Summary
该协议描述了用于单核测序的详细，低输入样品制备，包括小鼠上颈神经节和星状神经节的解剖，细胞解离，冷冻保存，细胞核分离和标签条形码。
Abstract
心脏自主神经系统在控制心功能（如心率和心脏收缩力）方面至关重要，分为交感神经和副交感神经分支。通常，这两个分支之间存在平衡以维持体内平衡。然而，心肌梗死、心力衰竭和高血压等心脏病状态可诱发心脏神经支配中涉及的细胞重塑，这与不良临床结果相关。
虽然心脏自主神经系统的组织学结构和功能有大量的数据，但其在健康和疾病中的分子生物学结构在许多方面仍然是神秘的。单细胞RNA测序（scRNA-seq）等新技术有望以单细胞分辨率对组织进行遗传表征。然而，相对较大的神经元尺寸可能会阻碍这些技术的标准化使用。在这里，该协议利用基于液滴的单核RNA测序（snRNA-seq），这是一种表征心脏交感神经元在健康和疾病中的生物学结构的方法。证明采用逐步方法对从成年小鼠中解剖的双侧上颈椎（SCG）和星状神经节（StG）进行snRNA-seq。
这种方法能够长期保存样品，当无法在短时间内一次收集来自多个个体/实验的样品时，保持足够的RNA质量。使用标签寡核苷酸（HTO）对细胞核进行条形码，可以在测序后对不同的神经节样本进行解复用和追溯。随后的分析显示，交感神经节的神经元、卫星神经胶质和内皮细胞成功捕获细胞核，经 snRNA-seq 验证。总之，该协议为交感神经外源性心神经节的snRNA-seq提供了一种逐步的方法，该方法有可能在其他器官和组织的神经支配研究中得到更广泛的应用。
Introduction
自主神经系统（ANS）是维持身体稳态的周围神经系统的重要组成部分，包括对环境条件和病理学的适应1。它参与调节全身的多个器官系统，如心血管，呼吸，消化和内分泌系统。ANS分为交感神经和副交感神经分支。交感神经系统突触的脊柱分支在交感神经链的神经节中，双侧位于椎旁位置。双侧颈神经节和胸神经节，尤其是 StG，是参与心脏交感神经支配的重要组成部分。在疾病状态下，例如心脏缺血，可能发生神经元重塑，导致交感神经过驱2。神经元重塑已经在人类和其他几种动物物种的多项组织学研究中得到证实3，4，5，6。目前缺乏心脏缺血诱导的心脏交感神经节中神经元重塑的详细生物学表征，并且心脏交感神经系统（SNS）内特化神经元细胞类型或亚型的基本生物学特征尚未完全确定在健康和疾病7中。
新技术，如scRNA-seq，为单细胞水平8，9上小组织的遗传表征打开了大门。然而，相对较大的神经元尺寸可能会阻碍这些单细胞技术在人类中的优化使用10。此外，由于测序过程中的高损耗，单细胞测序需要高通量细胞来恢复足够的细胞数量。当研究难以在一个会话中捕获的小组织并且需要多个样品来引入足够的单个细胞进行测序时，这可能具有挑战性。最近开发的基于液滴的snRNA-seq技术（即10x Chromium平台）允许研究单核11，12之间的生物学差异。对于大细胞（>30μm），snRNA-seq比scRNA-seq具有优势，这些细胞可能无法在乳液（GEMs）的凝胶珠中捕获，并且与广泛的解离和/或长期保存的相容性得到改善13，14，15。
异质性，神经元细胞的数量以及心脏SNS中富集的其他细胞是ANS在健康和疾病状态下表征的重要方面。此外，每个交感神经节的器官或区域特异性神经支配也会导致 SNS 的复杂性。此外，交感神经链的颈椎、星状和胸神经节已被证明可以支配心脏的不同区域16。因此，有必要对来自单个神经节的神经节细胞进行单核分析，以研究其生物学结构。
基于液滴的 snRNA-seq 允许同时对来自多个样品的数千个细胞池进行转录组范围的表达谱分析，并且成本低于基于板的测序平台。这种方法使基于液滴的snRNA-seq更适合于SCG和StG内细胞的细胞表型分类和新亚群鉴定，值得注意的是，该协议为交感神经外源性心神经节的鉴定，分离和单核RNA测序提供了一种简洁的逐步方法，该方法具有广泛应用在神经节支配的其他相关器官和组织表征研究中的潜力 健康和疾病。
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Protocol
该协议描述了小鼠宫颈和/或宫颈胸（星状）神经节的snRNA-seq所需的所有步骤。使用雌性和雄性C57BL / 6J小鼠（15周龄，每个性别n = 2）。另外一只Wnt1-Cre;mT/mG小鼠用于可视化神经节以进行解剖17，18。这只额外的小鼠是由 B6.Cg-Tg（Wnt1-cre）2Sor/J小鼠和B6.129（Cg）-Gt（ROSA）26Sortm4（ACTB-tdTomato，-EGFP）Luo/J小鼠的杂交杂交产生的。所有动物实验均根据NIH出版并经莱顿大学动物伦理委员会批准的《实验动物护理和使用指南》（许可证号AVD1160020185325，荷兰莱顿）进行。有关协议中使用的所有材料，设备，软件和动物的详细信息，请参阅材料 表 。
1. 准备工作
注意：所有步骤都在细胞培养流柜中执行。
- 通过将仪器浸入70%乙醇中20分钟来清洁镊子和剪刀。
- 准备由补充有B-27加（1x），L-谷氨酰胺（2mM）和1%抗生素抗真菌剂的神经基培养基组成的神经节培养基。在室温下预热神经节介质。
- 制备消化溶液：将0.25%胰蛋白酶-EDTA（1：1）和1，400 U / mL胶原酶2型溶解在神经节培养基中。
- 制备新鲜，冷（4°C）细胞洗涤缓冲液（0.4%牛血清白蛋白[BSA]）和裂解缓冲液（10mM Tris-HCl，10mM NaCl，3mM MgCl2和0.1%非离子洗涤剂，40 U / mL RNAse在无核酶水中）用于细胞核分离。
- 制备细胞核洗涤缓冲液（1x磷酸盐缓冲盐水[PBS]与2.0%BSA和0.2U / μL RNase抑制剂）。
- 制备ST染色缓冲液（ST-SB）（10mM Tris-HCl，146mM NaCl，21mM MgCl2，1 mM CaCl2，2%BSA，0.02%吐温-20在无核酸酶水中）。
2. 成年小鼠上颈神经节（SCG）的解剖
- 对小鼠实施安乐死，并将它们放在冰上。
注意：在目前的研究中，共有4只C57BL6 / J小鼠通过CO2 窒息安乐死。或者，当需要收集大量血液用于其他研究目的时，可以使用异氟醚，然后放血。 - 将小鼠固定在带有针脚的解剖板上，并用70%乙醇浇注，以尽量减少毛皮的分散（不需要剃须）。
- 在立体显微镜下，用剪刀进行中线切口，打开颈部区域的皮肤，将下颌下腺移开，然后取出胸骨肌以暴露并定位颈总动脉及其分叉（图1A，B，见箭头）。
- 解剖左右颈动脉分叉及其附着的组织。将每个解剖的组织转移到含有冷PBS的单独的3.5厘米培养皿中。
- 寻找附着在颈动脉分叉上的SCG。通过移除培养皿中的动脉和其他附着的组织来进一步清洁SCG（图1E）。
3. 成年小鼠星状神经节（StG）的解剖
- 要剖析StG，请在腹部进行中线切口，然后打开横膈膜和腹侧胸壁。
- 切除心脏和肺部，露出胸背。在第一肋骨水平处寻找左和右StG前外侧至肌肉碰撞长肌（MCL）（图1C，D，用虚线表示）。
- 用镊子解剖左右StG，并将它们分别转移到含有冷PBS的3.5厘米培养皿中（图1F）。
4. 小鼠神经节细胞的分离和冷冻保存
图 2 总结了步骤 4-6。
- 小心地将所有单独的 SCG 和 StG 转移到带有镊子的分离 1.5 mL 微量离心管中。
注意：不要使用移液器吸头来转移神经节，因为神经节容易粘附在塑料移液器吸头的壁上。 - 向每个微量离心管中加入500μL0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，并在37°C的振荡水浴中孵育40分钟。
注意：此步骤旨在促进以下胶原酶2型溶液中的消化和细胞释放。 - 为每个样品准备一个含有5 mL神经节培养基的15 mL管。让神经节在微量离心管的底部沉降。收集含有极少数神经节细胞的上清液，将上清液转移到制备的15mL管中，并标记每个管。或者，为了节省一些时间，在不收集的情况下吸出胰蛋白酶- EDTA上清液，因为可以在其中检测到很少的解离细胞。
注意：少量胰蛋白酶-EDTA溶液（~10-30μL）可以留在微量离心管中，以避免去除神经节。避免在此步骤中移液，因为它可能会损伤神经节并导致神经节细胞的低输出。 - 将500μL胶原酶2型溶液加入每个微量离心管中，并在37°C的振荡水浴中孵育35-40分钟。尝试在35分钟后重悬神经节;如果神经节仍然完好无损且不解离，请根据需要延长孵育时间或增加胶原酶2型溶液的浓度。
注意：孵育时间可能因神经节大小而异。 - 通过上下移液约10次或直到不再检测到组织团块，将神经节重悬于胶原酶溶液中。
- 将细胞悬浮液转移到先前使用的15mL管中，该管含有来自同一神经节的神经节培养基和胰蛋白酶-EDTA悬浮液。在室温下用摆动的桶形转子离心机旋转10分钟，300× g 。小心地丢弃细胞上清液。
注意：由于神经节细胞与单个神经节解离，因此细胞沉淀可能太小而无法用眼睛检测到;少量上清液可以留在管中，以避免意外去除细胞沉淀。 - 将神经节细胞重悬于270μL胎牛血清（FBS，低内毒素）中，并将每个细胞FBS悬浮液转移到1mL冷冻管中。
- 为了计数细胞，将5μL神经节细胞悬浮液与5μL0.4%台盼蓝染料混合，并将混合物加载到血细胞计数器中。在显微镜下计算总细胞数和活细胞数。
注意：使用这种解离方案，细胞活力（活细胞计数/总细胞计数=活力%）通常高于90%。当从12至16周龄的小鼠中分离出神经节时，单个神经节（SCG或StG）的活细胞计数通常在9，000-60，000个细胞的范围内。 - 向冷冻管中的每个细胞FBS悬浮液中加入30μL二甲基亚砜（DMSO），充分混合，并将冷冻管转移到细胞冷冻容器中，该容器保持在室温下。将冷冻装载的容器在-80°C下储存过夜，并在第二天将冷冻管转移到液氮中，以便在测序前长期保存。
5. 细胞核分离
注意：从4只小鼠（共8个样品）中分离的左右SCG作为以下细胞核分离和测序制备的实例。在整个过程中将所有东西都放在冰上。由于小核沉淀的隐蔽性，强烈建议使用带有摆动桶的离心机，以促进整个过程中的上清液去除。
- 准备15 mL管，顶部有过滤器（30μm），并用1mL神经节培养基预冲洗滤网。
- 从液氮中取出冷冻管，并立即在37°C的水浴中解冻。 当一小粒冰留在冷冻室中时，将冷冻管从水浴中取出。
- 通过将1mL神经节培养基滴入每个冷冻管中，同时用手仔细摇动来恢复神经节细胞。 可选：为了评估细胞恢复，请在回收后混合细胞悬浮液，并取出5μL细胞悬浮液进行活细胞计数，如步骤4.8中所述。
- 将每个神经节细胞悬浮液加载到单独的过滤器（在步骤5.1中制备）上，并用4-5mL神经节培养基冲洗每个过滤器。
- 将过滤的细胞悬浮液在300× g下离心5分钟，小心地除去上清液，并将细胞重悬于50μL细胞洗涤缓冲液中。
- 将细胞悬浮液转移到低结合DNA / RNA 0.5mL微量离心管中。
- 在4°C下以500× g 离心细胞悬浮液5分钟。
- 在不接触管底部的情况下除去45μL上清液，以避免移位细胞沉淀。
- 加入45μL冷冻裂解缓冲液，并使用200μL移液器吸头轻轻上下移液。
- 将细胞在冰上孵育8分钟。
- 向每个管中加入50μL冷核洗涤缓冲液。 不要混合。
- 在4°C下以600× g 离心细胞核悬浮液5分钟。
- 除去95μL上清液而不破坏细胞核沉淀。
- 向沉淀中加入45μL冷却的细胞核洗涤缓冲液。 可选：取5μL细胞核悬浮液，与5μL0.4%台盼蓝混合计数，并用血细胞计数器在显微镜下检查细胞核的质量。
- 在4°C下以600× g 离心细胞核悬浮液5分钟。
- 在不接触管底部的情况下除去上清液，以避免移位细胞核沉淀。
6. 具有主题标签寡核苷酸（HTO）和多路复用的核条形码
注意：根据Gaublomme等人先前在皮质组织中的应用，修改并优化了HTO染色步骤，以对非常少量的（神经节）细胞核进行核标记。
- 向细胞核沉淀中加入50μLST-SB缓冲液，轻轻移液8-10次，直到细胞核完全重悬。
- 每50μLST-SB /核混合物加入5μLFc封闭试剂，并在冰上孵育10分钟。
- 每管ST-SB /核混合物加入1μL（0.5μg）单核标签抗体，并在冰上孵育30分钟。
注意：较短的孵育时间导致标签标记的效率降低，如代表性结果所示。 - 向每个试管中加入100μLST-SB。 不要混合。
- 在4°C下离心细胞核悬浮液5分钟，600× g 。
- 除去145μL上清液而不破坏细胞核沉淀。
- 重复步骤 6.4 和 6.5。在不接触管底部的情况下尽可能去除上清液，以避免移位细胞核沉淀。
- 将细胞核沉淀重悬于50μLST-SB中，并轻轻混合细胞核。
- 取5μL细胞核悬浮液，并将其与5μL0.4%台盼蓝混合，在显微镜下计数细胞核。参见 图3A ，了解与台盼蓝混合并装入血细胞计数器的细胞核的代表性图像。
- 在4°C下以600× g 离心细胞核悬浮液5分钟。
- 根据相应的细胞核计数，将细胞核重悬于ST-SB中，使每个样品的目标细胞核浓度达到1，000-3，000个细胞核/μL。
- 将样品池化以达到所需的细胞数。
注意：例如，在该实验中，将8个样品平均合并以达到总共25，000个细胞核，然后立即进入10x基因组学铬和snRNA-seq。当从12至16周龄的小鼠中分离神经节时，细胞核计数通常在6，000-40，000个细胞的范围内。只有大约一半的总上样核可以通过基于液滴的snRNA-seq捕获。例如，制备了25，000个细胞核混合物以确保捕获10，000个细胞核，这是进一步文库制备和测序所必需的。
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Representative Results
单核cDNA文库制备和snRNA-seq的质量控制分析
代表性结果描述了单个池中10，000个捕获的细胞核的测序结果，该池具有25，000次读取/细胞核基因表达库和5，000次读取/核主题标签库。 图3B 显示了用生物分析仪检查的第 一链cDNA，基因表达（GEX）文库和HTO文库的质量控制结果。HTO衍生的cDNA预计小于180 bp，而mRNA衍生的cDNA大于300 bp。高质量GEX库可以被检测为从300到1，000 bp的宽峰，HTO库被检测为194 bp的特定峰值。Seurat R包19 随后用于质量控制和下游分析。
通过使用Seurat内置的解复用策略鉴定HTO来执行snRNA-seq数据的解复用。每个HTO的解复用能力首先通过HTO表达文件可视化（补充图S1）。在 图4A的热图中，单链蛋白被检测为具有特定HTO表达的细胞核，而双质和阴性蛋白则显示多个或没有HTO的非特异性表达。值得注意的是，使用10分钟HTO抗体孵育方法检测到约33%的细胞核为阴性。在随后的实验中，将孵育时间（步骤6.3）从10分钟延长至30分钟，显示出负标记的细胞核显着减少（补充图S2）。这些发现表明，延长抗体孵育时间可能会提高标签效率。
图4B-D中的小提琴图显示了基因数量（nFeature_RNA），唯一分子标识符（UMI）的数量（nCount_RNA）以及snRNA-seq数据集中线粒体计数（percent.mt）的百分比，以识别异常值和低质量细胞核。只有当满足以下标准时，才将原子核纳入下游分析：一） nFeature_RNA > 500和nCount_RNA < 20，000;ii） percent.mt < 5%;iii）单个细胞核显示出单个HTO的清晰表达。在Seurat中使用默认方法对基因表达计数进行归一化：875个（2.71%）基因被检测为高度可变的基因（图4E）。对snRNA-seq GEX进行缩放，进行肘部图以评估将用于下游分析的主成分的包含情况（图4F）。总共包括18台PC。群集的分辨率为 0.4。
将细胞核聚类，并进行降维（UMAP）以可视化12个单独的簇（图5A）。每个簇的中位原始基因计数在991.5和4，586之间变化（补充图S3A，B）。可视化 UMAP 内 HTO 抗体的分裂可显示神经节的清晰分布，表明所有簇都存在于每个神经节中（图 5B）。为了验证HTO样品分离的准确性，评估X无活性特异性转录本（Xist，在不活跃的女性X染色体中表达）的表达以鉴定男性样品和女性样品（图5C）。 Xist 表达符合主题标签标记，表明HTO 1-4标记样本为女性样本，HTO 5-8标记样品为男性样品。这表明策划的HTO标签具有高度特异性。
为了进一步验证本方法测序数据的质量和分辨率，首先检查了交感神经元的一些关键转录本。结果显示存在交感神经元，其在簇5和7中高度表达Th，Dbh和Snap25（图5D-F）。检测卫星神经胶质细胞，在0-3簇中表达S100b（图5G）20。在具有高表达的Pecam1（图5H）的4簇中检测到内皮细胞，在具有高表达的Acta2的簇8中检测到基质细胞（图5I）。这些结果支持使用snRNA-seq成功捕获交感神经节的神经元，卫星神经胶质，内皮和基质细胞的细胞核。
图1：解剖成年小鼠上颈神经节和星状神经节。 （A）SCG位置的明场图像。（B）为了便于可视化，使用了Wnt1Cre;mT/mG鼠标。星号表示SCG（eGFP +），箭头表示颈动脉的分叉。左面板，相差图像;右面板，荧光图像。（C） StG 位置的明场图像 （D） 星号表示 StG （eGFP+），虚线表示 MCL。左面板，相差图像;右面板，荧光图像。（E）将解剖的神经节单独转移到培养皿中，以便在立体显微镜下进一步清洁。（F）左面板，解剖的SCG仍附着在颈动脉上。虚线轮廓表示 SCG。在右面板上，解剖和清理的StG具有倒三角形的形状，如虚线轮廓所示。比例尺 = 1，000 μm。缩写：SCG =上颈神经节;StG = 星状神经节;MCL = 肌肉科利长;eGFP = 增强的绿色荧光蛋白。 请点击此处查看此图的大图。
图2：基于标签染色的snRNA-seq样品制备和多路复用的工作流程。 该流程图描述了从神经节细胞解离（橙色），细胞核分离（蓝色）以及针对snRNA-seq进行的标签抗体染色和多路复用（绿色）的步骤。缩写：FBS =胎牛血清;ST-SB = ST染色缓冲液;snRNA-seq = 单核RNA测序。 请点击此处查看此图的大图。
图3：细胞核分离和基因表达文库制备的质量控制。 （A）HTO染色细胞核的相差图像。细胞核用箭头表示。比例尺 = 100 μm. （B）第 一条链 cDNA（顶部）、GEX 文库（中）和 HTO 文库（下图）的生物分析仪结果。缩写：GEX = 基因表达;HTO = 主题标签寡核苷酸。 请点击此处查看此图的大图。
图4：标签寡核苷酸标记效率的质量控制和snRNA-seq的质量控制（A）用标签抗体孵育时间为10分钟的HTO染色的热图。（B-D）描述基因数量的质量控制指标的小提琴图（nFeature_RNA，B）;UMI的数量（nCount_RNA，C）;线粒体计数的百分比（percent.mt，D）。（E）在测序的32，285个基因中，有875个（2.71%）被确定为散点图中可视化的高度可变特征。（F） PC的肘部图，以确定是否包含用于聚类的真实信号。缩写：snRNA-seq = 单核RNA测序;HTO = 标签寡核苷酸;PC = 主组件。请点击此处查看此图的大图。
图5：聚簇snRNA-seq数据集的snRNA-seq分析的代表性结果（A）UMAP图。（B）可视化合并HTO样品分布的UMAP图。（C）解复用后验证女性样本（高Xist表达）的小提琴情节。（D-I）显示所选标记基因的UMAP图;簇高度表达红色圆圈内指示的相应基因：D-F，交感神经元（Th，Dbh，Snap25）;（G） 卫星神经胶质细胞（S100b）;（H） 内皮细胞（Pecam1）;（I）基质细胞（Acta2）。缩写：snRNA-seq = 单核RNA测序;HTO = 标签寡核苷酸;UMAP = 均匀流形近似和投影。请点击此处查看此图的大图。
补充图S1：具有代表性的单核测序结果的质量控制指标。 单个样品的HTO表达谱可视化所用标签抗体的解复用能力。缩写：HTO = 主题标签寡核苷酸。 请点击此处下载此文件。
补充图S2：与HTO抗体一起孵育30分钟的后续样品的HTO表达热图。 HTO解复用后负标记细胞核数量与 图4A 的比较显示，延长抗体孵育时间后，细胞核标记明显改善。缩写：HTO = 主题标签寡核苷酸。 请点击此处下载此文件。
补充图S3：每个簇的基因表达的中位数和分位数。 （A）每个簇的中位非零原始基因表达。（B）各簇非零原始基因表达的描述性统计。Q1：第 25百 分位，Q3：第 75 百分位。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
在这里，描述了一个详细的方案，重点是i）解剖成年小鼠上颈椎和星状交感神经节，ii）神经节细胞的分离和冷冻保存，iii）细胞核分离，以及iv）使用HTO标记进行细胞核条形码以进行多重检测和snRNA-seq。
通过该方案，可以使用常用的胰蛋白酶和胶原酶解离单个神经节，从而轻松获得交感神经节细胞。通过补充10%DMSO的FBS中冷冻细胞，也很容易实现分离的神经节细胞的长期保存，其解冻后显示出高质量的恢复。此外，与传统的单细胞RNA测序相比，使用基于液滴的单鼠交感神经节的snRNA-seq结合HTO染色的细胞核条形码具有以下优点：i）样品可以长期保存，直到所有样品都准备好进一步分离细胞核;ii）从多个小尺寸神经节中分离出的高质量细胞核可以合并在一起进行测序，而不会因分离的样品制备而产生批次效应;iii）通过使用细胞核条形码在测序后追溯明显神经节起源的能力;和iv）成本效益，因为只需要单个文库准备。重要的是，所描述的分离和细胞培养方案为小鼠宫颈和星状神经节提供了单一的统一方法，并且可能适用于其他神经节，例如背根神经节和其他物种，例如人神经节。
scRNA-seq的主要优点之一是能够识别（新型）细胞类型并揭示本体RNA-seq无法检测到的稀有细胞群。基于液滴的scRNA-seq平台有助于捕获更多细胞。因此，与基于板的测序平台相比，它可以提供大细胞群的细胞（亚）类型和转录异质性的汇总视图。然而，基于液滴（例如，10倍铬）平台不适用于大于50μm的细胞，限制了其在大细胞如人神经元（~100μm）中的应用。snRNA-seq技术的可用性克服了这一缺点，因为细胞核的尺寸很小。此外，snRNA-seq是高度互联和低产量细胞（如神经元和冷冻组织）的基因表达研究的有用方法。
虽然可以在没有先前细胞解离的情况下直接从组织中分离细胞核，但采用两步细胞核分离方法是有益的，该方法首先将神经节解离成单个细胞（可以保存在液氮中），然后进行细胞核分离。由于小鼠交感神经节的尺寸小，发现使用两步细胞核分离方法获得的细胞核比使用一步细胞核分离方法获得的细胞核更多。cDNA、文库和测序分析的质量检查表明细胞核/RNA 质量良好。此外，物流也得到了改善，因为在集体测序之前，可以在不同的时间点收集和存储样品。单核分析还揭示了神经元和神经胶质细胞的成功恢复和捕获，表明所描述的两步细胞核分离方法可能更适合在小组织中应用。
该协议的另一个优点是与条形码抗体21进行多路复用。小鼠交感神经节是一个微小的组织（平均大小0.1 mm3），并且来自单个神经节的细胞数量少，本身不足以进行基于液滴的测序。然而，将不同小鼠的几个神经节或同一只小鼠的不同神经节合并将导致单个小鼠信息或单个神经节信息的丢失。作为一种解决方案，HTO染色步骤易于执行，并且可以在细胞核池化之前对来自不同小鼠或不同神经节的细胞核进行条形码标记。该方案通过已知雌性细胞核群体中匹配的 Xist 表达来验证HTO解复用的准确性。因此，使用条形码抗体进行细胞核多重检测可减少批次效应并降低测序成本。
snRNAseq的潜在局限性可能是，由于细胞核中新生转录本的自然存在，细胞核中的RNA组成与对神经元活动的早期反应有关，因此细胞核中的RNA组成之间存在差异22，23。细胞核和细胞质也可能在转录本上有所不同，这取决于细胞周期状态24。在单个细胞核（约7，000个基因）中检测到的转录本少于在细胞中检测到的转录本（约11，000个基因）14。因此，scRNA-seq和snRNA-seq可能在转录本水平上产生不同的结果。然而，scRNA-seq和snRNA-seq之间的比较证明了区分脑组织14的神经元细胞类型的相似能力。为了通过snRNA-seq改善高度相似的细胞类型或亚型之间的区分，可能需要更多的细胞核来补偿与scRNA-seq相比较低的基因检测能力。此外，尽管HTO解复用的准确性足够，但一些数据的丢失是不可避免的，因为并非所有细胞核都显示出HTO特异性。抗体孵育的进一步优化可以最大限度地减少具有双重或阴性HTO表达的细胞核的数量。
综上所述，该协议提供了从交感神经节测序神经元核的实验程序，通过易于遵循的工作流程从神经节分离到低细胞输入的细胞核制备，然后是基于HTO染色的snRNA-seq细胞核标记。该协议提供了所有关键步骤的详细概述，这些步骤可以轻松执行并应用于小鼠和其他物种的各种神经节。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢Susan L. Kloet（荷兰莱顿LUMC人类遗传学系）在实验设计和有用讨论方面的帮助。我们感谢Emile J. de Meijer（荷兰莱顿LUMC人类遗传学系）在单核RNA分离和测序文库准备方面的帮助。这项工作得到了荷兰科学研究组织（NWO）的支持[016.196.346 to M.R.M.J.]。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and reagents | |||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 0.4% trypan blue dye | Bio-Rad | 1450021 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004176 | use 1,400 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 67685 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| Fetal bovine serum (low endotoxin) | Biowest | S1810-500 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Cell wash buffer |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Cell wash buffer |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Nucleus Lysis buffer |
| Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent) | Sigma-Aldrich | 74385 | Nucleus Lysis buffer |
| Nuclease free water (not DEPC-treated) | Invitrogen | AM9937 | Nucleus Lysis buffer |
| Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus Lysis buffer |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | Nucleus Lysis buffer |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | Nucleus Lysis buffer |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Nucleus wash |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Nucleus wash |
| Protector RNase Inhibitor,40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus wash |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Calcium chloride solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Nuclease free water (not DEPC treated) | Invitrogen | AM9937 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Sodium Chloride Solution, 5M | Sigma-Aldrich | 59222C | ST staining buffer (ST-SB) |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST staining buffer (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody | Biolegend | 682205 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody | Biolegend | 682207 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody | Biolegend | 682209 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody | Biolegend | 682225 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody | Biolegend | 682227 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody | Biolegend | 682229 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody | Biolegend | 682231 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody | Biolegend | 682233 | Hashtag antibody |
| TruStain FcX (human) | Biolegend | 422302 | FC receptor blocking solution |
| Equipment and consumables | |||
| Bright-Line Hemacytometer | Merck | Z359629-1EA | |
| Centrifuge 5702/R A-4-38 | Eppendorf | EP022629905 | |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | EP0030108035-250EA | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish | Corning | 351008 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 10773501 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine science tools | 11252-40 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine science tools | 14091-09 | |
| Ice Pan, rectangular 4 L Orange | Corning | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Leica | Microscope | |
| Moria MC50 Scissors | Fine science tools | 15370-50 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine science tools | 15012-12 | |
| Olympus CK2 ULWCD | Olympus | Microscope | |
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| Preseparation Filters (30 µm) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| Shaking water bath | GFL | 1083 | |
| Silicon plate | RubberBV | 3530 | Dissection board |
| Software and packages | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| R programming | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #007576 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Code for the data analysis | |||
| https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE |
References
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