Summary
Este protocolo describe la preparación detallada de muestras de bajo aporte para la secuenciación de un solo núcleo, incluida la disección de ganglios cervicales y estrellados superiores de ratón, disociación celular, criopreservación, aislamiento de núcleos y código de barras hashtag.
Abstract
El sistema nervioso autónomo cardíaco es crucial en el control de la función cardíaca, como la frecuencia cardíaca y la contractilidad cardíaca, y se divide en ramas simpáticas y parasimpáticas. Normalmente, existe un equilibrio entre estas dos ramas para mantener la homeostasis. Sin embargo, los estados de enfermedad cardíaca como el infarto de miocardio, la insuficiencia cardíaca y la hipertensión pueden inducir la remodelación de las células involucradas en la inervación cardíaca, que se asocia con un resultado clínico adverso.
Aunque existen grandes cantidades de datos sobre la estructura histológica y la función del sistema nervioso autónomo cardíaco, su arquitectura biológica molecular en salud y enfermedad sigue siendo enigmática en muchos aspectos. Las nuevas tecnologías, como la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq), son prometedoras para la caracterización genética de tejidos a resolución de una sola célula. Sin embargo, el tamaño relativamente grande de las neuronas puede impedir el uso estandarizado de estas técnicas. Aquí, este protocolo explota la secuenciación de ARN de un solo núcleo basada en gotas (snRNA-seq), un método para caracterizar la arquitectura biológica de las neuronas simpáticas cardíacas en la salud y la enfermedad. Se ha demostrado un enfoque gradual para realizar snRNA-seq de los ganglios cervicales superiores bilaterales (SCG) y estrellados (StG) diseccionados de ratones adultos.
Este método permite la preservación de muestras a largo plazo, manteniendo una calidad de ARN adecuada cuando las muestras de múltiples individuos / experimentos no se pueden recolectar todas a la vez en un corto período de tiempo. El código de barras de los núcleos con oligos de hashtag (HTO) permite el demultiplexo y el rastreo de distintas muestras ganglionares después de la secuenciación. Los análisis posteriores revelaron una captura exitosa de núcleos de células neuronales, gliales satélites y endoteliales de los ganglios simpáticos, según lo validado por snRNA-seq. En resumen, este protocolo proporciona un enfoque gradual para snRNA-seq de ganglios cardíacos extrínsecos simpáticos, un método que tiene el potencial de una aplicación más amplia en estudios de la inervación de otros órganos y tejidos.
Introduction
El sistema nervioso autónomo (SNA) es una parte crucial del sistema nervioso periférico que mantiene la homeostasis corporal, incluida la adaptación a las condiciones ambientales y la patología1. Está involucrado en la regulación de múltiples sistemas de órganos en todo el cuerpo, como los sistemas cardiovascular, respiratorio, digestivo y endocrino. El SNA se divide en ramas simpáticas y parasimpáticas. Las ramas espinales del sistema nervioso simpático hacen sinapsis en los ganglios de la cadena simpática, situadas bilateralmente en posición paravertebral. Los ganglios cervicales y torácicos bilaterales, especialmente el StG, son componentes importantes que participan en la inervación simpática cardíaca. En estados de enfermedad, como la isquemia cardíaca, puede ocurrir una remodelación neuronal, lo que resulta en una sobremarcha simpática2. La remodelación neuronal se ha demostrado en múltiples estudios histológicos en humanos y varias otras especies animales 3,4,5,6. Actualmente falta una caracterización biológica detallada de la remodelación neuronal inducida por isquemia cardíaca en los ganglios simpáticos cardíacos, y las características biológicas fundamentales de los tipos o subtipos de células neuronales especializadas dentro del sistema nervioso simpático cardíaco (SNS) aún no están completamente determinadas en salud y enfermedad7.
Nuevas tecnologías, como scRNA-seq, han abierto puertas de entrada para la caracterización genética de tejidos pequeños a nivel unicelular 8,9. Sin embargo, el tamaño relativamente grande de las neuronas puede impedir el uso optimizado de estas técnicas unicelulares en humanos10. Además, la secuenciación de una sola célula requiere un alto rendimiento de células para recuperar un número suficiente de células debido a una alta pérdida en el proceso de secuenciación. Esto podría resultar desafiante cuando se estudian tejidos pequeños que son difíciles de capturar en una sesión y requieren múltiples muestras para introducir suficientes células individuales para la secuenciación. La tecnología snRNA-seq basada en gotas recientemente desarrollada (es decir, la plataforma 10x Chromium) permite el estudio de las diferencias biológicas entre núcleos individuales11,12. snRNA-seq tiene una ventaja sobre scRNA-seq para células grandes (>30 μm), que pueden no ser capturadas en Gel Bead en Emulsiones (GEMs), así como una mejor compatibilidad con disociación extensa y/o preservación prolongada 13,14,15.
La heterogeneidad, el número de células neuronales y otras células enriquecidas en el SNS cardíaco son aspectos importantes para la caracterización del SNA en estados de salud y enfermedad. Además, la inervación específica del órgano o región por cada ganglio simpático contribuye a la complejidad del SNS. Además, se ha demostrado que los ganglios cervicales, estrellados y torácicos de la cadena simpática inervan diferentes regiones del corazón16. Por lo tanto, es necesario realizar un análisis de núcleo único de células ganglionares derivadas de ganglios individuales para estudiar su arquitectura biológica.
El snRNA-seq basado en gotas permite el perfil de expresión de todo el transcriptoma para un grupo de miles de células de múltiples muestras a la vez con costos más bajos que las plataformas de secuenciación basadas en placas. Este enfoque permite que el snRNA-seq basado en gotas sea más adecuado para la clasificación del fenotipo celular y la identificación de nuevas subpoblaciones de células dentro del SCG y el StG. En particular, este protocolo proporciona un enfoque paso a paso conciso para la identificación, el aislamiento y la secuenciación del ARN de un solo núcleo de los ganglios cardíacos extrínsecos simpáticos, un método que tiene el potencial de una amplia aplicación en estudios de la caracterización de los ganglios que inervan otros órganos y tejidos relacionados en salud y enfermedad.
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Protocol
Este protocolo describe todos los pasos necesarios para el snRNA-seq de los ganglios cervicales murinos y/o cervicotorácicos (estrellados). Se utilizaron ratones C57BL/6J hembra y macho (15 semanas de edad, n = 2 para cada sexo). Se utilizó un ratón Wnt1-Cre;mT/mG adicional para visualizar los ganglios con fines de disección17,18. Este ratón adicional fue generado por el cruce de un ratón B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J y un ratón B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicada por los NIH y aprobada por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Leiden (número de licencia AVD1160020185325, Leiden, Países Bajos). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, equipos, software y animales utilizados en el protocolo.
1. Preparativos
NOTA: Todos los pasos se realizan en un gabinete de flujo de cultivo celular.
- Limpie las pinzas y tijeras sumergiendo los instrumentos en etanol al 70% durante 20 min.
- Preparar el medio ganglionar que consiste en Medio Neurobasal suplementado con B-27 más (1x), L-glutamina (2 mM) y 1% Antibiótico-Antimicótico. Precalentar el medio ganglionar a temperatura ambiente.
- Preparar la solución de digestión: 0,25% tripsina-EDTA (1:1) y 1.400 U/ml colagenasa tipo 2 disuelta en el medio ganglionar.
- Preparar tampón de lavado celular fresco y frío (4 °C) (0,4% de albúmina sérica bovina [BSA]) y tampón de lisis (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 y detergente no iónico al 0,1%, 40 U/mL RNAse en agua libre de nucleasas) para el aislamiento del núcleo.
- Prepare el tampón de lavado del núcleo (1x solución salina tamponada con fosfato [PBS] con BSA al 2.0% e inhibidor de la RNasa 0.2U / μL).
- Prepare el tampón de tinción ST (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 2% BSA, 0.02% Tween-20 en agua libre de nucleasas).
2. Disección de ganglios cervicales superiores (SCG) de ratón adulto
- Sacrificar a los ratones y mantenerlos en hielo.
NOTA: En el estudio actual, un total de 4 ratones C57BL6 / J fueron sacrificados por asfixia de CO2 . Alternativamente, se puede usar isoflurano seguido de exanguinación cuando se necesita recolectar una gran cantidad de sangre para otros fines de estudio. - Fije el ratón en una tabla de disección con alfileres y rocíelo con etanol al 70% para minimizar la dispersión del pelaje (no es necesario afeitarse).
- Bajo un estereomicroscopio, abra la piel de la región del cuello haciendo un corte de línea media con tijeras, mueva las glándulas submandibulares a un lado y retire el músculo esternomastoideo para exponer y localizar la arteria carótida común y su bifurcación (Figura 1A, B, ver flecha).
- Diseccionar la bifurcación de la arteria carótida derecha e izquierda y el tejido adherido a ella. Transfiera cada pieza diseccionada de tejido a una placa de Petri separada de 3,5 cm que contenga PBS frío.
- Busque el SCG unido a la bifurcación carotídea. Limpie aún más el SCG extirpando la arteria y otro tejido adherido en la placa de Petri (Figura 1E).
3. Disección de ganglios estrellados de ratón adultos (StG)
- Para diseccionar el StG, haga un corte de línea media en el abdomen, seguido de abrir el diafragma y la pared torácica ventral.
- Retire el corazón y los pulmones para exponer el tórax dorsal. Busque el StG anterolateral izquierdo y derecho al musculus colli longus (MCL) a nivel de la primera costilla (Figura 1C, D, indicado por líneas discontinuas).
- Diseccionar stG izquierdo y derecho con fórceps y transferirlos por separado a placas de Petri de 3,5 cm que contengan PBS frío (Figura 1F).
4. Aislamiento y criopreservación de células ganglionares de ratón
Los pasos 4-6 se resumen en la Figura 2.
- Transfiera cuidadosamente todos los SCG y StG individuales para separar los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con fórceps.
NOTA: No use puntas de pipeta para transferir los ganglios porque los ganglios son propensos a adherirse a la pared de las puntas de pipeta de plástico. - Añadir 500 μL de solución de tripsina-EDTA al 0,25% a cada tubo de microcentrífuga e incubar en un baño de agua agitadora a 37 °C durante 40 min.
NOTA: Este paso tiene como objetivo facilitar la digestión y la liberación celular en lo sucesivo en la solución de colagenasa tipo 2. - Prepare un tubo de 15 ml que contenga 5 ml de medio ganglionar para cada muestra. Permita que los ganglios se asienten en la parte inferior de los tubos de la microcentrífuga. Recoja el sobrenadante, que contiene muy pocas células ganglionares, transfiera el sobrenadante a los tubos preparados de 15 ml y etiquete cada tubo. Alternativamente, para ahorrar algo de tiempo, aspire el sobrenadante de tripsina-EDTA sin recolección, ya que se pueden detectar muy pocas células disociadas en él.
NOTA: Se puede dejar una pequeña cantidad de solución de tripsina-EDTA (~ 10-30 μL) en el tubo de la microcentrífuga para evitar la eliminación de los ganglios. Evite el pipeteo en este paso porque puede dañar los ganglios y conducir a una baja producción de células ganglionares después. - Añadir 500 μL de solución de colagenasa tipo 2 en cada tubo de microcentrífuga e incubar en un baño de agua agitadora a 37 °C durante 35-40 min. Trate de resuspendir el ganglio después de 35 minutos; si el ganglio todavía está intacto y no se disocia, prolongue el tiempo de incubación o aumente la concentración de solución de colagenasa tipo 2 según sea necesario.
NOTA: El tiempo de incubación puede variar dependiendo del tamaño del ganglio. - Resuspend los ganglios en solución de colagenasa mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo ~ 10 veces o hasta que ya no se detecten grupos de tejido.
- Transfiera la suspensión celular al tubo de 15 ml utilizado anteriormente que contiene el medio de cultivo de ganglios y la suspensión de tripsina-EDTA del mismo ganglio. Gire hacia abajo la suspensión de la celda con una centrífuga de rotor de cuchara oscilante durante 10 minutos, 300 × g a temperatura ambiente. Deseche cuidadosamente el sobrenadante celular.
NOTA: Debido a que las células ganglionares están disociadas de un solo ganglio, la bolita celular puede ser demasiado pequeña para detectarla a simple vista; se puede dejar una pequeña cantidad de sobrenadante en el tubo para evitar la eliminación accidental de la bolita celular. - Resuspend las células ganglionares en 270 μL de suero fetal bovino (FBS, endotoxina baja) y transferir cada suspensión célula-FBS a un criovial de 1 mL.
- Para contar las células, mezcle 5 μL de la suspensión de células ganglionares con 5 μL de colorante azul tripano al 0,4% y cargue la mezcla en un hemocitómetro. Cuente el número total y de células vivas bajo un microscopio.
NOTA: La viabilidad celular (recuento de células vivas/recuento total de células = viabilidad %) suele estar por encima del 90% con este protocolo de disociación. El recuento de células vivas de un solo ganglio (ya sea SCG o StG) generalmente cae dentro del rango de 9,000-60,000 células cuando el ganglio se aísla de un ratón de 12 a 16 semanas de edad. - Agregue 30 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada suspensión de células-FBS en los crioviales, mezcle bien y transfiera los crioviales a un recipiente de congelación celular, que se mantiene a temperatura ambiente. Guarde el recipiente cargado de criovial a -80 ° C durante la noche y transfiera los crioviales a nitrógeno líquido al día siguiente para su preservación a largo plazo antes de la secuenciación.
5. Aislamiento del núcleo
NOTA: El SCG izquierdo y derecho aislado de cuatro ratones (en total 8 muestras) se utilizó como ejemplo en la siguiente preparación de aislamiento y secuenciación del núcleo. Mantenga todo en hielo durante todo el procedimiento. Debido a la invisibilidad de los pequeños gránulos de núcleo, se recomienda encarecidamente una centrífuga con cubos oscilantes para facilitar la eliminación del sobrenadante durante todo el procedimiento.
- Preparar tubos de 15 ml con un colador (30 μm) en la parte superior y preenar el colador con 1 ml del medio ganglionar.
- Saque los crioviales del nitrógeno líquido e inmediatamente descongele en un baño de agua a 37 °C. Cuando quede una pequeña bolita de hielo en el criovial, saque los crioviales del baño de agua.
- Recupere las células ganglionares dejando caer 1 ml del medio ganglionar en cada criovial mientras se agita cuidadosamente con la mano. Opcional: Para evaluar la recuperación celular, mezcle la suspensión celular después de la recuperación y saque 5 μL de suspensión celular para el conteo de células vivas, como se describe en el paso 4.8.
- Cargue cada suspensión de células ganglionares en un colador separado (preparado en el paso 5.1) y enjuague cada colador con 4-5 ml de medio ganglionar.
- Centrifugar la suspensión celular tensada durante 5 min a 300 × g, retirar el sobrenadante con cuidado y resuspendir las células en 50 μL de tampón de lavado celular.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de ADN/ARN de baja unión de 0,5 ml.
- Centrifugar la suspensión celular a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
- Retire 45 μL del sobrenadante sin tocar la parte inferior del tubo para evitar desalojar la bolita celular.
- Agregue 45 μL de tampón de lisis refrigerado y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 200 μL.
- Incubar las células durante 8 min sobre hielo.
- Añadir 50 μL de tampón de lavado de núcleo frío a cada tubo. No mezclar.
- Centrifugar la suspensión del núcleo a 600 × g durante 5 min a 4 °C.
- Retire 95 μL del sobrenadante sin interrumpir el núcleo pellet.
- Agregue 45 μL de tampón de lavado de núcleo refrigerado al pellet. Opcional: Tomar 5 μL de suspensión de núcleo, mezclar con 5 μL de azul de tripano al 0,4% para contar, y comprobar la calidad de los núcleos bajo un microscopio con un hemocitómetro.
- Centrifugar la suspensión del núcleo a 600 × g durante 5 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante sin tocar la parte inferior del tubo para evitar desalojar el núcleo pellet.
6. Código de barras nucleus con hashtag oligos (HTOs) y multiplexación
NOTA: Los pasos de tinción HTO fueron modificados y optimizados para el etiquetado nuclear de cantidades muy bajas de núcleos (ganglionares) de acuerdo con la aplicación previa en tejido cortical por Gaublomme et al.15.
- Agregue 50 μL de tampón ST-SB al gránulo del núcleo, pipetee suavemente 8-10 veces hasta que los núcleos se resuspendan por completo.
- Añadir 5 μL de reactivo de bloqueo de Fc por 50 μL de la mezcla ST-SB/núcleos e incubar durante 10 min sobre hielo.
- Añadir 1 μL (0,5 μg) de anticuerpo hashtag de un solo núcleo por tubo de la mezcla ST-SB/núcleos e incubar durante 30 min en hielo.
NOTA: Un tiempo de incubación más corto conduce a una menor eficiencia del etiquetado de hashtags, como se demuestra en los resultados representativos. - Añadir 100 μL de ST-SB a cada tubo. No mezclar.
- Centrifugar la suspensión del núcleo durante 5 min, 600 × g a 4 °C.
- Retire 145 μL del sobrenadante sin interrumpir el núcleo pellet.
- Repita los pasos 6.4 y 6.5. Retire el sobrenadante tanto como sea posible sin tocar la parte inferior del tubo para evitar desalojar el núcleo pellet.
- Resuspend el núcleo pellet en 50 μL de ST-SB, y mezclar suavemente los núcleos.
- Tome 5 μL de la suspensión del núcleo y mézclelo con 5 μL de azul de tripano al 0,4% para contar los núcleos bajo un microscopio. Vea la Figura 3A para una imagen representativa de núcleos mezclados con azul tripano y cargados en un hemocitómetro.
- Centrifugar la suspensión del núcleo durante 5 min a 600 × g a 4 °C.
- Resuspendir los núcleos en ST-SB para alcanzar una concentración de núcleo objetivo de 1.000-3.000 núcleos/μL para cada muestra de acuerdo con el recuento de núcleos correspondiente.
- Agrupe las muestras para lograr el número deseado de celdas.
NOTA: Por ejemplo, en este experimento, 8 muestras se agruparon igualmente para lograr un total de 25,000 núcleos para proceder inmediatamente a 10x Genomics Chromium y snRNA-seq después. El recuento de núcleos generalmente cae dentro del rango de 6,000-40,000 células cuando el ganglio se aísla de un ratón de 12 a 16 semanas. Solo alrededor de la mitad del total de núcleos cargados puede ser capturado por snRNA-seq basado en gotas. Por ejemplo, se preparó una mezcla de 25.000 núcleos para garantizar la captura de 10.000 núcleos, que es necesaria para una mayor preparación y secuenciación de la biblioteca.
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Representative Results
Análisis de control de calidad de la preparación de la biblioteca de ADNc de núcleo único y snRNA-seq
Los resultados representativos describen los resultados de secuenciación de 10.000 núcleos capturados en un solo grupo con una biblioteca de expresión génica de 25.000 lecturas/núcleo y una biblioteca de hashtags de 5.000 lecturas/núcleo. La Figura 3B ilustra los resultados del control de calidad del1er hebra de ADNc, la biblioteca de expresión génica (GEX) y la biblioteca HTO, que se verificaron con Bioanalyzer. Se espera que los ADNc derivados de HTO sean menores de 180 pb, mientras que los ADNc derivados de ARNm sean mayores de 300 pb. Una biblioteca GEX de alta calidad se puede detectar como un pico amplio de 300 a 1.000 pb, y la biblioteca HTO se detecta como un pico específico de 194 pb. Cell Ranger se utilizó para el demultiplexo, la generación de archivos fastq y la alineación de lectura por configuración predeterminada. Seurat R paquete19 se utilizó posteriormente para el control de calidad y los análisis posteriores.
El demultiplexo de los datos de snRNA-seq se realizó mediante la identificación de HTO utilizando la estrategia de demultiplexación incorporada de Seurat. La capacidad de demultiplexación para cada HTO se visualizó por primera vez con archivos de expresión HTO (Figura suplementaria S1). En el mapa de calor de la Figura 4A, los singletes se detectan como núcleos con expresión específica de HTO, mientras que los dobletes y negativos muestran una expresión inespecífica de HTO múltiples o nulos. Cabe destacar que aproximadamente el 33% de los núcleos se detectaron como negativos utilizando un enfoque de incubación de anticuerpos HTO de 10 minutos. La prolongación del tiempo de incubación (paso 6.3) de 10 min a 30 min en un experimento posterior reveló una notable disminución en los núcleos marcados negativamente (Figura suplementaria S2). Estos hallazgos indican que prolongar el tiempo de incubación de anticuerpos puede mejorar la eficiencia del hashtag.
Los gráficos de violín en la Figura 4B-D demuestran el número de genes (nFeature_RNA), el número de identificadores moleculares únicos (UMI) (nCount_RNA) y el porcentaje de recuentos mitocondriales (percent.mt) dentro del conjunto de datos snRNA-seq para identificar valores atípicos y núcleos de baja calidad. Los núcleos sólo se incluyeron en el análisis posterior cuando se cumplieron los siguientes criterios: i) nFeature_RNA > 500 y nCount_RNA < 20.000; ii) percent.mt < 5%; iii) el núcleo individual mostró una clara expresión de un solo HTO. Los recuentos de expresión génica se normalizaron utilizando el método predeterminado en Seurat: se detectaron 875 (2,71%) genes como genes altamente variables (Figura 4E). Se escaló snRNA-seq GEX, se realizó y se utilizó la gráfica de codo para evaluar la inclusión de componentes principales que se utilizarían para los análisis posteriores (Figura 4F). En total, se incluyeron 18 PC. El clustering se realizó con una resolución de 0,4.
Los núcleos se agruparon y se realizó la reducción de dimensión (UMAP) para la visualización de los 12 grupos individuales (Figura 5A). La mediana del recuento de genes brutos por grupo varía entre 991,5 y 4.586 (Figura suplementaria S3A, B). La visualización de la división de los anticuerpos HTO dentro del UMAP revela una clara distribución de los ganglios, lo que indica que todos los grupos se presentan en cada ganglio (Figura 5B). Para validar la exactitud de la segregación de muestras HTO, se evaluó la expresión de X Transcripción Específica Inactiva (Xist, expresada en el cromosoma X femenino inactivo) para identificar las muestras masculinas y las muestras femeninas (Figura 5C). La expresión Xist estaba de acuerdo con el etiquetado del hashtag, mostrando que las muestras etiquetadas HTO 1-4 eran muestras femeninas, y las muestras etiquetadas HTO 5-8 eran muestras masculinas. Esto sugiere que el etiquetado HTO curado es altamente específico.
Para verificar aún más la calidad y la resolución de los datos de secuenciación con el presente método, primero se examinaron algunas transcripciones clave de neuronas simpáticas. Los resultados muestran la presencia de neuronas simpáticas que expresan altamente Th, Dbh y Snap25 en los grupos 5 y 7 (Figura 5D-F). Se detectaron células gliales satélite con la expresión de S100b en grupos 0-3 (Figura 5G)20. Se detectaron células endoteliales en el grupo 4 con una alta expresión de Pecam1 (Figura 5H) y células estromales en el grupo 8 con una alta expresión de Acta2 (Figura 5I). Estos resultados apoyan la captura exitosa de núcleos de células neuronales, satélite gliales, endoteliales y estromales del ganglio simpático utilizando snRNA-seq.
Figura 1: Disección de ganglios cervicales superiores de ratón adulto y ganglios estrellados. (A) Imagen de campo brillante de la ubicación del SCG. (B) Para facilitar la visualización, se utilizó un ratón Wnt1Cre;mT/mG. Los asteriscos indican el SCG (eGFP+), las puntas de flecha indican la bifurcación de la arteria carótida. Panel izquierdo, imagen de contraste de fase; panel derecho, imagen fluorescente. (C) Imagen de campo brillante de la ubicación del StG. (D) Los asteriscos indican el StG (eGFP+), las líneas discontinuas indican el MCL. Panel izquierdo, imagen de contraste de fase; panel derecho, imagen fluorescente. (E) Los ganglios disecados se transfieren a una placa de Petri por separado para su posterior limpieza bajo un estereomicroscopio. (F) Panel izquierdo, el SCG diseccionado con la arteria carótida todavía unida. El contorno discontinuo indica el SCG. Panel derecho, el StG diseccionado y limpiado tiene la forma de un triángulo invertido, como lo indica el contorno discontinuo. Barra de escala = 1.000 μm. Abreviaturas: SCG = ganglios cervicales superiores; StG = ganglios estrellados; MCL = musculus colli longus; eGFP = proteína fluorescente verde mejorada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Flujo de trabajo de preparación de muestras y multiplexación basada en tinción de hashtags para snRNA-seq. El diagrama de flujo muestra los pasos desde la disociación de las células ganglionares (naranja), el aislamiento del núcleo (azul) y la tinción y multiplexación de anticuerpos hashtag (verde) que se llevan a cabo para snRNA-seq. Abreviaturas: FBS = suero fetal bovino; ST-SB = tampón de tinción ST; snRNA-seq = secuenciación de ARN de un solo núcleo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Control de calidad del aislamiento del núcleo y preparación de la biblioteca de expresión génica. (A) Imagen de contraste de fase de los núcleos teñidos con HTO. Los núcleos se indican con flechas. Barra de escala = 100 μm. (B) Resultados del bioanalizador de1ª hebra de CDNA (arriba), biblioteca GEX (centro) y biblioteca HTO (abajo). Abreviaturas: GEX = expresión génica; HTO = hashtag oligo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Control de calidad de la eficiencia del hashtag oligo labeling y control de calidad de snRNA-seq. (A) Mapa de calor de tinción HTO logrado con un tiempo de incubación de 10 min con anticuerpos hashtag. (B-D) Gráficos de violín de métricas de control de calidad que representan el número de genes (nFeature_RNA, B); el número de UMI (nCount_RNA, C); el porcentaje de recuentos mitocondriales (percent.mt, D). (E) Del total de 32.285 genes secuenciados, 875 (2,71%) se identificaron como características altamente variables como se visualiza en el diagrama de dispersión. (F) Diagrama de codo de pc para determinar la inclusión de la señal verdadera utilizada para la agrupación. Abreviaturas: snRNA-seq = secuenciación de ARN de un solo núcleo; HTO = hashtag oligo; PCs = componentes principales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados representativos del análisis de snRNA-seq. (A) Gráfico UMAP del conjunto de datos snRNA-seq agrupado. (B) Gráfico UMAP que visualiza la distribución de las muestras HTO agrupadas. (C) Gráfica de violín que valida muestras femeninas (alta expresión Xist) después del demultiplexo. (D-I) Gráficos UMAP que muestran genes marcadores seleccionados; los cúmulos expresan altamente los genes correspondientes que se indican dentro de los círculos rojos: D-F, neuronas simpáticas (Th, Dbh, Snap25); G) Células gliales satélite (S100b); H) Células endoteliales (Pecam1); (I) Células estromales (Acta2). Abreviaturas: snRNA-seq = secuenciación de ARN de un solo núcleo; HTO = hashtag oligo; UMAP = aproximación y proyección de variedades uniformes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria S1: Métricas de control de calidad de un resultado representativo de secuenciación de un solo núcleo. Perfiles de expresión HTO de muestras individuales que visualizan la capacidad de demultiplexación de los anticuerpos hashtag utilizados. Abreviatura: HTO = hashtag oligo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Mapa de calor de expresión de HTO de muestras posteriores incubadas con anticuerpos HTO durante 30 min. La comparación del número de núcleos marcados negativamente después del demultiplexación de HTO con la Figura 4A muestra una marcada mejora del etiquetado de núcleos después de prolongar el tiempo de incubación de anticuerpos. Abreviatura: HTO = hashtag oligo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S3: Mediana y cuantiles de expresión génica por grupo. (A) Mediana de expresión génica bruta distinta de cero de cada grupo. (B) Estadísticas descriptivas de la expresión génica cruda distinta de cero de cada grupo. Q1: percentil25, Q3: percentil75. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Aquí, se describe un protocolo detallado que se centra en i) la disección de los ganglios simpáticos cervicales y estrellados superiores de ratón adulto, ii) el aislamiento y criopreservación de las células ganglionares, iii) el aislamiento del núcleo y iv) el código de barras del núcleo con etiquetado HTO para fines de multiplexación y snRNA-seq.
Con este protocolo, las células ganglionares simpáticas se pueden obtener fácilmente disociando los ganglios individuales utilizando tripsina y colagenasa de uso común. La preservación a largo plazo de células ganglionares aisladas también se logra fácilmente congelando células en FBS suplementado con 10% de DMSO, que mostró una alta calidad de recuperación después de la descongelación. Además, en comparación con la secuenciación convencional de ARN unicelular, el uso de snRNA-seq basado en gotas de ganglios simpáticos murinos individuales combinado con la aplicación de códigos de barras de núcleo basado en tinción HTO tiene las siguientes ventajas: i) las muestras se pueden conservar durante mucho tiempo hasta que todas las muestras estén listas para un mayor aislamiento del núcleo; ii) los núcleos de buena calidad aislados de múltiples ganglios de pequeño tamaño se pueden agrupar para la secuenciación sin un efecto de lote causado por la preparación de muestras separadas; iii) la capacidad de rastrear el origen ganglionar distinto después de la secuenciación mediante el uso de códigos de barras de núcleo; y iv) la eficacia en función de los costos, ya que sólo se necesita una única preparación de la biblioteca. Es importante destacar que el protocolo de aislamiento y cultivo celular descrito proporciona un único método uniforme para los ganglios cervicales y estrellados murinos y es potencialmente aplicable a otros ganglios, como los ganglios de la raíz dorsal y otras especies, por ejemplo, los ganglios humanos.
Una de las principales ventajas de scRNA-seq es la capacidad de identificar (nuevos) tipos de células y revelar poblaciones celulares raras que no pudieron ser detectadas por RNA-seq a granel. La plataforma scRNA-seq basada en gotas facilita la captura de más células. Por lo tanto, puede proporcionar una vista agregada de los (sub)tipos de células y la heterogeneidad transcripcional de una población de células grandes en comparación con una plataforma de secuenciación basada en placas. Sin embargo, la plataforma basada en gotas (por ejemplo, 10x cromo) no es adecuada para células mayores de 50 μm, lo que limita su aplicación en células grandes como las neuronas humanas (~ 100 μm). La disponibilidad de la técnica snRNA-seq supera este inconveniente debido al pequeño tamaño de un núcleo. Además, snRNA-seq es un método útil para estudios de expresión génica de células altamente interconectadas y de bajo rendimiento, como neuronas y tejidos congelados.
Aunque es posible aislar directamente los núcleos de los tejidos sin disociación celular previa, fue beneficioso para el rendimiento tomar un método de aislamiento de núcleo de dos pasos que primero disocia el ganglio en células individuales (que se pueden preservar en nitrógeno líquido) seguido del aislamiento del núcleo. Debido al pequeño tamaño de un ganglio simpático de ratón, se encontró que se obtuvieron más núcleos utilizando un método de aislamiento de núcleo de dos pasos que con un enfoque de aislamiento de núcleo de un paso. El control de calidad de los análisis de ADNc, biblioteca y secuenciación indica una buena calidad de núcleos/ARN. Además, se mejora la logística, ya que las muestras se pueden recoger y almacenar en diferentes puntos temporales antes de la secuenciación colectiva. El análisis de un solo núcleo también reveló la recuperación y captura exitosas de neuronas y células gliales, lo que sugiere que el enfoque de aislamiento de núcleo de dos pasos descrito podría ser más adecuado para la aplicación en tejidos pequeños.
Otra ventaja de este protocolo es la multiplexación con anticuerpos con código de barras21. El ganglio simpático de ratón es un tejido diminuto (tamaño promedio 0,1 mm3), y el bajo número de células derivadas de un ganglio individual es insuficiente para la secuenciación basada en gotas por sí mismo. Sin embargo, la agrupación de varios ganglios de diferentes ratones o diferentes ganglios del mismo ratón causará la pérdida de información individual del ratón o información individual del ganglio. Como solución, el paso de tinción HTO es fácil de realizar y permite el etiquetado con código de barras de núcleos derivados de diferentes ratones o diferentes ganglios antes de la agrupación de núcleos. La precisión del demultiplexante HTO se verifica en este protocolo mediante la expresión Xist emparejada en poblaciones de núcleos femeninos conocidos. Por lo tanto, la multiplexación de núcleos con anticuerpos con código de barras reduce los efectos por lotes y reduce el costo de secuenciación.
Una limitación potencial de snRNAseq podría ser que puede haber diferencias entre la composición de ARN en el núcleo y el citoplasma debido a la presencia natural de transcripciones nacientes en el núcleo, asociadas con la respuesta temprana a las actividades neuronales22,23. El núcleo y el citoplasma también pueden diferir en las transcripciones dependiendo del estado del ciclo celular24. Se detectaron menos transcripciones en un núcleo individual (~7.000 genes) que en una célula (~11.000 genes)14. Por lo tanto, scRNA-seq y snRNA-seq pueden producir resultados diferentes a nivel de transcripción. Sin embargo, la comparación entre scRNA-seq y snRNA-seq demostró una capacidad similar para discriminar tipos de células neuronales de tejido cerebral14. Para mejorar la discriminación entre tipos o subtipos de células muy similares por snRNA-seq, se podrían necesitar más núcleos para compensar la menor capacidad de detección de genes en comparación con scRNA-seq. Además, aunque la precisión de la demultiplexación HTO es suficiente, la pérdida de algunos datos es inevitable ya que no todos los núcleos muestran especificidad HTO. Una mayor optimización de la incubación de anticuerpos podría minimizar el número de núcleos con expresión doble o negativa de HTO.
En conjunto, este protocolo proporciona el procedimiento experimental para secuenciar núcleos neuronales de ganglios simpáticos mediante un flujo de trabajo fácil de seguir que comienza desde el aislamiento de ganglios hasta la preparación de núcleos de baja entrada de células, seguido de un etiquetado de núcleos basado en tinción HTO para snRNA-seq. El protocolo proporciona una descripción detallada de todos los pasos clave que se pueden realizar y aplicar fácilmente a varios ganglios en murinos y otras especies.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Susan L. Kloet (Departamento de Genética Humana, LUMC, Leiden, Países Bajos) por su ayuda en el diseño experimental y las discusiones útiles. Agradecemos a Emile J. de Meijer (Departamento de Genética Humana, LUMC, Leiden, Países Bajos) por la ayuda con el aislamiento de ARN de un solo núcleo y la preparación de la biblioteca para la secuenciación. Este trabajo cuenta con el apoyo de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO) [016.196.346 a M.R.M.J.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and reagents | |||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 0.4% trypan blue dye | Bio-Rad | 1450021 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004176 | use 1,400 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 67685 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| Fetal bovine serum (low endotoxin) | Biowest | S1810-500 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Cell wash buffer |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Cell wash buffer |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Nucleus Lysis buffer |
| Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent) | Sigma-Aldrich | 74385 | Nucleus Lysis buffer |
| Nuclease free water (not DEPC-treated) | Invitrogen | AM9937 | Nucleus Lysis buffer |
| Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus Lysis buffer |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | Nucleus Lysis buffer |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | Nucleus Lysis buffer |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Nucleus wash |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Nucleus wash |
| Protector RNase Inhibitor,40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus wash |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Calcium chloride solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Nuclease free water (not DEPC treated) | Invitrogen | AM9937 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Sodium Chloride Solution, 5M | Sigma-Aldrich | 59222C | ST staining buffer (ST-SB) |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST staining buffer (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody | Biolegend | 682205 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody | Biolegend | 682207 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody | Biolegend | 682209 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody | Biolegend | 682225 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody | Biolegend | 682227 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody | Biolegend | 682229 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody | Biolegend | 682231 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody | Biolegend | 682233 | Hashtag antibody |
| TruStain FcX (human) | Biolegend | 422302 | FC receptor blocking solution |
| Equipment and consumables | |||
| Bright-Line Hemacytometer | Merck | Z359629-1EA | |
| Centrifuge 5702/R A-4-38 | Eppendorf | EP022629905 | |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | EP0030108035-250EA | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish | Corning | 351008 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 10773501 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine science tools | 11252-40 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine science tools | 14091-09 | |
| Ice Pan, rectangular 4 L Orange | Corning | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Leica | Microscope | |
| Moria MC50 Scissors | Fine science tools | 15370-50 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine science tools | 15012-12 | |
| Olympus CK2 ULWCD | Olympus | Microscope | |
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| Preseparation Filters (30 µm) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| Shaking water bath | GFL | 1083 | |
| Silicon plate | RubberBV | 3530 | Dissection board |
| Software and packages | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| R programming | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #007576 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Code for the data analysis | |||
| https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE |
References
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