner avhengig avcellesyklustilstanden 24. Færre transkripsjoner ble påvist i en individuell kjerne (~7000 gener) enn i en celle (~11 000 gener)14. Derfor kan scRNA-seq og snRNA-seq gi forskjellige resultater på transkripsjonsnivå. Likevel viste sammenligningen mellom scRNA-seq og snRNA-seq en lignende evne til å diskriminere nevroncelletyper av hjernevev14. For å forbedre diskrimineringen mellom svært like celletyper eller undertyper av snRNA-seq, kan det være nødvendig med flere kjerner for å kompensere for den lavere gendeteksjonsevnen sammenlignet med scRNA-seq. Videre, selv om nøyaktigheten av HTO-demultiplexing er tilstrekkelig, er tapet av noen data uunngåelig, da ikke alle kjerner viser HTO-spesifisitet. Ytterligere optimalisering av antistoffinkubasjonen kan minimere antall kjerner med dobbelt eller negativt uttrykk for HTOer.
Samlet sett gir denne protokollen den eksperimentelle prosedyren for sekvensering av nevronale kjerner fra sympatisk ganglia ved hjelp av en lettfattelig arbeidsflyt som starter fra ganglionisolasjon til kjerneforberedelse av lav inngang av celler, etterfulgt av HTO-fargingsbasert kjernemerking for snRNA-seq. Protokollen gir en detaljert oversikt over alle viktige trinn som enkelt kan utføres og brukes på ulike ganglia i murin og andre arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Susan L. Kloet (Department of Human Genetics, LUMC, Leiden, Nederland) for hennes hjelp i eksperimentell design og nyttige diskusjoner. Vi takker Emile J. de Meijer (Department of Human Genetics, LUMC, Leiden, Nederland) for hjelpen med single-nucleus RNA isolasjon og bibliotek forberedelse til sekvensering. Dette arbeidet støttes av Den nederlandske organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO) [016.196.346 til M.R.M.J.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and reagents | |||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 0.4% trypan blue dye | Bio-Rad | 1450021 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004176 | use 1,400 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 67685 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| Fetal bovine serum (low endotoxin) | Biowest | S1810-500 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Cell wash buffer |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Cell wash buffer |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Nucleus Lysis buffer |
| Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent) | Sigma-Aldrich | 74385 | Nucleus Lysis buffer |
| Nuclease free water (not DEPC-treated) | Invitrogen | AM9937 | Nucleus Lysis buffer |
| Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus Lysis buffer |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | Nucleus Lysis buffer |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | Nucleus Lysis buffer |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Nucleus wash |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Nucleus wash |
| Protector RNase Inhibitor,40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus wash |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Calcium chloride solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Nuclease free water (not DEPC treated) | Invitrogen | AM9937 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Sodium Chloride Solution, 5M | Sigma-Aldrich | 59222C | ST staining buffer (ST-SB) |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST staining buffer (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody | Biolegend | 682205 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody | Biolegend | 682207 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody | Biolegend | 682209 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody | Biolegend | 682225 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody | Biolegend | 682227 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody | Biolegend | 682229 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody | Biolegend | 682231 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody | Biolegend | 682233 | Hashtag antibody |
| TruStain FcX (human) | Biolegend | 422302 | FC receptor blocking solution |
| Equipment and consumables | |||
| Bright-Line Hemacytometer | Merck | Z359629-1EA | |
| Centrifuge 5702/R A-4-38 | Eppendorf | EP022629905 | |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | EP0030108035-250EA | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish | Corning | 351008 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 10773501 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine science tools | 11252-40 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine science tools | 14091-09 | |
| Ice Pan, rectangular 4 L Orange | Corning | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Leica | Microscope | |
| Moria MC50 Scissors | Fine science tools | 15370-50 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine science tools | 15012-12 | |
| Olympus CK2 ULWCD | Olympus | Microscope | |
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| Preseparation Filters (30 µm) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| Shaking water bath | GFL | 1083 | |
| Silicon plate | RubberBV | 3530 | Dissection board |
| Software and packages | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| R programming | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #007576 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Code for the data analysis | |||
| https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE |
References
- McCorry, L. K.
- Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Cardiology Research and Practice. 2015, 698368 (2015).
- Ajijola, O. A., et al. Extracardiac neural remodeling in humans with cardiomyopathy. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 5 (5), 1010 (2012).
- Nguyen, B. L., et al. Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 143-148 (2012).
- Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
- Han, S., et al. Electroanatomic remodeling of the left stellate ganglion after myocardial infarction. Journals of the American College of Cardiology. 59 (10), 954-961 (2012).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Svensson, V., Vento-Tormo, R., Teichmann, S. A. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nature Protocols. 13 (4), 599-604 (2018).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
- Kokubun, S., et al. Distribution of TRPV1 and TRPV2 in the human stellate ganglion and spinal cord. Neuroscience Letters. 590, 6-11 (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communication. 10 (1), 2832 (2019).
- Petrany, M. J., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers. Nature Communication. 11 (1), 6374 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648 (2018).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
- Zandstra, T. E., et al. Asymmetry and heterogeneity: part and parcel in cardiac autonomic innervation and function. Frontiers in Physiology. 12, 665298 (2021).
- Lewis, A. E., Vasudevan, H. N., O'Neill, A. K., Soriano, P., Bush, J. O. The widely used Wnt1-Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling. Developmental Biology. 379 (2), 229-234 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. bioRxiv. , (2018).
- Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 11022 (2016).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
- Grindberg, R. V., et al.
