Summary
Este protocolo descreve a preparação detalhada e de baixa entrada da amostra para sequenciamento de núcleo único, incluindo a dissecção de gânglios cervicais e estelares superiores do rato, dissociação celular, criopreservação, isolamento do núcleo e bar codificação de hashtag.
Abstract
O sistema nervoso autônomo cardíaco é crucial no controle da função cardíaca, como frequência cardíaca e contralidade cardíaca, e é dividido em ramos simpáticos e parassimpáticos. Normalmente, há um equilíbrio entre esses dois ramos para manter a homeostase. No entanto, estados de doenças cardíacas como infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca e hipertensão podem induzir a remodelação de células envolvidas na inervação cardíaca, o que está associado a um desfecho clínico adverso.
Embora existam grandes quantidades de dados para a estrutura histológica e função do sistema nervoso autônomo cardíaco, sua arquitetura biológica molecular em saúde e doença ainda é enigmática em muitos aspectos. Novas tecnologias como o sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) são promissoras para a caracterização genética de tecidos na resolução unicelular. No entanto, o tamanho relativamente grande dos neurônios pode impedir o uso padronizado dessas técnicas. Aqui, este protocolo explora o sequenciamento de RNA de núcleo único baseado em gotículas (snRNA-seq), um método para caracterizar a arquitetura biológica dos neurônios simpáticos cardíacos na saúde e na doença. Uma abordagem stepwise é demonstrada para realizar snRNA-seq do cervical superior bilateral (SCG) e gânglios estelares (StG) dissecados de camundongos adultos.
Este método permite a preservação da amostra a longo prazo, mantendo uma qualidade adequada de RNA quando amostras de múltiplos indivíduos/experimentos não podem ser coletadas de uma só vez em um curto período de tempo. A barificação dos núcleos com hashtag oligos (HTOs) permite a desmultiplexação e o rastreamento de amostras gangliônicas distintas pós sequenciamento. Análises subsequentes revelaram a captura bem-sucedida de núcleos de células neuronais, gliais por satélite e endoteliais das gânglios simpáticos, validadas pelo snRNA-seq. Em resumo, este protocolo fornece uma abordagem passo a passo para o snRNA-seq de gânglios cardíacos extrínsecos simpáticos extrínsecos, um método que tem potencial para uma aplicação mais ampla em estudos da inervação de outros órgãos e tecidos.
Introduction
O sistema nervoso autônomo (ANS) é uma parte crucial do sistema nervoso periférico que mantém a homeostase corporal, incluindo a adaptação às condições ambientais e patologia1. Está envolvida na regulação de múltiplos sistemas de órgãos em todo o corpo, como os sistemas cardiovascular, respiratório, digestivo e endócrino. A ANS é dividida em ramos simpáticos e parassimpáticos. Ramos espinhais da simpática sinapse do sistema nervoso em gânglios da cadeia simpática, situados bilateralmente em posição paravertebral. Os gânglios colossais e torácicos bilaterais, especialmente os StG, são componentes importantes que participam da inervação cardíaca. Em estados de doenças, como isquemia cardíaca, a remodelagem neuronal pode ocorrer, resultando em um overdrivesimpático 2. A remodelagem neuronal foi demonstrada em múltiplos estudos histológicos em humanos e várias outras espécies animais 3,4,5,6. Atualmente, falta uma caracterização biológica detalhada da remodelação neuronal induzida pela isquemia cardíaca na gânglios simpáticos cardíacos, e as características biológicas fundamentais dos tipos ou subtipos especializados das células neuronais dentro do sistema nervoso simpático cardíaco (SNS) ainda não estão totalmente determinadas na saúde e na doença7.
Novas tecnologias, como a scRNA-seq, abriram portas para a caracterização genética de pequenos tecidos em um nível unicelular 8,9. No entanto, o tamanho relativamente grande dos neurônios pode impedir o uso otimizado dessas técnicas unicelulares em humanos10. Além disso, o sequenciamento unicelular requer um alto rendimento de células para recuperar um número celular suficiente devido a uma alta perda no processo de sequenciamento. Isso pode ser desafiador ao estudar pequenos tecidos difíceis de capturar em uma sessão e exigir várias amostras para introduzir células únicas suficientes para sequenciamento. A recém-desenvolvida tecnologia snRNA-seq baseada em gotículas (ou seja, a plataforma 10x Chromium) permite o estudo de diferenças biológicas entre núcleos únicos11,12. o snRNA-seq tem uma vantagem sobre o scRNA-seq para células grandes (>30 μm), que não pode ser capturado em Gel Bead em Emulsões (GEMs), bem como melhor compatibilidade com dissociação extensiva e/ou preservação prolongada 13,14,15.
A heterogeneidade, o número de células neuronais e outras células enriquecidas no SNS cardíaco são aspectos importantes para a caracterização da ANS em estados de saúde e doenças. Além disso, a inervação específica de órgãos ou região por cada gânglio simpático contribui para a complexidade do SNS. Além disso, gânglios cervicais, estelares e torácicos da cadeia simpática têm sido mostrados para inervar diferentes regiões do coração16. Portanto, é necessário realizar a análise de núcleo único de células gangliônicas derivadas de gânglios individuais para estudar sua arquitetura biológica.
O snRNA-seq baseado em gotícula permite o perfil de expressão em toda a transcrição para um conjunto de milhares de células de várias amostras ao mesmo tempo com custos mais baixos do que plataformas de sequenciamento baseadas em placas. Essa abordagem permite que o snRNA-seq baseado em gotículas seja mais adequado para a classificação do fenótipo celular e a nova identificação de subpopulação de células dentro do SCG e do StG. Notavelmente, este protocolo fornece uma abordagem concisa para a identificação, isolamento e sequenciamento de RNA de núcleo único de gânglios cardíacos extrínsecos simpáticos, um método que tem potencial para uma ampla aplicação em estudos da caracterização de gânglios inervando outros órgãos e tecidos relacionados em saúde e doença.
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Protocol
Este protocolo descreve todas as etapas necessárias para o snRNA-seq de murine cervical e/ou colocothoracic (estelar) gânglio. Foram utilizados camundongos C57BL/6J femininos e masculinos (15 semanas de idade, n = 2 para cada sexo). Um mouse Wnt1-Cre;mT/mG adicional foi usado para visualizar o gânglio para fins de dissecção17,18. Este mouse adicional foi gerado pela cruzamento de um mouse B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J e um mouse B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J. Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo NIH e aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Leiden (Número de Licença AVD1160020185325, Leiden, Holanda). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, equipamentos, softwares e animais utilizados no protocolo.
1. Preparativos
NOTA: Todas as etapas são executadas em um gabinete de fluxo de cultura celular.
- Limpe as fórceps e a tesoura imergindo os instrumentos em 70% de etanol por 20 minutos.
- Prepare o meio de gânglio composto por Neurobásal Medium complementado com B-27 plus (1x), L-glutamina (2 mM) e 1% Antibiótico-Antimycotic. Pré-aquecimento o meio gânglio à temperatura ambiente.
- Prepare a solução de digestão: 0,25% Trypsin-EDTA (1:1) e 1.400 U/mL colagenase tipo 2 dissolvido no meio de gânglio.
- Prepare tampão de lavagem celular fresco e frio (4 °C) (0,4% de colina bovina de soro [BSA]) e tampão de lise (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 e 0,1% detergente noniônico, 40 U/mL RNAse em água sem nuclease) para o isolamento do núcleo.
- Prepare o tampão de lavagem do núcleo (1x salina tamponada com fosfato [PBS] com 2,0% BSA e 0,2U/μL RNase Inibidor).
- Prepare o tampão de coloração ST (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 2% BSA, 0,02% Tween-20 em água sem nuclease).
2. Dissecção de gânglios cervicais superiores de camundongos adultos (SCG)
- Eutanize os ratos e mantenha-os no gelo.
NOTA: No presente estudo, um total de 4 camundongos C57BL6/J foram eutanizados por asfixia de CO2 . Alternativamente, o isoflurano pode ser usado seguido de exsanguinação quando uma grande quantidade de sangue precisa ser coletada para outros fins de estudo. - Fixar o mouse em uma placa de dissecção com pinos e dous-lo com 70% de etanol para minimizar a dispersão de peles (a barba não é necessária).
- Sob um estereótipo, abra a pele da região do pescoço fazendo um corte médio com uma tesoura, mova as glândulas submandibulares de lado, e remova o músculo esternostoide para expor e localizar a artéria carótida comum e sua bifurcação (Figura 1A, B, ver seta).
- Disseca a bifurcação da artéria carótida direita e esquerda e o tecido ligado a ela. Transfira cada pedaço de tecido dissecado para uma placa de Petri separada de 3,5 cm contendo PBS frio.
- Procure o SCG ligado à bifurcação carótida. Limpe ainda mais o SCG removendo a artéria e outros tecidos presos na placa de Petri (Figura 1E).
3. Dissecção de gânglios estelares de camundongos adultos (StG)
- Para dissecar o StG, faça um corte médio no abdômen, seguido de abertura do diafragma e da parede torácica ventral.
- Remova o coração e os pulmões para expor o tórax dorsal. Procure o StG esquerdo e direito anterolateral para o musculus colli longus (MCL) ao nível da primeira costela (Figura 1C, D, indicada por linhas tracejadas).
- Disseca tanto a esquerda quanto a direita stG com fórceps e transfira-os separadamente para placas de Petri de 3,5 cm contendo PBS frio (Figura 1F).
4. Isolamento e criopreservação de células gangliônicas de camundongos
As etapas 4-6 são resumidas na Figura 2.
- Transfira cuidadosamente todos os scg e stg individuais para separar tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL com fórceps.
NOTA: Não use dicas de pipeta para transferir o gânglio porque os gânglios são propensos a aderir à parede de pontas de pipeta de plástico. - Adicione 500 μL de solução trypsin-EDTA de 0,25% a cada tubo de microcentrifus de microcentrída e incubar em um banho de água tremendo a 37 °C por 40 min.
NOTA: Esta etapa visa facilitar a digestão e liberação celular daqui para frente na solução de colagem tipo 2. - Prepare um tubo de 15 mL contendo 5 mL de meio de gânglio para cada amostra. Permita que os gânglios se acomodem no fundo dos tubos de microcentrifuuagem. Recolher o supernante, que contém muito poucas células gangliônicas, transferir o supernante para os tubos preparados de 15 mL, e rotular cada tubo. Alternativamente, para economizar algum tempo, aspire o supernatante trypsin-EDTA sem coleta, pois pouquíssimas células dissociadas podem ser detectadas nele.
NOTA: Uma pequena quantidade de solução trypsin-EDTA (~10-30 μL) pode ser deixada no tubo de microcentrífuga para evitar a remoção do gânglio. Evite a pipetação nesta etapa, pois pode danificar o gânglio e levar à baixa saída de células gânnicas depois. - Adicione 500 μL de solução tipo 2 de colagenase em cada tubo de microcentrifuuagem e incubar em um banho de água tremendo a 37 °C por 35-40 min. Tente resuspensar o gânglio depois de 35 min; se o gânglio ainda estiver intacto e não dissociar, prolongue o tempo de incubação ou aumente a concentração da solução tipo 2 de colagenase conforme necessário.
NOTA: O tempo de incubação pode variar dependendo do tamanho do gânglio. - Resuspende a gânglio em solução de colagem, pipetando para cima e para baixo ~10 vezes ou até que os aglomerados de tecido não sejam mais detectados.
- Transfira a suspensão celular para o tubo de 15 mL usado anteriormente que contém o meio de cultura gânglio e a suspensão trypsin-EDTA do mesmo gânglio. Gire a suspensão da célula com uma centrífuga de rotor de balde balançando por 10 minutos, 300 × g à temperatura ambiente. Descarte cuidadosamente o supernatante celular.
NOTA: Como as células gangliônicas são dissociadas de um único gânglio, a pelota celular pode ser muito pequena para detectar pelo olho; uma pequena quantidade de supernasce pode ser deixada no tubo para evitar a remoção acidental da pelota celular. - Resuspend as células gangliônicas em 270 μL de soro bovino fetal (FBS, baixa endotoxina) e transfira cada suspensão célula-FBS em um criovial de 1 mL.
- Para contar as células, misture 5 μL da suspensão celular gangliônica com 5 μL de 0,4% de corante azul trypan e carregue a mistura em um hemócito. Conte os números totais e de células vivas sob um microscópio.
NOTA: A viabilidade celular (contagem de células vivas/contagem total de células = viabilidade %) é geralmente superior a 90% com este protocolo de dissociação. A contagem de células vivas de um único gânglio (SCG ou StG) geralmente cai dentro da faixa de 9.000-60.000 células quando o gânglio é isolado de um rato de 12 a 16 semanas. - Adicione 30 μL de sulfóxido de dimetila (DMSO) a cada suspensão célula-FBS nos criovias, misture bem e transfira os criovials para um recipiente de congelamento celular, que é mantido à temperatura ambiente. Armazene o recipiente carregado criovial a -80 °C durante a noite e transfira os criovials para nitrogênio líquido no dia seguinte para preservação de longa data antes do sequenciamento.
5. Isolamento do núcleo
NOTA: O SCG esquerdo e direito isolado de quatro camundongos (no total de 8 amostras) foram utilizados como exemplo na seguinte preparação de isolamento e sequenciamento do núcleo. Mantenha tudo no gelo durante todo o procedimento. Devido à invisibilidade de pequenas pelotas de núcleo, uma centrífuga com baldes balançando é altamente recomendada para facilitar a remoção de supernascimento durante todo o procedimento.
- Prepare tubos de 15 mL com um coador (30 μm) em cima e prerinse o coador com 1 mL do meio de gânglio.
- Retire os criovials do nitrogênio líquido e descongele-os imediatamente em um banho de água a 37 °C. Quando uma pequena pelota de gelo é deixada no criovial, tire os criovials do banho de água.
- Recupere as células gangliônicas soltando 1 mL do meio gânglio em cada criovial enquanto treme cuidadosamente à mão. Opcional: Para avaliar a recuperação celular, misture a suspensão celular após a recuperação e tire 5 μL de suspensão celular para contagem de células vivas, conforme descrito na etapa 4.8.
- Carregue cada suspensão celular gangliônica em um coador separado (preparado na etapa 5.1) e enxágue cada coador com 4-5 mL de meio de gânglio.
- Centrifugar a suspensão celular tensa por 5 min a 300 × g, remover o sobrenante cuidadosamente e resuspensar as células em 50 μL de tampão de lavagem celular.
- Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrifuge de DNA/RNA de baixa ligação de 0,5 mL.
- Centrifugar a suspensão da célula a 500 × g por 5 min a 4 °C.
- Remova 45 μL do supernasce sem tocar na parte inferior do tubo para evitar desalojar a pelota celular.
- Adicione 45 μL de tampão de lysis refrigerado e pipeta suavemente para cima e para baixo usando uma ponta de pipeta de 200 μL.
- Incubar as células por 8 minutos no gelo.
- Adicione 50 μL de tampão de lavagem de núcleo frio a cada tubo. Não misture.
- Centrifugar a suspensão do núcleo a 600 × g por 5 min a 4 °C.
- Remova 95 μL do supernante sem interromper a pelota do núcleo.
- Adicione 45 μL de tampão de lavagem de núcleo refrigerado à pelota. Opcional: Tome 5 μL de suspensão do núcleo, misture com 5 μL de 0,4% de tripano azul para contar e verifique a qualidade dos núcleos sob um microscópio com um hemócito.
- Centrifugar a suspensão do núcleo a 600 × g por 5 min a 4 °C.
- Remova o supernatante sem tocar na parte inferior do tubo para evitar desalojar a pelota do núcleo.
6. Codificação de núcleo com hashtag oligos (HTOs) e multiplexing
NOTA: As etapas de coloração do HTO foram modificadas e otimizadas para rotulagem nuclear de quantidades muito baixas de núcleos (gangliônicos) de acordo com a aplicação anterior em tecido cortical por Gaublomme et al.15.
- Adicione 50 μL de tampão ST-SB à pelota do núcleo, pipeta suavemente 8-10 vezes até que os núcleos estejam completamente ressuspendidos.
- Adicione 5 μL de reagente de bloqueio de fc por 50 μL da mistura ST-SB/nuclei e incubar por 10 minutos no gelo.
- Adicione 1 μL (0,5 μg) de anticorpo hashtag de núcleo único por tubo da mistura ST-SB/nuclei e incubar por 30 minutos no gelo.
NOTA: O menor tempo de incubação leva a uma menor eficiência da rotulagem de hashtags, como demonstrado nos resultados representativos. - Adicione 100 μL de ST-SB a cada tubo. Não misture.
- Centrifugar a suspensão do núcleo por 5 min, 600 × g a 4 °C.
- Remova 145 μL do supernante sem interromper a pelota do núcleo.
- Repita as etapas 6.4 e 6.5. Remova o supernatante o máximo possível sem tocar na parte inferior do tubo para evitar desalojar a pelota do núcleo.
- Resuspenque a pelota do núcleo em 50 μL de ST-SB, e misture suavemente os núcleos.
- Pegue 5 μL da suspensão do núcleo e misture-a com 5 μL de 0,4% de azul trypan para contar os núcleos sob um microscópio. Consulte a Figura 3A para obter uma imagem representativa de núcleos misturados com azul trypan e carregados em um hemótmetro.
- Centrifugar a suspensão do núcleo por 5 min a 600 × g a 4 °C.
- Resuspengem os núcleos em ST-SB para alcançar uma concentração de núcleo-alvo de 1.000-3.000 núcleos/μL para cada amostra de acordo com a contagem de núcleos correspondente.
- Acumule as amostras para alcançar o número desejado de células.
NOTA: Por exemplo, neste experimento, 8 amostras foram igualmente agrupadas para alcançar um total de 25.000 núcleos para prosseguir imediatamente para 10x Genômica Chromium e snRNA-seq depois. A contagem de núcleos geralmente fica dentro da faixa de 6.000-40.000 células quando o gânglio é isolado de um rato de 12 a 16 semanas. Apenas cerca de metade dos núcleos carregados totais podem ser capturados por snRNA-seq baseado em gotículas. Por exemplo, uma mistura de 25.000 núcleos foi preparada para garantir a captura de 10.000 núcleos, o que é necessário para uma preparação e sequenciamento da biblioteca.
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Representative Results
Análise de controle de qualidade da preparação da biblioteca cDNA de núcleo único e snRNA-seq
Os resultados representativos descrevem os resultados de sequenciamento de 10.000 núcleos capturados em um único pool com uma biblioteca de expressão genética de 25.000 leituras/núcleo e uma biblioteca de hashtags de 5.000 leituras/núcleos. A Figura 3B ilustra os resultados de controle de qualidade do CDNA de1º fio, biblioteca de expressão genética (GEX) e biblioteca HTO, que foram verificados com o Bioanalyzer. Espera-se que os CDNAs derivados do HTO sejam menores que 180 bp, enquanto os CDNAs derivados do mRNA são maiores que 300 bp. Uma biblioteca GEX de alta qualidade pode ser detectada como um pico amplo de 300 a 1.000 bp, e a biblioteca HTO é detectada como um pico específico de 194 bp. Cell Ranger foi usado para desmultiplexação, geração de arquivos fastq e alinhamento de leitura por configuração padrão. O pacoteSeurat R 19 foi posteriormente utilizado para controle de qualidade e análises a jusante.
A demultiplexação dos dados snRNA-seq foi realizada identificando HTOs usando a estratégia de demultiplexing incorporada do Seurat. A capacidade desmultiplexante para cada HTO foi visualizada pela primeira vez com arquivos de expressão HTO (Figura Suplementar S1). No mapa de calor da Figura 4A, os singlets são detectados como núcleos com expressão específica de HTO, enquanto doublets e negativos mostram expressão inespecífica de múltiplos ou nenhum HTOs. Note-se que aproximadamente 33% dos núcleos foram detectados como negativos usando uma abordagem de incubação de anticorpos HTO de 10 min. A prorrogação do tempo de incubação (etapa 6.3) de 10 min para 30 min em um experimento subsequente revelou uma notável diminuição nos núcleos rotulados negativamente (Figura Suplementar S2). Esses achados indicam que prolongar o tempo de incubação de anticorpos pode melhorar a eficiência da hashtag.
As tramas de violino na Figura 4B-D demonstram o número de genes (nFeature_RNA), o número de identificadores moleculares únicos (UMI) (nCount_RNA) e a porcentagem de contagens mitocondriais (percent.mt) dentro do conjunto de dados snRNA-seq para identificar outliers e núcleos de baixa qualidade. Os núcleos só foram incluídos na análise a jusante quando foram atendidos os seguintes critérios: i) nFeature_RNA > 500 e nCount_RNA < 20.000; ii) percent.mt < 5%; iii) o núcleo individual mostrou expressão clara de um único IHT. A contagem de expressões genéticas foi normalizada utilizando-se o método padrão em Seurat: 875 (2,71%) genes foram detectados como genes altamente variáveis (Figura 4E). snRNA-seq GEX foi dimensionado, foi realizado e o enredo do cotovelo foi utilizado para avaliar a inclusão de componentes principais que seriam utilizados para análises a jusante (Figura 4F). No total, foram incluídos 18 PCs. O agrupamento foi realizado com resolução de 0,4.
Os núcleos foram agrupados e a redução de dimensão (UMAP) foi realizada para visualização dos 12 clusters individuais (Figura 5A). A contagem média de genes brutos por cluster varia entre 991,5 e 4.586 (Figura Suplementar S3A, B). Visualizar a divisão dos anticorpos HTO dentro da UMAP revela uma distribuição clara de gânglios, indicando que todos os clusters são apresentados em cada gânglio (Figura 5B). Para validar a precisão da segregação amostral de HTO, foi avaliada a expressão de X Inactive Specific Transcript (Xist, expressa no cromossomo X feminino inativo) para identificar as amostras masculinas e as amostras femininas (Figura 5C). A expressão xist estava de acordo com a rotulagem da hashtag, mostrando que as amostras rotuladas por HTO 1-4 eram amostras femininas, e as amostras rotuladas por HTO 5-8 eram amostras masculinas. Isso sugere que a rotulagem HTO curada é altamente específica.
Para verificar melhor a qualidade e resolução dos dados de sequenciamento com o presente método, algumas transcrições-chave de neurônios simpáticos foram primeiramente examinadas. Os resultados mostram a presença de neurônios simpáticos que expressam altamente Th, Dbh e Snap25 nos clusters 5 e 7 (Figura 5D-F). Células gliais satélites foram detectadas com a expressão de S100b em aglomerados 0-3 (Figura 5G)20. Células endoteliais foram detectadas no aglomerado 4 com alta expressão de Pecam1 (Figura 5H) e células estromais no aglomerado 8 com alta expressão de Acta2 (Figura 5I). Esses resultados suportam a captura bem-sucedida de núcleos de células neuronais, gliais por satélite, endoteliais e estromal do gânglio simpático usando snRNA-seq.
Figura 1: Dissecção de gânglios cervicais superiores do rato adulto e gânglios estelares. (A) Imagem brightfield da localização do SCG. (B) Para facilitar a visualização, utilizou-se um mouse Wnt1Cre;mT/mG. Asteriscos indicam o SCG (eGFP+), as pontas de flecha indicam a bifurcação da artéria carótida. Painel esquerdo, imagem de contraste de fase; painel direito, imagem fluorescente. (C) Imagem brightfield da localização dos Asteriscos StG. (D) indicam as linhas stG (eGFP+), tracejadas indicam o MCL. Painel esquerdo, imagem de contraste de fase; painel direito, imagem fluorescente. (E) Gânglios dissecados são transferidos para uma placa de Petri separadamente para limpeza posterior sob um estereómico. (F) Painel esquerdo, o SCG dissecado com a artéria carótida ainda anexada. O contorno tracejado indica o SCG. Painel direito, o StG dissecado e limpo tem a forma de um triângulo invertido, como indicado pelo contorno tracejado. Barra de escala = 1.000 μm. Abreviaturas: SCG = gânglio cervical superior; StG = gânglio estelar; MCL = musculus colli longus; eGFP = proteína fluorescente verde aprimorada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxo de trabalho da preparação da amostra e multiplexing baseado em manchas de hashtag para snRNA-seq. O fluxograma retrata os passos da dissociação de células gangliônicas (laranja), isolamento do núcleo (azul) e hashtag de manchas de anticorpos e multiplexing (verde) que são realizados para snRNA-seq. Abreviaturas: FBS = soro bovino fetal; ST-SB = Tampão de coloração ST; snRNA-seq = sequenciamento de RNA de núcleo único. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Controle de qualidade do isolamento do núcleo e preparação da biblioteca de expressão genética. (A) Imagem de contraste de fase dos núcleos manchados de HTO. Núcleos são indicados com flechas. Barra de escala = 100 μm. (B) Resultados bioanalyzer de 1st strand cDNA (superior), biblioteca GEX (meio) e biblioteca HTO (inferior). Abreviaturas: GEX = expressão genética; HTO = hashtag oligo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Controle de qualidade da hashtag oligo rotulando eficiência e controle de qualidade do snRNA-seq. (A) Mapa de calor da coloração HTO alcançado com um tempo de incubação de 10 minutos com anticorpos hashtag. (B-D) Gráficos de violino de métricas de controle de qualidade que retratam o número de genes (nFeature_RNA, B); o número de UMIs (nCount_RNA, C); a porcentagem de contagens mitocondriais (percent.mt, D). (E) Do total de 32.285 genes sequenciados, 875 (2,71%) foram identificados como características altamente variáveis como visualizados no gráfico de dispersão. (F) Gráfico de cotovelo de PCs para determinar a inclusão do verdadeiro sinal usado para agrupamento. Abreviaturas: snRNA-seq = sequência de RNA de núcleo único; HTO = hashtag oligo; PCs = componentes principais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados representativos da análise do gráfico snRNA-seq. (A) UMAP do conjunto de dados snRNA-seq agrupado. (B) Gráfico umap visualizando a distribuição das amostras de HTO agrupadas. (C) Lote de violino validando amostras femininas (alta expressão xist) após demultiplexação. (D-I) Gráficos UMAP exibindo genes marcadores selecionados; os aglomerados expressam muito os genes correspondentes que são indicados dentro dos círculos vermelhos: D-F, neurônios simpáticos (Th, Dbh, Snap25); (G) Células gliais satélites (S100b); (H) Células endoteliais (Pecam1); (I) Células estrômicas (Acta2). Abreviaturas: snRNA-seq = sequência de RNA de núcleo único; HTO = hashtag oligo; UMAP = aproximação e projeção do coletor uniforme. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar S1: Métricas de controle de qualidade de um resultado representativo de sequenciamento de núcleo único. Perfis de expressão de HTO de amostras individuais visualizando a capacidade desmultiplexante dos anticorpos hashtag usados. Abreviação: HTO = hashtag oligo. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S2: Mapa de calor de expressão HTO de amostras subsequentes incubadas com anticorpos HTO por 30 minutos. A comparação do número de núcleos rotulados negativos após o desmultiplexing do HTO com a Figura 4A mostra uma melhoria acentuada da rotulagem do núcleo após prolongar o tempo de incubação de anticorpos. Abreviação: HTO = hashtag oligo. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S3: Mediana e quantiles de expressão genética por cluster. (A) Expressão genética bruta não zero mediana de cada aglomerado. (B) Estatísticas descritivas da expressão genética não zero bruta de cada aglomerado. Q1:25º percentil, 3º trimestre: 75º percentil. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Aqui, descreve-se um protocolo detalhado que se concentra em i) a dissecção de gânglios cervicais superiores do camundongo adulto e gânglios simpáticos, ii) o isolamento e a criopreservação das células gânnicas, iii) isolamento do núcleo e iv) codificação de núcleos com rotulagem de HTO para fins multiplexais e snRNA-seq.
Com este protocolo, células gangliônicas simpáticas podem ser facilmente obtidas dissolvendo gânglios individuais usando trippsina e colagem comumente usadas. A preservação a longo prazo de células gangliônicas isoladas também é facilmente alcançada pelo congelamento de células em FBS complementadas com 10% de DMSO, que mostrou alta qualidade de recuperação após o descongelamento. Além disso, em comparação com o sequenciamento de RNA unicelular convencional, o uso de snRNA-seq à base de gotículas de gânglios simpáticos únicos combinados com a aplicação da codificação de núcleo-barcoding baseada em hto tem as seguintes vantagens: i) as amostras podem ser preservadas por um longo tempo até que todas as amostras estejam prontas para mais isolamento do núcleo; ii) núcleos de boa qualidade isolados de gânglios de pequeno porte podem ser agrupados para sequenciamento sem um efeito em lote causado pela preparação separada da amostra; iii) a capacidade de rastrear a distinta origem gangliônica após o sequenciamento usando códigos de barras de núcleo; e iv) custo-efetividade, uma vez que apenas a preparação de biblioteca única é necessária. É importante ressaltar que o protocolo de isolamento e cultura celular descrito fornece um método uniforme único para gânglios cervicais e estelares murinos e é potencialmente aplicável a outros gânglios, como gânglios de raiz dorsal e outras espécies, por exemplo, gânglios humanos.
Uma das principais vantagens do scRNA-seq é a capacidade de identificar (novos) tipos de células e revelar populações de células raras que não poderiam ser detectadas por RNA-seq em massa. A plataforma scRNA-seq baseada em gotícula facilita a captura de mais células. Assim, pode fornecer uma visão agregada dos tipos de célula (sub)e heterogeneidade transcricional de uma grande população celular em comparação com uma plataforma de sequenciamento baseada em placas. No entanto, a plataforma baseada em gotículas (por exemplo, 10x Chromium) não é adequada para células maiores que 50 μm, limitando sua aplicação em células grandes, como neurônios humanos (~100 μm). A disponibilidade da técnica snRNA-seq supera essa desvantagem por causa do pequeno tamanho de um núcleo. Além disso, o snRNA-seq é um método útil para estudos de expressão genética de células altamente interconectadas e de baixo rendimento, como neurônios e tecidos congelados.
Embora seja possível isolar diretamente os núcleos de tecidos sem dissociação celular prévia, foi benéfico para o rendimento tomar um método de isolamento do núcleo de duas etapas que primeiro dissocia o gânglio em células únicas (que podem ser preservadas em nitrogênio líquido) seguido pelo isolamento do núcleo. Devido ao pequeno tamanho de um gânglio simpático do rato, descobriu-se que mais núcleos foram obtidos usando um método de isolamento de núcleo de duas etapas do que com uma abordagem de isolamento de núcleo de um passo. A verificação de qualidade das análises de cDNA, biblioteca e sequenciamento indica boa qualidade de núcleos/RNA. Além disso, a logística é melhorada, uma vez que as amostras podem ser coletadas e armazenadas em diferentes pontos de tempo antes do sequenciamento coletivo. A análise de núcleo único também revelou a recuperação e captura bem sucedida de neurônios e células gliais, sugerindo que a abordagem de isolamento de núcleo de dois passos descrita poderia ser mais adequada para a aplicação em pequenos tecidos.
Outra vantagem deste protocolo é o multiplexing com anticorpos de código de barras21. O gânglio simpático do rato é um tecido minúsculo (tamanho médio de 0,1 mm3), e o baixo número de células derivadas de um gânglio individual é insuficiente para sequenciamento à base de gotículas por si só. No entanto, reunir vários gânglios de ratos diferentes ou gânglios diferentes do mesmo mouse causará a perda de informações individuais do mouse ou informações individuais de gânglios. Como solução, o passo de coloração do HTO é fácil de executar e permite a rotulagem em código de barras de núcleos derivados de diferentes camundongos ou diferentes gânglios antes da agrupação de núcleos. A precisão do demultiplexing do HTO é verificada neste protocolo pela expressão xista combinada em populações de núcleos femininos conhecidos. O multiplexing do núcleo com anticorpos com código de barras, portanto, reduz os efeitos em lote e reduz o custo de sequenciamento.
Uma limitação potencial do snRNAseq pode ser que possa haver diferenças entre a composição do RNA no núcleo e o citoplasma devido à presença natural de transcrições nascentes no núcleo, associadas à resposta precoce às atividades neuronais 22,23. O núcleo e o citoplasma também podem diferir em transcrições dependendo do estado do ciclo celular24. Menos transcrições foram detectadas em um núcleo individual (~7.000 genes) do que em uma célula (~11.000 genes)14. Portanto, o scRNA-seq e o snRNA-seq podem produzir resultados diferentes em um nível de transcrição. No entanto, a comparação entre scRNA-seq e snRNA-seq demonstrou uma capacidade semelhante para discriminar tipos de células neuronais do tecido cerebral14. Para melhorar a discriminação entre tipos ou subtipos de células altamente semelhantes pelo snRNA-seq, mais núcleos podem ser necessários para compensar a menor capacidade de detecção genética em comparação com o scRNA-seq. Além disso, embora a precisão do desmultiplexing do HTO seja suficiente, a perda de alguns dados é inevitável, pois nem todos os núcleos mostram a especificidade do HTO. Uma maior otimização da incubação de anticorpos poderia minimizar o número de núcleos com expressão dupla ou negativa de HTOs.
Em conjunto, este protocolo fornece o procedimento experimental para sequenciamento de núcleos neuronais de gânglios simpáticos por meio de um fluxo de trabalho fácil de seguir, a partir do isolamento gânglio para a preparação de núcleos de baixa entrada de células, seguido pela rotulagem de núcleo baseado em coloração do HTO para snRNA-seq. O protocolo fornece uma visão geral detalhada de todas as etapas-chave que podem ser facilmente executadas e aplicadas a vários gânglios em murina e outras espécies.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Susan L. Kloet (Departamento de Genética Humana, LUMC, Leiden, Holanda) por sua ajuda no design experimental e discussões úteis. Agradecemos a Emile J. de Meijer (Departamento de Genética Humana, LUMC, Leiden, Holanda) pela ajuda com o isolamento do RNA de núcleo único e a preparação da biblioteca para o sequenciamento. Este trabalho é apoiado pela Organização Holandesa de Pesquisa Científica (NWO) [016.196.346 para M.R.M.J.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and reagents | |||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 0.4% trypan blue dye | Bio-Rad | 1450021 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004176 | use 1,400 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 67685 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| Fetal bovine serum (low endotoxin) | Biowest | S1810-500 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Cell wash buffer |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Cell wash buffer |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Nucleus Lysis buffer |
| Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent) | Sigma-Aldrich | 74385 | Nucleus Lysis buffer |
| Nuclease free water (not DEPC-treated) | Invitrogen | AM9937 | Nucleus Lysis buffer |
| Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus Lysis buffer |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | Nucleus Lysis buffer |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | Nucleus Lysis buffer |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Nucleus wash |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Nucleus wash |
| Protector RNase Inhibitor,40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus wash |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Calcium chloride solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Nuclease free water (not DEPC treated) | Invitrogen | AM9937 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Sodium Chloride Solution, 5M | Sigma-Aldrich | 59222C | ST staining buffer (ST-SB) |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST staining buffer (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody | Biolegend | 682205 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody | Biolegend | 682207 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody | Biolegend | 682209 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody | Biolegend | 682225 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody | Biolegend | 682227 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody | Biolegend | 682229 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody | Biolegend | 682231 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody | Biolegend | 682233 | Hashtag antibody |
| TruStain FcX (human) | Biolegend | 422302 | FC receptor blocking solution |
| Equipment and consumables | |||
| Bright-Line Hemacytometer | Merck | Z359629-1EA | |
| Centrifuge 5702/R A-4-38 | Eppendorf | EP022629905 | |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | EP0030108035-250EA | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish | Corning | 351008 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 10773501 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine science tools | 11252-40 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine science tools | 14091-09 | |
| Ice Pan, rectangular 4 L Orange | Corning | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Leica | Microscope | |
| Moria MC50 Scissors | Fine science tools | 15370-50 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine science tools | 15012-12 | |
| Olympus CK2 ULWCD | Olympus | Microscope | |
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| Preseparation Filters (30 µm) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| Shaking water bath | GFL | 1083 | |
| Silicon plate | RubberBV | 3530 | Dissection board |
| Software and packages | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| R programming | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #007576 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Code for the data analysis | |||
| https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE |
References
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