Summary
Этот протокол описывает подробную, низковходную пробоподготовку для секвенирования с одним ядром, включая рассечение верхних цервикальных и звездчатых ганглиев мыши, диссоциацию клеток, криоконсервацию, выделение ядра и штрих-кодирование хэштегов.
Abstract
Сердечная вегетативная нервная система имеет решающее значение для контроля сердечной функции, такой как частота сердечных сокращений и сократимость сердца, и делится на симпатическую и парасимпатическую ветви. Как правило, существует баланс между этими двумя ветвями для поддержания гомеостаза. Однако состояния сердечных заболеваний, такие как инфаркт миокарда, сердечная недостаточность и гипертония, могут вызывать ремоделирование клеток, участвующих в сердечной иннервации, что связано с неблагоприятным клиническим исходом.
Хотя существует огромное количество данных о гистологической структуре и функции сердечной вегетативной нервной системы, ее молекулярно-биологическая архитектура в здоровье и болезнях все еще загадочна во многих аспектах. Новые технологии, такие как секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq), обещают генетическую характеристику тканей с одноклеточным разрешением. Однако относительно большой размер нейронов может препятствовать стандартизированному использованию этих методов. Здесь этот протокол использует секвенирование одноядерной РНК на основе капель (snRNA-seq), метод характеристики биологической архитектуры сердечных симпатических нейронов в здоровье и болезни. Продемонстрирован поэтапный подход для выполнения snRNA-seq двустороннего верхнего шейного (SCG) и звездчатого ганглия (StG), рассеченных у взрослых мышей.
Этот метод обеспечивает долгосрочное сохранение образцов, поддерживая адекватное качество РНК, когда образцы от нескольких людей / экспериментов не могут быть собраны все сразу в течение короткого периода времени. Штрих-кодирование ядер с помощью хэштегов oligos (HTO) позволяет демультиплексировать и отслеживать отдельные ганглионные образцы после секвенирования. Последующие анализы выявили успешный захват ядер нейрональных, спутниковых глиальных и эндотелиальных клеток симпатических ганглиев, что подтверждается snRNA-seq. Таким образом, этот протокол обеспечивает поэтапный подход к snRNA-seq симпатических внешних сердечных ганглиев, метод, который имеет потенциал для более широкого применения в исследованиях иннервации других органов и тканей.
Introduction
Вегетативная нервная система (ВНС) является важнейшей частью периферической нервной системы, которая поддерживает гомеостаз организма, включая адаптацию к условиям окружающей среды и патологии1. Он участвует в регуляции нескольких систем органов по всему телу, таких как сердечно-сосудистая, дыхательная, пищеварительная и эндокринная системы. ВНС делится на симпатическую и парасимпатическую ветви. Спинномозговые ветви симпатической нервной системы синапс в ганглиях симпатической цепи, расположенные двусторонне в паравертебральном положении. Двусторонние шейные и грудные ганглии, особенно StG, являются важными компонентами, участвующими в сердечной симпатической иннервации. При болезненных состояниях, таких как ишемия сердца, может произойти ремоделирование нейронов, что приводит к симпатическому овердрайву2. Ремоделирование нейронов было продемонстрировано в нескольких гистологических исследованиях на людях и нескольких других видах животных 3,4,5,6. Подробная биологическая характеристика ремоделирования нейронов, вызванного ишемией сердца, в сердечных симпатических ганглиях в настоящее время отсутствует, а фундаментальные биологические характеристики специализированных типов нейрональных клеток или подтипов в сердечной симпатической нервной системе (SNS) еще не полностью определены при здоровье и заболевании7.
Новые технологии, такие как scRNA-seq, открыли шлюзы для генетической характеристики мелких тканей на одноклеточном уровне 8,9. Однако относительно большой размер нейронов может препятствовать оптимизированному использованию этих одноклеточных методов у людей10. Кроме того, секвенирование одной клетки требует высокой пропускной способности клеток для восстановления достаточного количества клеток из-за высоких потерь в процессе секвенирования. Это может оказаться сложной задачей при изучении небольших тканей, которые трудно захватить за один сеанс и требуют нескольких образцов для введения достаточного количества одиночных клеток для секвенирования. Недавно разработанная технология snRNA-seq на основе капель (то есть платформа 10x Chromium) позволяет изучать биологические различия между одиночными ядрами11,12. snRNA-seq имеет преимущество перед scRNA-seq для крупных клеток (>30 мкм), которые не могут быть захвачены в Gel Bead in Emulsions (GEMs), а также улучшенную совместимость с обширной диссоциацией и/или длительным сохранением 13,14,15.
Гетерогенность, количество нейрональных клеток и других клеток, обогащенных сердечными СНС, являются важными аспектами для характеристики ВНС в состояниях здоровья и заболевания. Кроме того, органная или региональная иннервация каждым симпатическим ганглием способствует усложнению СНС. Кроме того, было показано, что шейные, звездчатые и грудные ганглии симпатической цепи иннервируют различные области сердца16. Поэтому необходимо выполнить одноядерный анализ ганглионарных клеток, полученных из отдельных ганглиев, для изучения их биологической архитектуры.
SnRNA-seq на основе капель позволяет профилировать экспрессию транскриптома для пула из тысяч клеток из нескольких образцов одновременно с более низкими затратами, чем платформы секвенирования на основе пластин. Этот подход позволяет snRNA-seq на основе капель быть более подходящим для классификации клеточного фенотипа и новой субпопуляционной идентификации клеток в SCG и StG. Примечательно, что этот протокол обеспечивает краткий поэтапный подход к идентификации, выделению и секвенированию одноядерной РНК симпатических внешних сердечных ганглиев, метод, который имеет потенциал для широкого применения в исследованиях характеристик ганглиев, иннервирующих другие связанные органы и ткани в здоровье и болезни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол описывает все этапы, необходимые для snRNA-seq цервикальных и/или шейно-цервикоторакальных (звездчатых) ганглиев. Использовались самки и самцы мышей C57BL/6J (15 недель, n = 2 для каждого пола). Одна дополнительная мышь Wnt1-Cre;mT/mG была использована для визуализации ганглиев в целях рассечения17,18. Эта дополнительная мышь была получена путем скрещивания мыши B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J и мыши B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J мыши. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованным NIH и одобренным Комитетом по этике животных Лейденского университета (номер лицензии AVD1160020185325, Лейден, Нидерланды). Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, оборудовании, программном обеспечении и животных, используемых в протоколе.
1. Препараты
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы выполняются в шкафу для клеточного культивирования.
- Очистите щипцы и ножницы, погружая инструменты в 70% этанол на 20 минут.
- Приготовьте ганглиозную среду, состоящую из нейробазальной среды, дополненной B-27 плюс (1x), L-глютамином (2 мМ) и 1% антибиотиком-антимикотиком. Предгреть ганглиозную среду при комнатной температуре.
- Готовят раствор для пищеварения: 0,25% трипсин-ЭДТА (1:1) и 1 400 Ед/мл коллагеназы типа 2, растворенной в ганглиозной среде.
- Подготовьте свежий, холодный (4 °C) буфер промывки клеток (0,4% бычьего сывороточного альбумина [BSA]) и буфер лизиса (10 мМ Tris-HCl, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2 и 0,1% неионного моющего средства, 40 ЕД/мл РНКАзы в воде без нуклеазы) для выделения ядра.
- Приготовьте буфер промывки ядра (1x фосфатно-буферный физиологический раствор [PBS] с 2,0% BSA и ингибитором РНКазы 0,2U/μL).
- Готовят буфер окрашивания ST (ST-SB) (10 мМ Tris-HCl, 146 мМ NaCl, 21 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2, 2% BSA, 0,02% Tween-20 в воде без нуклеазы).
2. Рассечение верхних шейных ганглиев взрослой мыши (SCG)
- Усыплите мышей и держите их на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании в общей сложности 4 мыши C57BL6 / J были усыплены асфиксией CO2 . Альтернативно, изофлуран может быть использован с последующей экссангинацией, когда необходимо собрать большое количество крови для других целей исследования. - Закрепите мышь на рассеченной доске булавками и обливайте ее 70% этанолом, чтобы свести к минимуму диспергирование шерсти (бритье не требуется).
- Под стереомикроскопом откройте кожу области шеи, сделав ножницами разреза по средней линии, отодвиньте подчелюстные железы в сторону и удалите стерномастоидную мышцу, чтобы обнажить и найти общую сонную артерию и ее бифуркацию (рисунок 1A, B, см. стрелку).
- Рассекают бифуркацию правой и левой сонной артерии и прикрепленную к ней ткань. Переложите каждый рассеченный кусочек ткани в отдельную чашку Петри размером 3,5 см, содержащую холодный PBS.
- Ищите SCG, прикрепленный к бифуркации сонной артерии. Очистите SCG дальше, удалив артерию и другую прикрепленную ткань в чашке Петри (рисунок 1E).
3. Рассечение звездчатых ганглиев взрослых мышей (StG)
- Чтобы рассечь StG, сделайте средний разрез в брюшной полости с последующим открытием диафрагмы и вентральной грудной стенки.
- Удалите сердце и легкие, чтобы обнажить спинную грудную клетку. Ищите левый и правый StG anterolateral к musculus colli longus (MCL) на уровне первого ребра (рисунок 1C, D, обозначен пунктирными линиями).
- Рассекните как левый, так и правый StG щипцами и отдельно перенесите их на 3,5 см чашки Петри, содержащие холодный PBS (рисунок 1F).
4. Выделение и криоконсервация ганглионарных клеток мыши
Шаги 4-6 обобщены на рисунке 2.
- Аккуратно перенесите все отдельные SCG и StG в отдельные микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл с щипцами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте наконечники пипеток для переноса ганглиев, потому что ганглии склонны прилипать к стенке пластиковых наконечников пипеток. - Добавьте 500 мкл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в каждую микроцентрифужную трубку и инкубируйте на встряхивающей водяной бане при 37 °C в течение 40 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап направлен на облегчение пищеварения и высвобождения клеток в растворе коллагеназы типа 2. - Подготовьте пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл ганглиозной среды для каждого образца. Дайте ганглиям осесть на дне микроцентрифужных трубок. Соберите супернатант, который содержит очень мало ганглионарных клеток, перенесите супернатант в подготовленные 15 мл пробирки и пометьте каждую трубку. В качестве альтернативы, чтобы сэкономить некоторое время, аспирировать супернатант трипсина-ЭДТА без сбора, так как в нем может быть обнаружено очень мало диссоциированных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое количество раствора трипсина-ЭДТА (~10-30 мкл) можно оставить в микроцентрифужной трубке, чтобы избежать удаления ганглиев. Избегайте пипетирования на этом этапе, потому что это может повредить ганглии и привести к низкому выходу ганглионарных клеток впоследствии. - Добавьте 500 мкл раствора коллагеназы типа 2 в каждую микроцентрифужную трубку и вылейте на встряхивающей водяной бане при 37 °C в течение 35-40 мин. Попробуйте повторно суспендировать ганглий через 35 мин; если ганглий еще неповрежден и не диссоциирует, при необходимости продлевают время инкубации или увеличивают концентрацию раствора коллагеназы 2 типа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может варьироваться в зависимости от размера ганглия. - Повторное суспендирование ганглиев в растворе коллагеназы путем пипетки вверх и вниз ~ 10 раз или до тех пор, пока сгустки тканей больше не обнаруживаются.
- Перенесите клеточную суспензию в ранее использованную трубку объемом 15 мл, которая содержит глоглиевую культуральную среду и суспензию трипсина-ЭДТА из того же ганглия. Открутите клеточную суспензию с помощью центрифуги ротора качающегося ковша в течение 10 мин, 300 × г при комнатной температуре. Осторожно выбросьте супернатант клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку ганглионарные клетки диссоциированы от одного ганглия, клеточная гранула может быть слишком маленькой, чтобы ее можно было обнаружить на глаз; небольшое количество супернатанта можно оставить в трубке, чтобы избежать случайного удаления гранулы клетки. - Повторно суспендируют ганглионарные клетки в 270 мкл фетальной бычьей сыворотки (FBS, низкий эндотоксин) и переносят каждую клеточную суспензию FBS в криовиал 1 мл.
- Чтобы подсчитать клетки, смешайте 5 мкл суспензии ганглионных клеток с 5 мкл 0,4% красителя трипанового синего цвета и загрузите смесь в гемоцитометр. Подсчитайте общее количество и количество живых клеток под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток (количество живых клеток / общее количество клеток = жизнеспособность %) обычно превышает 90% с этим протоколом диссоциации. Количество живых клеток одного ганглия (SCG или StG) обычно находится в диапазоне 9000-60 000 клеток, когда ганглий изолирован от мыши в возрасте от 12 до 16 недель. - Добавьте 30 мкл диметилсульфоксида (DMSO) к каждой клеточной суспензии FBS в криовиалах, хорошо перемешайте и перенесите криовиалы в контейнер для замораживания клеток, который хранится при комнатной температуре. Храните криовиальный загруженный контейнер при -80 °C в течение ночи и перенесите криовиалы в жидкий азот на следующий день для длительного хранения перед секвенированием.
5. Изоляция ядра
ПРИМЕЧАНИЕ: Левый и правый SCG, выделенные из четырех мышей (в общей сложности 8 образцов), были использованы в качестве примера в следующей подготовке к выделению ядра и секвенированию. Держите все на льду в течение всей процедуры. Из-за невидимости мелких гранул ядра настоятельно рекомендуется центрифуга с качающимися ведрами для облегчения удаления супернатанта на протяжении всей процедуры.
- Подготовьте 15 мл пробирок с сетчатым фильтром (30 мкм) сверху и предварительно промыть ситечко 1 мл ганглиозной среды.
- Извлеките криовиалы из жидкого азота и немедленно разморозьте их на водяной бане при 37 °C. Когда небольшая гранула льда останется в криовиале, выньте криовиалы из водяной бани.
- Восстановите ганглионарные клетки, опустив 1 мл ганглиозной среды в каждый криовиал, осторожно встряхиваясь вручную. Необязательно: Для оценки восстановления клеток смешайте клеточную суспензию после восстановления и возьмите 5 мкл клеточной суспензии для подсчета живых клеток, как описано на этапе 4.8.
- Загрузите каждую суспензию ганглионных клеток на отдельное ситечко (подготовленное на этапе 5.1) и промойте каждый сетчатый фильтр 4-5 мл ганглионной среды.
- Центрифугируют суспензию процеженных клеток в течение 5 мин при 300 × г, осторожно удаляют надосадочный агент и повторно суспендируют клетки в 50 мкл буфера промывки клеток.
- Переведите клеточную суспензию в низкосвязанную трубку ДНК/РНК 0,5 мл микроцентрифуги.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин при 4 °С.
- Удалите 45 мкл супернатанта, не касаясь нижней части трубки, чтобы избежать смещения гранулы клетки.
- Добавьте 45 мкл охлажденного лизисного буфера и аккуратно пипетку вверх и вниз, используя наконечник пипетки объемом 200 мкл.
- Инкубировать клетки в течение 8 мин на льду.
- Добавьте 50 мкл буфера промывки холодного ядра в каждую трубку. Не перемешивать.
- Центрифугируют суспензию ядра при 600 × г в течение 5 мин при 4 °С.
- Удалите 95 мкл супернатанта, не нарушая гранулу ядра.
- Добавьте 45 мкл охлажденного буфера промывки ядра в гранулу. Необязательно: Возьмите 5 мкл суспензии ядра, смешайте с 5 мкл 0,4% трипан-синего цвета для подсчета и проверьте качество ядер под микроскопом с помощью гемоцитометра.
- Центрифугируют суспензию ядра при 600 × г в течение 5 мин при 4 °С.
- Удалите супернатант, не касаясь нижней части трубки, чтобы избежать смещения гранулы ядра.
6. Штрих-кодирование ядра с хэштегом oligos (HTO) и мультиплексирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы окрашивания HTO были модифицированы и оптимизированы для ядерной маркировки очень низких количеств (ганглионарных) ядер в соответствии с предыдущим применением в кортикальной ткани Gaublomme et al.15.
- Добавьте 50 мкл буфера ST-SB к грануле ядра, осторожно пипетку 8-10 раз, пока ядра не будут полностью повторно суспендированы.
- Добавьте 5 мкл fc-блокирующего реагента на 50 мкл смеси ST-SB/ядра и инкубируйте в течение 10 мин на льду.
- Добавьте 1 мкл (0,5 мкг) одноядерного хэштег-антитела на пробирку смеси ST-SB/ядер и инкубируйте в течение 30 мин на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более короткое время инкубации приводит к снижению эффективности маркировки хэштегов, как показано в репрезентативных результатах. - Добавьте 100 мкл ST-SB в каждую пробирку. Не перемешивать.
- Центрифугируют суспензию ядра в течение 5 мин, 600 × г при 4 °С.
- Удалите 145 мкл супернатанта, не нарушая гранулу ядра.
- Повторите шаги 6.4 и 6.5. Удалите супернатант как можно больше, не касаясь дна трубки, чтобы избежать смещения гранулы ядра.
- Повторно суспендируют гранулу ядра в 50 мкл ST-SB и аккуратно перемешивают ядра.
- Возьмите 5 мкл суспензии ядра и смешайте его с 5 мкл 0,4% трипан-синего цвета, чтобы подсчитать ядра под микроскопом. См. рисунок 3А для репрезентативного изображения ядер, смешанных с трипановым синим и загруженных в гемоцитометр.
- Центрифугируют суспензию ядра в течение 5 мин при 600 × г при 4 °С.
- Повторное суспендирование ядер в ST-SB для достижения целевой концентрации ядра 1000-3000 ядер/мкл для каждого образца в соответствии с соответствующим количеством ядер.
- Объедините образцы для достижения требуемого количества ячеек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, в этом эксперименте 8 образцов были одинаково объединены для достижения в общей сложности 25 000 ядер, чтобы немедленно перейти к 10-кратному геномике хрома и snRNA-seq после этого. Количество ядер обычно находится в пределах 6000-40000 клеток, когда ганглий изолирован от мыши в возрасте от 12 до 16 недель. Только около половины от общего количества нагруженных ядер может быть захвачено snRNA-seq на основе капель. Например, смесь из 25 000 ядер была подготовлена для обеспечения захвата 10 000 ядер, что необходимо для дальнейшей подготовки библиотеки и секвенирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ контроля качества подготовки библиотеки одноядерных кДНК и snRNA-seq
Репрезентативные результаты описывают результаты секвенирования 10 000 захваченных ядер в одном пуле с библиотекой 25 000 считываний / экспрессии генов ядра и библиотекой хэштегов 5000 чтений / ядра. Рисунок 3B иллюстрирует результаты контроля качества1-й цепи кДНК, библиотеки экспрессии генов (GEX) и библиотеки HTO, которые были проверены с помощью биоанализатора. Ожидается, что кДНА, полученные из ХТО, будут меньше 180 bp, тогда как кДНА, полученные из мРНК, больше 300 bp. Высококачественная библиотека GEX может быть обнаружена как широкий пик от 300 до 1000 bp, а библиотека HTO определяется как определенный пик 194 bp. Cell Ranger использовался для демультиплексирования, генерации файлов fastq и выравнивания чтения по умолчанию. Пакет Seurat R19 впоследствии использовался для контроля качества и последующего анализа.
Демультиплексирование данных snRNA-seq выполнялось путем идентификации HTO с использованием встроенной стратегии демультиплексирования Seurat. Возможность демультиплексирования для каждого HTO была впервые визуализирована с помощью файлов выражений HTO (дополнительный рисунок S1). На тепловой карте рисунка 4A синглеты обнаруживаются как ядра со специфической экспрессией HTO, в то время как дублеты и негативы показывают неспецифическую экспрессию множественных или отсутствующих HTO. Следует отметить, что примерно 33% ядер были обнаружены как отрицательные с использованием 10-минутного подхода инкубации антител к HTO. Продление времени инкубации (стадия 6.3) с 10 мин до 30 мин в последующем эксперименте выявило заметное уменьшение отрицательно меченых ядер (дополнительный рисунок S2). Эти результаты показывают, что продление времени инкубации антител может повысить эффективность хэштегов.
Скрипичные графики на рисунке 4B-D демонстрируют количество генов (nFeature_RNA), количество уникальных молекулярных идентификаторов (UMI) (nCount_RNA) и процент митохондриальных количеств (percent.mt) в наборе данных snRNA-seq для идентификации выбросов и низкокачественных ядер. Ядра были включены в последующий анализ только при соблюдении следующих критериев: i) nFeature_RNA > 500 и nCount_RNA < 20 000; ii) percent.mt < 5%; iii) индивидуальное ядро показало четкое выражение одного ХТО. Количество экспрессии генов было нормализовано с использованием метода по умолчанию в Seurat: 875 (2,71%) генов были обнаружены как высоковариабельные гены (рисунок 4E). snRNA-seq GEX масштабировали, выполняли и использовали локтевой график для оценки включения основных компонентов, которые будут использоваться для последующего анализа (рисунок 4F). Всего было включено 18 ПК. Кластеризация выполнялась с разрешением 0,4.
Ядра были сгруппированы, и уменьшение размерности (UMAP) было выполнено для визуализации 12 отдельных кластеров (рисунок 5A). Медианное количество необработанных генов на кластер варьируется от 991,5 до 4 586 (дополнительный рисунок S3A, B). Визуализация деления антител HTO внутри UMAP показывает четкое распределение ганглиев, указывая на то, что все кластеры представлены в каждом ганглии (рисунок 5B). Чтобы проверить точность сегрегации образцов HTO, экспрессия X Inactive Specific Transcript (Xist, выраженная в неактивной женской X-хромосоме) была оценена для идентификации мужских образцов и женских образцов (рисунок 5C). Выражение Xist соответствовало маркировке хэштегов, показывая, что маркированные образцы HTO 1-4 были женскими образцами, а маркированные образцы HTO 5-8 были мужскими образцами. Это говорит о том, что кураторская маркировка HTO очень специфична.
Для дальнейшей проверки качества и разрешения данных секвенирования с помощью настоящего метода были сначала изучены некоторые ключевые транскрипты симпатических нейронов. Результаты показывают наличие симпатических нейронов, которые высоко экспрессируют Th, Dbh и Snap25 в кластерах 5 и 7 (рисунок 5D-F).. Спутниковые глиальные клетки были обнаружены с экспрессией S100b в кластерах 0-3 (рисунок 5G)20. Эндотелиальные клетки были обнаружены в кластере 4 с высокой экспрессией Pecam1 (рисунок 5H) и стромальные клетки в кластере 8 с высокой экспрессией Acta2 (рисунок 5I). Эти результаты подтверждают успешный захват ядер нейрональных, спутниковых глиальных, эндотелиальных и стромальных клеток симпатического ганглия с использованием snRNA-seq.
Рисунок 1: Рассечение взрослой мыши верхних шейных ганглиев и звездчатых ганглиев. (А) Брайтфилдское изображение местоположения SCG. (B) Для облегчения визуализации использовалась мышь Wnt1Cre;mT/mG. Звездочки указывают на SCG (eGFP+), наконечники стрелок указывают на бифуркацию сонной артерии. Левая панель, фазоконтрастное изображение; правая панель, флуоресцентное изображение. (C) Яркое изображение местоположения StG. (D) Звездочки указывают на StG (eGFP+), пунктирные линии указывают на MCL. Левая панель, фазоконтрастное изображение; правая панель, флуоресцентное изображение. (E) Рассеченные ганглии переносят в чашку Петри отдельно для дальнейшей очистки под стереомикроскопом. (F) Левая панель, рассеченная SCG с прикрепленной сонной артерией. Пунктирная схема указывает на SCG. Правая панель, рассеченная и очищенная StG имеет форму перевернутого треугольника, о чем свидетельствует пунктирный контур. Шкала = 1 000 мкм. Сокращения: SCG = верхние шейные ганглии; StG = звездчатые ганглии; MCL = мускулус колли длинный; eGFP = улучшенный зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Рабочий процесс подготовки образцов и мультиплексирование на основе окрашивания хэштегов для snRNA-seq. Блок-схема изображает шаги от диссоциации ганглионарных клеток (оранжевый), выделения ядра (синий) и окрашивания и мультиплексирования антител с хэштегом (зеленый), которые проводятся для snRNA-seq. Сокращения: FBS = фетальная бычья сыворотка; ST-SB = буфер окрашивания ST; snRNA-seq = секвенирование одноядерной РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Контроль качества выделения ядра и подготовки библиотеки экспрессии генов. (A) Фазоконтрастное изображение Ядер, окрашенных HTO. Ядра обозначены стрелками. Шкала = 100 мкм. (B) Результаты биоанализатора1-й цепи кДНК (вверху), библиотеки GEX (средняя) и библиотеки HTO (внизу). Сокращения: GEX = экспрессия генов; HTO = хэштег олиго. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Контроль качества эффективности маркировки олиго с хэштегом и контроль качества snRNA-seq. (A) Тепловая карта окрашивания HTO достигается с инкубационным временем 10 мин с хэштеговыми антителами. (Б-Д) Скрипичные графики метрик контроля качества, отражающие количество генов (nFeature_RNA, B); число UMI (nCount_RNA, C); процент митохондриальных количеств (percent.mt, D). (E) Из 32 285 секвенированных генов 875 (2,71%) были идентифицированы как сильно изменчивые признаки, визуализированные на диаграмме рассеяния. (F) Локтевой график ПК для определения включения истинного сигнала, используемого для кластеризации. Сокращения: snRNA-seq = секвенирование одноядерной РНК; HTO = хэштег oligo; ПК = основные компоненты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативные результаты анализа snRNA-seq. (A) UMAP графика кластеризованного набора данных snRNA-seq. (B) График UMAP, визуализирующий распределение объединенных образцов HTO. (C) Скрипичный график, подтверждающий женские сэмплы (высокая экспрессия Xist) после демультиплексирования. (Д-И) Графики UMAP, отображающие выбранные маркерные гены; кластеры высоко экспрессируют соответствующие гены, которые указаны в красных кругах: D-F, симпатические нейроны (Th, Dbh, Snap25); G) спутниковые глиальные ячейки (S100b); H) эндотелиальные клетки (Pecam1); I) Стромальные клетки (Acta2). Сокращения: snRNA-seq = секвенирование одноядерной РНК; HTO = хэштег oligo; UMAP = равномерное многообразное приближение и проекция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Показатели контроля качества репрезентативного результата секвенирования с одним ядром. Профили экспрессии HTO отдельных образцов, визуализирующие демультиплексирующую способность используемых антител с хэштегом. Аббревиатура: HTO = хэштег oligo. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Тепловая карта экспрессии HTO последующих образцов, инкубированных с антителами HTO в течение 30 мин. Сравнение числа отрицательно меченых ядер после демультиплексирования ГТО с фиг.4А показывает заметное улучшение маркировки ядра после продления времени инкубации антител. Аббревиатура: HTO = хэштег oligo. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S3: Медиана и квантили экспрессии генов на кластер. (A) Медианная ненулевая экспрессия необработанных генов каждого кластера. (B) Описательная статистика ненулевой экспрессии необработанных генов каждого кластера. Q1:25-й процентиль, Q3:75-й процентиль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь описан подробный протокол, который фокусируется на i) рассечении верхних шейных и звездчатых симпатических ганглиев взрослой мыши, ii) изоляции и криоконсервации ганглионарных клеток, iii) выделении ядра и iv) штрих-кодировании ядра с маркировкой HTO для целей мультиплексирования и snRNA-seq.
С помощью этого протокола симпатические ганглионарные клетки могут быть легко получены путем диссоциации отдельных ганглиев с использованием обычно используемых трипсина и коллагеназы. Длительное сохранение изолированных ганглионарных клеток также легко достигается замораживанием клеток в FBS, дополненных 10% DMSO, что показало высокое качество восстановления после оттаивания. Более того, по сравнению с обычным секвенированием одноклеточной РНК, использование snRNA-seq на основе капельной snRNA-seq одиночных мышиных симпатических ганглиев в сочетании с применением штрих-кодирования ядра на основе окрашивания HTO имеет следующие преимущества: i) образцы могут сохраняться в течение длительного времени, пока все образцы не будут готовы к дальнейшей изоляции ядра; ii) ядра хорошего качества, выделенные из нескольких малоразмерных ганглиев, могут быть объединены вместе для секвенирования без периодического эффекта, вызванного раздельной пробоподготовкой; iii) способность прослеживать отчетливое ганглионное происхождение после секвенирования с помощью штрих-кодов ядра; и iv) эффективность с точки зрения затрат, поскольку требуется только единая подготовка библиотеки. Важно отметить, что описанный протокол выделения и культивирования клеток обеспечивает единый метод как для цервикальных, так и для звездчатых ганглиев и потенциально применим к другим ганглиям, таким как дорсальные корневые ганглии и другие виды, например, ганглии человека.
Одним из основных преимуществ scRNA-seq является способность идентифицировать (новые) типы клеток и выявлять редкие клеточные популяции, которые не могут быть обнаружены объемной РНК-seq. Платформа scRNA-seq на основе капель облегчает захват большего количества клеток. Таким образом, он может обеспечить совокупное представление о типах клеток (под)и транскрипционной гетерогенности большой клеточной популяции по сравнению с платформой секвенирования на основе пластин. Однако платформа на основе капель (например, 10x Chromium) не подходит для клеток размером более 50 мкм, что ограничивает ее применение в крупных клетках, таких как нейроны человека (~ 100 мкм). Наличие метода snRNA-seq преодолевает этот недостаток из-за небольшого размера ядра. Кроме того, snRNA-seq является полезным методом для исследований экспрессии генов высоко взаимосвязанных и низкопродуктивных клеток, таких как нейроны и замороженные ткани.
Хотя можно напрямую изолировать ядра из тканей без предварительной диссоциации клеток, для выхода было полезно использовать двухэтапный метод изоляции ядра, который сначала диссоциирует ганглий на отдельные клетки (которые могут быть сохранены в жидком азоте), а затем изоляция ядра. Из-за небольшого размера мышиного симпатического ганглия было обнаружено, что с использованием двухэтапного метода изоляции ядра было получено больше ядер, чем при одношаговом подходе изоляции ядра. Проверка качества анализа кДНК, библиотеки и секвенирования указывает на хорошее качество ядер/РНК. Кроме того, улучшается логистика, поскольку образцы могут собираться и храниться в разные моменты времени перед коллективной последовательностью. Анализ с одним ядром также выявил успешное восстановление и захват нейронов и глиальных клеток, предполагая, что описанный двухэтапный подход к изоляции ядра может лучше подходить для применения в небольших тканях.
Еще одним преимуществом этого протокола является мультиплексирование со штрих-кодированными антителами21. Мышиный симпатический ганглий представляет собой крошечную ткань (средний размер 0,1 мм 3), и низкое количество клеток, полученных из отдельногоганглия, недостаточно для секвенирования на основе капель само по себе. Однако объединение нескольких ганглиев разных мышей или разных ганглиев одной и той же мыши приведет к потере либо индивидуальной информации о мыши, либо об отдельных ганглиях. В качестве решения этап окрашивания HTO прост в выполнении и позволяет штрих-кодировать маркировку ядер, полученных от разных мышей или разных ганглиев, перед объединением ядра. Точность демультиплексирования HTO проверяется в этом протоколе соответствующей экспрессией Xist в известных популяциях женских ядер. Таким образом, мультиплексирование ядра со штрих-кодированными антителами снижает эффекты партии и снижает стоимость секвенирования.
Потенциальное ограничение snRNAseq может заключаться в том, что могут быть различия между составом РНК в ядре и цитоплазме из-за естественного присутствия зарождающихся транскриптов в ядре, связанных с ранним ответом на нейронную активность22,23. Ядро и цитоплазма также могут отличаться по транскриптам в зависимости от состояния клеточного цикла24. В отдельном ядре было обнаружено меньше транскриптов (~7000 генов), чем в клетке (~11 000 генов)14. Поэтому scRNA-seq и snRNA-seq могут давать разные результаты на уровне транскрипта. Тем не менее, сравнение между scRNA-seq и snRNA-seq продемонстрировало аналогичную способность различать типы нейронных клеток ткани мозга14. Чтобы улучшить различение между очень похожими типами клеток или подтипами по snRNA-seq, может потребоваться больше ядер, чтобы компенсировать более низкую способность обнаружения генов по сравнению со scRNA-seq. Кроме того, хотя точность демультиплексирования HTO достаточна, потеря некоторых данных неизбежна, поскольку не все ядра демонстрируют специфичность HTO. Дальнейшая оптимизация инкубации антител может минимизировать количество ядер с двойной или отрицательной экспрессией HTO.
Взятый вместе, этот протокол обеспечивает экспериментальную процедуру секвенирования нейронных ядер из симпатических ганглиев с помощью простого в использовании рабочего процесса, начиная от выделения ганглия до подготовки ядер с низким входом клеток, с последующей маркировкой ядра на основе окрашивания HTO для snRNA-seq. Протокол предоставляет подробный обзор всех ключевых шагов, которые могут быть легко выполнены и применены к различным ганглиям у мышей и других видов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Мы благодарим Сьюзан Л. Клоэт (Департамент генетики человека, LUMC, Лейден, Нидерланды) за ее помощь в экспериментальном проектировании и полезных дискуссиях. Мы благодарим Emile J. de Meijer (Департамент генетики человека, LUMC, Лейден, Нидерланды) за помощь в выделении одноядерной РНК и подготовке библиотеки к секвенированию. Эта работа поддерживается Нидерландской организацией научных исследований (NWO) [016.196.346 to M.R.M.J.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and reagents | |||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 0.4% trypan blue dye | Bio-Rad | 1450021 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004176 | use 1,400 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 67685 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| Fetal bovine serum (low endotoxin) | Biowest | S1810-500 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Cell wash buffer |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Cell wash buffer |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Nucleus Lysis buffer |
| Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent) | Sigma-Aldrich | 74385 | Nucleus Lysis buffer |
| Nuclease free water (not DEPC-treated) | Invitrogen | AM9937 | Nucleus Lysis buffer |
| Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus Lysis buffer |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | Nucleus Lysis buffer |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | Nucleus Lysis buffer |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Nucleus wash |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Nucleus wash |
| Protector RNase Inhibitor,40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus wash |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Calcium chloride solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Nuclease free water (not DEPC treated) | Invitrogen | AM9937 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Sodium Chloride Solution, 5M | Sigma-Aldrich | 59222C | ST staining buffer (ST-SB) |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST staining buffer (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody | Biolegend | 682205 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody | Biolegend | 682207 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody | Biolegend | 682209 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody | Biolegend | 682225 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody | Biolegend | 682227 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody | Biolegend | 682229 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody | Biolegend | 682231 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody | Biolegend | 682233 | Hashtag antibody |
| TruStain FcX (human) | Biolegend | 422302 | FC receptor blocking solution |
| Equipment and consumables | |||
| Bright-Line Hemacytometer | Merck | Z359629-1EA | |
| Centrifuge 5702/R A-4-38 | Eppendorf | EP022629905 | |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | EP0030108035-250EA | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish | Corning | 351008 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 10773501 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine science tools | 11252-40 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine science tools | 14091-09 | |
| Ice Pan, rectangular 4 L Orange | Corning | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Leica | Microscope | |
| Moria MC50 Scissors | Fine science tools | 15370-50 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine science tools | 15012-12 | |
| Olympus CK2 ULWCD | Olympus | Microscope | |
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| Preseparation Filters (30 µm) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| Shaking water bath | GFL | 1083 | |
| Silicon plate | RubberBV | 3530 | Dissection board |
| Software and packages | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| R programming | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #007576 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Code for the data analysis | |||
| https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE |
References
- McCorry, L. K.
- Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Cardiology Research and Practice. 2015, 698368 (2015).
- Ajijola, O. A., et al. Extracardiac neural remodeling in humans with cardiomyopathy. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 5 (5), 1010 (2012).
- Nguyen, B. L., et al. Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 143-148 (2012).
- Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
- Han, S., et al. Electroanatomic remodeling of the left stellate ganglion after myocardial infarction. Journals of the American College of Cardiology. 59 (10), 954-961 (2012).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Svensson, V., Vento-Tormo, R., Teichmann, S. A. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nature Protocols. 13 (4), 599-604 (2018).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
- Kokubun, S., et al. Distribution of TRPV1 and TRPV2 in the human stellate ganglion and spinal cord. Neuroscience Letters. 590, 6-11 (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communication. 10 (1), 2832 (2019).
- Petrany, M. J., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers. Nature Communication. 11 (1), 6374 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648 (2018).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
- Zandstra, T. E., et al. Asymmetry and heterogeneity: part and parcel in cardiac autonomic innervation and function. Frontiers in Physiology. 12, 665298 (2021).
- Lewis, A. E., Vasudevan, H. N., O'Neill, A. K., Soriano, P., Bush, J. O. The widely used Wnt1-Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling. Developmental Biology. 379 (2), 229-234 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. bioRxiv. , (2018).
- Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 11022 (2016).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
- Grindberg, R. V., et al.
