Summary
이 프로토콜은 우수한 자궁경부 및 성상 신경절, 세포 해리, 동결보존, 핵 분리 및 해시태그 바코딩을 포함하는 단일 핵 시퀀싱을 위한 상세하고 낮은 입력 샘플 준비를 설명합니다.
Abstract
심장 자율 신경계는 심박수 및 심장 수축과 같은 심장 기능을 제어하는 데 중요하며 교감 신경과 부교감 신경 가지로 나뉩니다. 일반적으로 항상성을 유지하기 위해이 두 가지 사이에는 균형이 있습니다. 그러나 심근 경색, 심부전 및 고혈압과 같은 심장 질환 상태는 불리한 임상 결과와 관련된 심장 신경 과민에 관여하는 세포의 리모델링을 유도 할 수 있습니다.
심장 자율 신경계의 조직 학적 구조와 기능에 대한 방대한 양의 데이터가 있지만, 건강과 질병에서의 분자 생물학적 구조는 여전히 많은 측면에서 수수께끼입니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱 (scRNA-seq)과 같은 새로운 기술은 단일 세포 분해능에서 조직의 유전 적 특성화에 대한 약속을 지닙니다. 그러나, 상대적으로 큰 크기의 뉴런은 이들 기술의 표준화된 사용을 방해할 수 있다. 여기서, 이 프로토콜은 건강 및 질병에서 심장 교감 신경세포의 생물학적 구조를 특성화하는 방법인 액적 기반 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq)을 이용한다. 단계적 접근법이 성인 마우스로부터 해부된 양측 우월한 자궁경부(SCG) 및 성상 신경절(StG)의 snRNA-seq를 수행하는 것으로 입증된다.
이 방법은 장기간 시료 보존을 가능하게 하여 단기간 내에 여러 개인/실험의 샘플을 한꺼번에 수집할 수 없을 때 적절한 RNA 품질을 유지합니다. 해시태그 올리고(HTO)로 핵을 바코딩하면 역다중화 및 시퀀싱 후 별개의 신경절 샘플의 추적이 가능합니다. 후속 분석은 snRNA-seq에 의해 검증 된 교감 신경절의 신경, 위성 신경교 및 내피 세포의 성공적인 핵 포획을 밝혀 냈습니다. 요약하면, 이 프로토콜은 교감신경성 외인성 심장 신경절의 snRNA-seq 에 대한 단계적 접근법을 제공하며, 이는 다른 기관 및 조직의 신경과민에 대한 연구에서 보다 광범위하게 응용될 수 있는 잠재력을 갖는 방법이다.
Introduction
자율 신경계 (ANS)는 환경 조건 및 병리학에 대한 적응을 포함하여 신체 항상성을 유지하는 말초 신경계의 중요한 부분입니다1. 그것은 심혈관, 호흡기, 소화 및 내분비 시스템과 같은 신체 전체의 여러 장기 시스템의 조절에 관여합니다. ANS는 교감 신경과 부교감 신경으로 나뉩니다. 교감 신경계의 척추 분지는 교감 신경절의 신경절에서 시냅스, 부추 동맥 위치에 양측으로 위치. 양측 자궁 경부 및 흉부 신경절, 특히 StG는 심장 교감 신경에 참여하는 중요한 구성 요소입니다. 심장 허혈과 같은 질병 상태에서, 뉴런 리모델링이 발생할 수 있고, 교감신경성 과잉구동(sympathetic overdrive)을 초래한다2. 뉴런 리모델링은 인간 및 몇몇 다른 동물 종 3,4,5,6에서 다수의 조직학적 연구에서 입증되었다. 심장 교감신경절에서 심장 허혈 유발 뉴런 리모델링의 상세한 생물학적 특성화는 현재 결여되어 있으며, 심장 교감신경계(SNS) 내의 특수화된 뉴런 세포 유형 또는 아형의 근본적인 생물학적 특성은 건강 및 질환에서 아직 완전히 결정되지 않았다7.
scRNA-seq와 같은 새로운 기술은 단일 세포 수준 8,9에서 작은 조직의 유전 적 특성화를위한 게이트웨이를 열었습니다. 그러나, 비교적 큰 크기의 뉴런은 인간(10)에서 이러한 단세포 기술의 최적화된 사용을 방해할 수 있다. 또한, 단일 세포 시퀀싱은 시퀀싱 과정에서 높은 손실로 인해 충분한 세포 수를 회수하기 위해 높은 처리량의 세포를 필요로 한다. 이것은 한 세션에서 포착하기 어렵고 시퀀싱을 위해 충분한 단일 세포를 도입하기 위해 여러 샘플이 필요한 작은 조직을 연구 할 때 어려울 수 있습니다. 최근에 개발된 액적 기반 snRNA-seq 기술(즉, 10x 크롬 플랫폼)은 단일 핵11,12 사이의 생물학적 차이에 대한 연구를 가능하게 한다. snRNA-seq 는 에멀젼 (GEMs)의 겔 비드에서 포획되지 않을 수 있는 큰 세포 (>30 μm)에 대한 scRNA-seq 보다 유리할 뿐만 아니라 광범위한 해리 및/또는 연장된 보존과의 향상된 상용성13,14,15를 보유한다.
이질성, 신경 세포의 수, 및 심장 SNS에 풍부해진 다른 세포는 건강 및 질병 상태에서 ANS의 특성화를 위한 중요한 측면이다. 또한, 각 교감신경절에 의한 기관 또는 부위별 신경과민은 SNS의 복잡성에 기여한다. 더욱이, 교감 신경계의 자궁 경부, 별자리 및 흉부 신경절은 심장의 다른 영역(16)을 신경질적으로 하는 것으로 나타났다. 따라서, 그들의 생물학적 구조를 연구하기 위해 개별 신경절로부터 유래된 신경절 세포의 단핵 분석을 수행할 필요가 있다.
액적-기반 snRNA-seq 는 플레이트 기반 시퀀싱 플랫폼보다 저렴한 비용으로 한 번에 여러 샘플로부터 수천 개의 세포 풀에 대한 전사체 전체 발현 프로파일링을 가능하게 한다. 이러한 접근법은 액적 기반 snRNA-seq 가 SCG 및 StG 내의 세포의 세포 표현형 분류 및 새로운 하위집단 확인에 더 적합할 수 있게 한다. 주목할 만하게, 이 프로토콜은 교감신경 외인성 심장 신경절의 식별, 분리 및 단핵 RNA 시퀀싱을 위한 간결한 단계적 접근법을 제공하며, 이는 다른 관련 기관 및 조직을 신경과민하는 신경절의 특성화에 대한 연구에서 광범위한 응용을 위한 잠재력을 갖는 방법이다. 건강과 질병.
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Protocol
이 프로토콜은 뮤린 자궁 경부 및 / 또는 자궁 경부 흉부 (스텔레이트) 신경절의 snRNA-seq에 필요한 모든 단계를 설명합니다. 암컷 및 수컷 C57BL/6J 마우스(15주령, 각 성별에 대해 n=2)를 사용하였다. 1개의 추가적인 Wnt1-Cre;mT/mG 마우스가 해부 목적을 위해 신경절을 시각화하는데 사용되었다(17,18). 이 추가 마우스는 B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J 마우스와 B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J 마우스의 교배에 의해 생성되었다. 모든 동물 실험은 NIH가 발표하고 라이덴 대학의 동물 윤리위원회 (라이센스 번호 AVD1160020185325, Leiden, 네덜란드)의 승인을 받아 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었습니다. 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 장비, 소프트웨어 및 동물에 대한 자세한 내용은 자료표를 참조하십시오.
1. 준비
주: 모든 단계는 세포 배양 흐름 캐비닛에서 수행됩니다.
- 기구를 70% 에탄올에 20분 동안 담가 포셉과 가위를 청소합니다.
- B-27 plus (1x), L-glutamine (2 mM) 및 1 % 항생제 - Antimycotic으로 보충 된 Neurobasal Medium으로 구성된 신경절 배지를 준비하십시오. 실온에서 신경절 배지를 미리 따뜻하게하십시오.
- 소화액을 준비하십시오: 신경절 배지에 용해된 0.25% 트립신-EDTA(1:1) 및 1,400 U/mL 콜라게나제 타입 2.
- 핵 분리를 위해 신선하고 차가운 (4°C) 세포 세척 완충액 (0.4% 소 혈청 알부민 [BSA]) 및 용해 완충액 (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl2, 3 mMMgCl2 및 0.1% 비이온성 세제, 뉴클레아제가 없는 물에서 40 U/mL RNAse)을 준비한다.
- 핵 세척 완충액(2.0% BSA 및 0.2U/μL RNase 억제제가 있는 1x 인산염 완충 식염수[PBS])을 준비합니다.
- ST 염색 완충액 (ST-SB) (뉴클레아제 비함유 물에서 10 mM 트리스-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl2, 1 mMCaCl2, 2% BSA, 0.02% 트윈-20)을 제조하였다.
2. 성인 마우스 우수한 자궁 경부 신경절 (SCG)의 해부
- 생쥐를 안락사시키고 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 현재 연구에서, 총 4마리의 C57BL6/J 마우스가CO2 질식에 의해 안락사되었다. 대안으로, 이소플루란은 다른 연구 목적을 위해 다량의 혈액을 채취해야 할 때 삼출 후 사용될 수 있다. - 핀이있는 해부 보드에 마우스를 고정하고 모피의 분산을 최소화하기 위해 70 % 에탄올로 도사용하십시오 (면도는 필요하지 않음).
- 입체 현미경으로 가위로 중간 선을 자르고 턱밑 땀샘을 옆으로 움직여 목 부위의 피부를 열고 스테로이드 근육을 제거하여 일반적인 경동맥과 그 분기를 노출시키고 찾습니다 (그림 1A, B, 화살표 참조).
- 오른쪽과 왼쪽 경동맥 분기와 그것에 부착 된 조직을 해부하십시오. 해부된 각 조직 조각을 차가운 PBS를 함유하는 분리된 3.5 cm 페트리 접시에 옮긴다.
- 경동맥 분기에 부착된 SCG를 찾으십시오. SCG를 페트리 접시에서 동맥 및 다른 부착 조직을 제거하여 추가로 청소한다(도 1E).
3. 성인 마우스 별자리 신경절 (StG)의 해부
- StG를 해부하려면 복부에서 중간 선을 자른 다음 횡격막과 복부 흉부 벽을 엽니 다.
- 심장과 폐를 제거하여 등쪽 흉부를 노출시킵니다. 첫 번째 리브의 수준에서 근육 콜리 경도 (MCL)에 대한 왼쪽 및 오른쪽 StG 전측성을 찾습니다 (그림 1C, D, 파선으로 표시).
- 포셉으로 왼쪽 및 오른쪽 StG를 모두 해부하고 차가운 PBS가 들어 있는 3.5cm 페트리 접시에 별도로 옮깁니다(그림 1F).
4. 마우스 신경절 세포의 분리 및 냉동 보존
단계 4-6은 도 2에 요약되어 있다.
- 모든 개별 SCG 및 StG를 조심스럽게 옮겨 포셉으로 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브를 분리합니다.
참고 : 신경절이 플라스틱 피펫 팁의 벽에 부착되기 쉽기 때문에 피펫 팁을 사용하여 신경절을 옮기지 마십시오. - 500 μL의 0.25% 트립신-EDTA 용액을 각각의 미세원심분리 튜브에 첨가하고, 37°C의 진탕 수조에서 40분 동안 인큐베이션한다.
참고: 이 단계는 콜라게나제 타입 2 용액에서 이후 소화 및 세포 방출을 촉진하기 위한 것이다. - 각 샘플에 대해 5 mL의 신경절 배지를 함유하는 15 mL 튜브를 제조하였다. 신경절이 마이크로 원심 분리 튜브의 바닥에 정착하도록하십시오. 극소수의 신경절 이온성 세포를 포함하는 상청액을 수집하고, 상청액을 준비된 15 mL 튜브로 옮기고, 각 튜브에 라벨을 붙인다. 대안적으로, 약간의 시간을 절약하기 위해, 극소수의 해리된 세포가 그것에서 검출될 수 있기 때문에 트립신-EDTA 상청액을 수집하지 않고 흡인한다.
참고 : 신경절의 제거를 피하기 위해 소량의 트립신 - EDTA 용액 (~ 10-30 μL)을 마이크로 원심분리 튜브에 남겨 둘 수 있습니다. 이 단계에서 피펫팅은 신경절을 손상시키고 나중에 신경절 세포의 낮은 출력을 초래할 수 있기 때문에 피펫팅을 피하십시오. - 500 μL의 콜라게나제 타입 2 용액을 각각의 마이크로원심분리 튜브에 첨가하고, 35-40분 동안 37°C의 진탕 수조에서 인큐베이션한다. 35 분 후에 신경절을 다시 일시 중지하십시오. 신경절이 여전히 손상되지 않고 해리되지 않으면 배양 시간을 연장하거나 필요에 따라 콜라게나제 유형 2 용액의 농도를 증가시킵니다.
참고 : 잠복기 시간은 신경절 크기에 따라 달라질 수 있습니다. - 콜라게나제 용액에 신경절을 ~10회 위아래로 피펫팅하거나 조직 덩어리가 더 이상 검출되지 않을 때까지 재현탁시킨다.
- 세포 현탁액을 동일한 신경절로부터 신경절 배양 배지 및 트립신-EDTA 현탁액이 들어있는 이전에 사용된 15 mL 튜브로 옮긴다. 세포 현탁액을 스윙 버킷 로터 원심분리기로 10분 동안 스핀다운하고, 실온에서 300 × g 을 스핀다운한다. 세포 상층액을 조심스럽게 버리십시오.
참고 : 신경절 이온성 세포는 단일 신경절에서 해리되기 때문에 세포 펠릿이 너무 작아서 눈으로 감지 할 수 없습니다. 소량의 상층액은 세포 펠릿의 우발적 인 제거를 피하기 위해 튜브에 남아있을 수 있습니다. - 신경절이온성 세포를 270 μL의 소 태아 혈청 (FBS, 저 내독소)에 재현탁시키고, 각 세포-FBS 현탁액을 1 mL 동결 내로 옮긴다.
- 세포를 계수하기 위해, 5 μL의 신경절이온성 세포 현탁액을 5 μL의 0.4% 트리판 블루 염료와 혼합하고, 혼합물을 혈구측정기에 로딩한다. 현미경으로 전체 및 라이브 셀 수를 계산하십시오.
참고: 세포 생존력(살아있는 세포 수/총 세포 수 = 생존력%)은 일반적으로 이 해리 프로토콜에서 90% 이상입니다. 단일 신경절 (SCG 또는 StG)의 살아있는 세포 수는 신경절이 12 주에서 16 주 사이에 된 마우스에서 분리 될 때 일반적으로 9,000-60,000 세포 범위 내에 속합니다. - 30 μL의 디메틸설폭사이드(DMSO)를 각각의 세포-FBS 현탁액에 첨가하고, 잘 혼합하고, cryovials를 실온에서 유지되는 세포 동결 용기로 옮긴다. 냉동 로딩된 용기를 하룻밤 동안 -80°C에서 보관하고, 시퀀싱 전에 장시간 보존을 위해 다음날 냉동 액체를 액체 질소로 옮긴다.
5. 핵 분리
참고: 네 마리의 마우스(총 8개의 샘플에서)로부터 분리된 좌측 및 우측 SCG를 다음의 핵 분리 및 시퀀싱 제제에서 예로서 사용하였다. 전체 절차 중에 모든 것을 얼음 위에 보관하십시오. 작은 핵 펠릿이 보이지 않기 때문에 전체 절차 전반에 걸쳐 상층액 제거를 용이하게하기 위해 스윙 버킷이있는 원심 분리기를 적극 권장합니다.
- 위에 스트레이너 (30 μm)가있는 15 mL 튜브를 준비하고 1 mL의 신경절 배지로 스트레이너를 미리 헹구십시오.
- 액체 질소로부터 cryovials를 꺼내고 즉시 37 °C의 수조에서 해동시킨다. 작은 얼음 알갱이가 냉동 장치에 남아 있으면 냉동 장치를 수조에서 꺼내십시오.
- 신경절 배지 1 mL를 각 냉동 상태로 떨어뜨리면서 손으로 조심스럽게 흔들면서 신경절 세포를 회수한다. 선택사항: 세포 회복을 평가하기 위해, 회수 후 세포 현탁액을 혼합하고, 단계 4.8에 기재된 바와 같이, 살아있는 세포 계수를 위해 5 μL의 세포 현탁액을 취한다.
- 각 신경절이온성 세포 현탁액을 별도의 스트레이너(단계 5.1에서 제조)에 로딩하고 각 스트레이너를 4-5 mL의 신경절 배지로 헹구십시오.
- 변형된 세포 현탁액을 300 × g에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 조심스럽게 제거하고, 세포를 50 μL의 세포 세척 완충액에 재현탁시켰다.
- 세포 현탁액을 저결합 DNA/RNA 0.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 세포 현탁액을 4°C에서 5분 동안 500 × g 에서 원심분리한다.
- 세포 펠릿이 이탈되는 것을 피하기 위해 튜브의 바닥에 닿지 않고 상청액 45 μL를 제거하십시오.
- 45μL의 냉각된 용해 버퍼를 첨가하고 200μL 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 위아래로 피펫을 만듭니다.
- 세포를 얼음 위에서 8분 동안 인큐베이션한다.
- 50 μL의 차가운 핵 세척 완충액을 각 튜브에 첨가하십시오. 혼합하지 마십시오.
- 핵 현탁액을 4°C에서 5분 동안 600 × g 에서 원심분리한다.
- 핵 펠릿을 파괴하지 않고 95 μL의 상청액을 제거한다.
- 냉각된 핵 세척 완충액 45 μL를 펠렛에 첨가한다. 선택 사항: 5 μL의 핵 현탁액을 취하고, 0.4% 트리판 블루의 5 μL와 혼합하여 계수하고, 혈구계로 현미경으로 핵의 품질을 점검하십시오.
- 핵 현탁액을 4°C에서 5분 동안 600 × g 에서 원심분리한다.
- 핵 펠릿이 빠지지 않도록 튜브 바닥을 만지지 않고 상층액을 제거하십시오.
6. 해시태그 올리고(HTO)를 사용한 핵 바코딩 및 멀티플렉싱
참고: HTO 염색 단계는 Gaublomme et al.15에 의해 피질 조직에서의 이전 적용에 따라 매우 낮은 양의 (신경절성) 핵의 핵 표지를 위해 변형되고 최적화되었다.
- 50 μL의 ST-SB 완충액을 핵 펠릿에 첨가하고, 핵이 완전히 재현탁될 때까지 부드럽게 피펫을 8-10회 첨가한다.
- ST-SB/핵 믹스 50μL당 5μL의 Fc 블로킹 시약을 첨가하고, 얼음 위에서 10분 동안 인큐베이션한다.
- ST-SB/핵 믹스의 튜브 당 1 μL (0.5 μg)의 단일 핵 해시태그 항체를 첨가하고, 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한다.
참고 : 인큐베이션 시간이 짧아지면 대표적인 결과에서 볼 수 있듯이 해시 태그 라벨링의 효율성이 낮아집니다. - 100 μL의 ST-SB를 각 튜브에 첨가한다. 혼합하지 마십시오.
- 핵 현탁액을 4°C에서 5분, 600 × g 동안 원심분리한다.
- 핵 펠릿을 파괴하지 않고 상청액 145 μL를 제거한다.
- 6.4단계와 6.5단계를 반복합니다. 핵 펠릿이 빠지지 않도록 튜브 바닥에 닿지 않고 가능한 한 상층액을 제거하십시오.
- 핵 펠릿을 50 μL의 ST-SB에 재현탁시키고, 핵을 부드럽게 혼합한다.
- 핵 현탁액 5 μL를 취하여 0.4% 트리판 블루의 5 μL와 혼합하여 현미경으로 핵을 계수한다. 트리판 블루와 혼합되고 혈구측정기에 로딩된 핵의 대표적인 이미지에 대해서는 도 3A 를 참조한다.
- 핵 현탁액을 4°C에서 600 × g 에서 5분 동안 원심분리한다.
- ST-SB에 핵을 재현탁하여 해당 핵 수에 따라 각 샘플에 대해 1,000-3,000 핵/μL의 표적 핵 농도를 달성하십시오.
- 원하는 수의 셀을 얻기 위해 샘플을 풀링합니다.
참고: 예를 들어, 이 실험에서, 8개의 샘플을 동등하게 풀링하여 총 25,000개의 핵을 달성하여 10x 게놈 크롬 및 snRNA-seq 후 즉시 진행하였다. 핵 수는 신경절이 12 주에서 16 주 사이에 된 마우스에서 분리 될 때 일반적으로 6,000-40,000 세포의 범위에 속합니다. 총 로딩된 핵의 약 절반만이 액적-기반 snRNA-seq에 의해 포획될 수 있다. 예를 들어, 10,000개의 핵의 포획을 보장하기 위해 25,000개의 핵 혼합물이 준비되었으며, 이는 추가적인 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 필요하다.
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Representative Results
단핵 cDNA 라이브러리 제제 및 snRNA-seq의 품질관리 분석
대표적인 결과는 25,000개의 판독/핵 유전자 발현 라이브러리와 5,000개의 판독/핵 해시태그 라이브러리가 있는 단일 풀에서 10,000개의 포획된 핵의 시퀀싱 결과를 설명합니다. 도 3B 는 Bioanalyzer로 체크한1st 가닥 cDNA, 유전자 발현(GEX) 라이브러리, 및 HTO 라이브러리의 품질 관리 결과를 도시한다. HTO 유래 cDNA는 180 bp보다 작은 반면, mRNA 유래 cDNA는 300 bp보다 클 것으로 예상된다. 고품질 GEX 라이브러리는 300 ~ 1,000bp의 넓은 피크로 검출될 수 있으며, HTO 라이브러리는 194bp의 특정 피크로 검출된다. 셀 레인저는 디멀티플렉싱, fastq 파일 생성 및 읽기 정렬에 기본 설정에 사용되었다. Seurat R 패키지(19) 는 이후 품질 관리 및 다운스트림 분석에 사용되었다.
snRNA-seq 데이터의 역다중화는 Seurat 내장 역다중화 전략을 사용하여 HTOs를 식별함으로써 수행되었다. 각 HTO에 대한 역다중화 능력은 먼저 HTO 발현 파일로 시각화되었다(보충 도 S1). 도 4A의 히트맵에서, 일중항은 특정 HTO 발현을 갖는 핵으로서 검출되는 반면, 이중항 및 음성은 다중 또는 전혀 HTO의 비특이적 발현을 나타낸다. 참고로, 핵의 약 33%가 10분 HTO 항체 인큐베이션 접근법을 사용하여 음성으로 검출되었다. 후속 실험에서 배양 시간을 10분에서 30분으로 연장(단계 6.3)하면 음으로 표지된 핵의 현저한 감소가 나타났다(보충 도 S2). 이러한 발견은 항체 배양 시간을 연장하면 해시태그 효율을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
도 4B-D의 바이올린 플롯은 특이치 및 저품질 핵을 확인하기 위해 snRNA-seq 데이터 세트 내의 유전자 수 (nFeature_RNA), 고유 분자 식별자 (UMI) 수 (nCount_RNA) 및 미토콘드리아 카운트 (percent.mt)의 백분율을 입증한다. 핵은 다음의 기준이 충족되었을 때만 다운스트림 분석에 포함되었다: i) nFeature_RNA > 500 및 nCount_RNA < 20,000; ii) percent.mt < 5%; iii) 개별 핵이 단일 HTO의 명확한 발현을 나타냈다. 유전자 발현 카운트는 Seurat의 디폴트 방법을 사용하여 정규화되었다: 875 (2.71%) 유전자는 매우 가변적인 유전자로서 검출되었다 (도 4E). snRNA-seq GEX를 스케일링하고, 수행하였고, 하류 분석에 사용될 주성분의 포함을 평가하기 위해 팔꿈치 플롯을 사용하였다(도 4F). 총 18대의 PC가 포함되었습니다. 클러스터링은 0.4의 분해능으로 수행되었다.
핵을 클러스터링하고, 12개의 개별 클러스터의 시각화를 위해 차원 축소(UMAP)를 수행하였다(도 5A). 클러스터당 원시 유전자 수의 중앙값은 991.5와 4,586 사이에서 다양하다(보충도 S3A, B). UMAP 내에서 HTO 항체의 분열을 시각화하는 것은 신경절의 명확한 분포를 나타내며, 이는 모든 군집이 각 신경절에 제시된다는 것을 나타낸다 (도 5B). HTO 샘플 분리의 정확성을 검증하기 위해, X 비활성 특이적 전사체 (Xist, 비활성 여성 X 염색체에서 발현됨)의 발현을 평가하여 남성 샘플 및 여성 샘플을 동정하였다 (도 5C). Xist 발현은 해시태그 라벨링에 따랐으며, HTO 1-4 표지된 샘플은 여성 샘플이고, HTO 5-8 표지된 샘플은 남성 샘플임을 보여준다. 이는 큐레이팅된 HTO 라벨링이 매우 특이적이라는 것을 시사한다.
본 방법으로 시퀀싱 데이터의 품질과 분해능을 추가로 검증하기 위해, 교감 신경세포의 일부 주요 전사체가 먼저 조사되었다. 결과는 클러스터 5 및 7에서 Th, Dbh 및 Snap25를 고도로 발현하는 교감 신경세포의 존재를 보여준다(도 5D-F). 위성신경교세포는 군집 0-3에서 S100b의 발현을 검출하였다(도 5G)20. 내피 세포는 Acta2의 높은 발현을 갖는 클러스터 4 (도 5H) 및 Acta2의 높은 발현을 갖는 클러스터 8의 기질 세포 (도 5I)에서 검출되었다. 이러한 결과는 snRNA-seq를 사용하는 교감신경절의 신경신경교, 위성신경교세포, 내피세포 및 기질세포의 성공적인 핵 포획을 뒷받침한다.
그림 1: 성인 마우스의 해부가 우수한 자궁경부 신경절과 별성 신경절 . (A) SCG의 위치의 브라이트필드 이미지. (B) 시각화를 용이하게 하기 위해 Wnt1Cre;mT/mG 마우스가 사용되었다. 별표는 SCG (eGFP+)를 나타내고, 화살촉은 경동맥의 분기를 나타냅니다. 왼쪽 패널, 위상차 이미지; 오른쪽 패널, 형광 이미지. (c) StG.(D) 별표의 위치의 브라이트필드 이미지는 StG(eGFP+)를 나타내고, 점선은 MCL을 나타낸다. 왼쪽 패널, 위상차 이미지; 오른쪽 패널, 형광 이미지. (E) 해부된 신경절은 입체 현미경으로 추가 세척을 위해 페트리 접시에 별도로 옮겨진다. (f) 왼쪽 패널은, 경동맥이 여전히 부착되어 있는 해부된 SCG이다. 파선 윤곽선은 SCG를 나타냅니다. 오른쪽 패널, 해부되고 청소 된 StG는 파선 윤곽선으로 표시된 것처럼 반전 된 삼각형 모양을 가지고 있습니다. 스케일 바 = 1,000 μm. 약어: SCG = 우수한 자궁 경부 신경절; StG = 별자리 신경절; MCL = 근 콜리 롱구스; eGFP = 강화된 녹색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: snRNA-seq에 대한 샘플 준비 및 해시태그 염색 기반 멀티플렉싱의 워크플로우. 흐름도는 snRNA-seq에 대해 수행되는 신경절 세포 해리(주황색), 핵 단리(파란색), 및 해시태그 항체 염색 및 멀티플렉싱(녹색)으로부터의 단계를 묘사한다. 약어: FBS = 소 태아 혈청; ST-SB = ST 염색 완충액; snRNA-seq = 단일핵 RNA 시퀀싱. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 핵 분리 및 유전자 발현 라이브러리 제제의 품질 관리 . (A) HTO 염색된 핵의 위상차 이미지. 핵은 화살표로 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μm. (B)1st 가닥 cDNA(상단), GEX 라이브러리(중간) 및 HTO 라이브러리(하단)의 바이오애널라이저 결과. 약어: GEX = 유전자 발현; HTO = 해시태그 올리고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 해시태그 올리고 라벨링 효율의 품질 관리 및 snRNA-seq.의 품질 관리. (A) 해시태그 항체를 사용한 10분의 인큐베이션 시간으로 달성된 HTO 염색의 히트맵. (B-D) 유전자의 수를 묘사하는 품질 관리 메트릭의 바이올린 플롯 (nFeature_RNA, B); UMI(nCount_RNA, C)의 수; 미토콘드리아 수의 비율 (percent.mt, D). (e) 서열화된 총 32,285개의 유전자 중에서, 875개(2.71%)는 산점도에서 가시화된 바와 같이 매우 가변적인 특징으로서 확인되었다. (F) 클러스터링에 사용되는 실제 신호의 포함을 결정하기 위한 PC의 엘보우 플롯. 약어: snRNA-seq = 단일핵 RNA 시퀀싱; HTO = 해시태그 올리고; PC = 주요 구성 요소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 군집화된 snRNA-seq 데이터세트의 snRNA-seq. (A) UMAP 플롯의 snRNA-seqa의 분석의 대표적인 결과. (b) 풀링된 HTO 샘플의 분포를 시각화하는 UMAP 플롯. (C) 역다중화 후 여성 샘플 (높은 Xist 발현)을 검증하는 바이올린 플롯. (D-I) 선택된 마커 유전자를 표시하는 UMAP 플롯; 클러스터는 적색 원 내에 지시되는 상응하는 유전자를 고도로 발현한다: D-F, 교감 신경 세포 (Th, Dbh, Snap25); (g) 위성신경교세포(S100b); (h) 내피 세포 (Pecam1); (I) 기질 세포 (Acta2). 약어: snRNA-seq = 단일핵 RNA 시퀀싱; HTO = 해시태그 올리고; UMAP = 균일 한 매니폴드 근사 및 투영. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: 대표적인 단일 핵 시퀀싱 결과의 품질 관리 메트릭. 사용된 해시태그 항체의 역다중화 능력을 시각화하는 개별 샘플의 HTO 발현 프로필. 약어 : HTO = 해시 태그 올리고. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 S2: 30분 동안 HTO 항체와 함께 인큐베이션된 후속 샘플의 HTO 발현 히트맵. 도 4A 와 함께 HTO 역다중화 후의 음성 표지된 핵의 수의 비교는 항체 배양 시간을 연장시킨 후의 핵 표지의 현저한 개선을 보여준다. 약어 : HTO = 해시 태그 올리고. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도표 S3: 클러스터당 유전자 발현의 중앙값 및 분위수. (a) 각 클러스터의 미가공 유전자 발현 중간값. (b) 각 클러스터의 비제로 원시 유전자 발현의 서술적 통계. Q1: 25번째 백분위수, Q3: 75번째 백분위수. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서, 상세한 프로토콜은 i) 우수한 자궁경부 및 성상 교감신경절의 해부, ii) 신경절이온성 세포의 분리 및 동결보존, iii) 핵 단리, 및 iv) 핵-다중화 목적을 위한 HTO 표지를 이용한 바코딩 및 snRNA-seq에 초점을 맞추는 것을 기술한다.
이 프로토콜로, 교감 신경절 이온성 세포는 일반적으로 사용되는 트립신과 콜라게나제를 사용하여 개별 신경절을 해리시킴으로써 쉽게 얻을 수 있다. 단리된 신경절 세포의 장기 보존은 또한 10% DMSO로 보충된 FBS에서 세포를 동결시킴으로써 쉽게 달성되며, 이는 해동 후 높은 수준의 회복을 보여주었다. 더욱이, 종래의 단일 세포 RNA 시퀀싱과 비교하여, HTO 염색 기반 핵-바코딩의 적용과 결합된 단일 뮤린 교감신경절의 액적 기반 snRNA-seq의 사용은 다음과 같은 이점을 갖는다: i) 샘플은 모든 샘플이 추가 핵 분리를 위해 준비될 때까지 장시간 보존될 수 있다; ii) 다수의 작은 크기 신경절로부터 분리된 양질의 핵은 분리된 샘플 제조에 의해 야기된 배치 효과 없이 시퀀싱을 위해 함께 풀링될 수 있고; iii) 핵 바코드를 사용하여 시퀀싱 후 별개의 신경절 기원을 추적하는 능력; iv) 단일 도서관 준비 만 필요하기 때문에 비용 효율성. 중요하게도, 기술된 단리 및 세포 배양 프로토콜은 뮤린 자궁경부 및 성상 신경절 둘 다에 대해 단일의 균일한 방법을 제공하고, 다른 신경절, 예컨대 등쪽 뿌리 신경절 및 다른 종, 예를 들어, 인간 신경절에 잠재적으로 적용가능하다.
scRNA-seq의 주요 장점 중 하나는 (신규한) 세포 유형을 확인하고 벌크 RNA-seq에 의해 검출될 수 없는 희귀 세포 집단을 밝히는 능력이다. 액적-기반 scRNA-seq 플랫폼은 더 많은 세포의 포획을 용이하게 한다. 따라서 플레이트 기반 시퀀싱 플랫폼과 비교하여 큰 세포 집단의 세포(sub)유형 및 전사 이질성에 대한 집합적 뷰를 제공할 수 있다. 그러나, 액적-기반 (예를 들어, 10x 크롬) 플랫폼은 50 μm보다 큰 세포에 적합하지 않으며, 인간 뉴런 (∼100 μm)과 같은 큰 세포에서의 그의 적용을 제한한다. snRNA-seq 기술의 가용성은 핵의 크기가 작기 때문에 이러한 단점을 극복합니다. 더욱이, snRNA-seq 는 뉴런 및 냉동 조직과 같은 고도로 상호 연결되고 저수율 세포의 유전자 발현 연구에 유용한 방법이다.
이전의 세포 해리 없이 조직으로부터 핵을 직접 분리하는 것이 가능하지만, 먼저 신경절을 단일 세포(액체 질소에서 보존될 수 있음)로 해리시킨 다음 핵을 분리하는 두 단계의 핵 분리 방법을 취하여 수율이 유익하였다. 마우스 교감신경절의 크기가 작기 때문에, 한 단계 핵 분리 접근법보다 두 단계 핵 분리 방법을 사용하여 더 많은 핵이 얻어진다는 것이 발견되었다. cDNA, 라이브러리 및 시퀀싱 분석의 품질 검사는 양호한 핵/RNA 품질을 나타냅니다. 또한 샘플을 집단 시퀀싱 전에 다른 시점에서 수집하고 저장할 수 있기 때문에 물류가 개선됩니다. 단일 핵 분석은 또한 뉴런과 신경교 세포의 성공적인 회복 및 포획을 밝혀 냈으며, 설명 된 두 단계 핵 분리 접근법이 작은 조직에서의 적용에 더 적합 할 수 있음을 시사합니다.
이 프로토콜의 또 다른 이점은 바코드된 항체21을 사용한 멀티플렉싱이다. 마우스 교감 신경절은 작은 조직 (평균 크기 0.1mm3)이며, 개별 신경절에서 유래 한 세포의 수가 적기 때문에 그 자체로 물방울 기반 시퀀싱에 충분하지 않습니다. 그러나, 상이한 마우스의 여러 신경절 또는 동일한 마우스의 상이한 신경절을 풀링하면 개별 마우스 정보 또는 개별 신경절 정보가 손실될 것이다. 용액으로서, HTO 염색 단계는 수행이 용이하고, 핵 풀링 전에 상이한 마우스 또는 상이한 신경절로부터 유래된 핵의 바코드된 라벨링을 가능하게 한다. HTO 역다중화의 정확성은 공지된 여성 핵 집단에서 매칭된 Xist 발현에 의해 이 프로토콜에서 검증된다. 따라서 바코드된 항체를 사용한 핵 멀티플렉싱은 배치 효과를 줄이고 시퀀싱 비용을 낮춥니다.
snRNAseq 의 잠재적 한계는 뉴런 활성에 대한 초기 반응과 연관된 핵 내 초기 전사체의 자연적 존재로 인해 핵과 세포질 내의 RNA 조성 사이에 차이가 있을 수 있다는 것이다22,23. 핵 및 세포질은 또한 세포 주기 상태(24)에 따라 전사체에서 상이할 수 있다. 세포(~11,000개의 유전자)에서보다 개별 핵(~7,000개의 유전자)에서 더 적은 전사체가 검출되었다14. 따라서, scRNA-seq 및 snRNA-seq 는 전사체 수준에서 상이한 결과를 산출할 수 있다. 그럼에도 불구하고, scRNA-seq 및 snRNA-seq 사이의 비교는 뇌 조직14의 신경 세포 유형을 구별하는 유사한 능력을 입증하였다. snRNA-seq에 의한 매우 유사한 세포 유형 또는 아류형 사이의 차별을 개선하기 위해, scRNA-seq에 비해 더 낮은 유전자 검출 능력을 보상하기 위해 더 많은 핵이 필요할 수 있다. 더욱이, HTO 역다중화의 정확도는 충분하지만, 모든 핵이 HTO 특이성을 나타내는 것은 아니기 때문에 일부 데이터의 손실이 불가피하다. 항체 인큐베이션의 추가의 최적화는 HTOs의 이중 또는 음성 발현을 갖는 핵의 수를 최소화할 수 있었다.
종합하면, 이 프로토콜은 신경절 분리에서 시작하여 세포의 낮은 투입량의 핵 준비에 이르기까지 따라하기 쉬운 워크플로우를 통해 교감신경 신경절로부터 뉴런 핵을 시퀀싱하기 위한 실험 절차를 제공하며, 이어서 snRNA-seq에 대한 HTO 염색 기반 핵 표지가 뒤따른다. 이 프로토콜은 뮤린 및 기타 종의 다양한 신경절에 쉽게 수행하고 적용 할 수있는 모든 주요 단계에 대한 자세한 개요를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
Susan L. Kloet (Department of Human Genetics, LUMC, Leiden, the Netherlands)에게 실험 설계 및 유용한 토론에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 Emile J. de Meijer (인간 유전학과, LUMC, Leiden, 네덜란드)에게 단일 핵 RNA 분리 및 시퀀싱을위한 라이브러리 준비에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 네덜란드 과학 연구기구 (NWO) [016.196.346 ~ M.R.M.J.]의 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and reagents | |||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 0.4% trypan blue dye | Bio-Rad | 1450021 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004176 | use 1,400 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 67685 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| Fetal bovine serum (low endotoxin) | Biowest | S1810-500 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Cell wash buffer |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Cell wash buffer |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Nucleus Lysis buffer |
| Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent) | Sigma-Aldrich | 74385 | Nucleus Lysis buffer |
| Nuclease free water (not DEPC-treated) | Invitrogen | AM9937 | Nucleus Lysis buffer |
| Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus Lysis buffer |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | Nucleus Lysis buffer |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | Nucleus Lysis buffer |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Nucleus wash |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Nucleus wash |
| Protector RNase Inhibitor,40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus wash |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Calcium chloride solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Nuclease free water (not DEPC treated) | Invitrogen | AM9937 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Sodium Chloride Solution, 5M | Sigma-Aldrich | 59222C | ST staining buffer (ST-SB) |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST staining buffer (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody | Biolegend | 682205 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody | Biolegend | 682207 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody | Biolegend | 682209 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody | Biolegend | 682225 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody | Biolegend | 682227 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody | Biolegend | 682229 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody | Biolegend | 682231 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody | Biolegend | 682233 | Hashtag antibody |
| TruStain FcX (human) | Biolegend | 422302 | FC receptor blocking solution |
| Equipment and consumables | |||
| Bright-Line Hemacytometer | Merck | Z359629-1EA | |
| Centrifuge 5702/R A-4-38 | Eppendorf | EP022629905 | |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | EP0030108035-250EA | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish | Corning | 351008 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 10773501 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine science tools | 11252-40 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine science tools | 14091-09 | |
| Ice Pan, rectangular 4 L Orange | Corning | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Leica | Microscope | |
| Moria MC50 Scissors | Fine science tools | 15370-50 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine science tools | 15012-12 | |
| Olympus CK2 ULWCD | Olympus | Microscope | |
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| Preseparation Filters (30 µm) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| Shaking water bath | GFL | 1083 | |
| Silicon plate | RubberBV | 3530 | Dissection board |
| Software and packages | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| R programming | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #007576 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Code for the data analysis | |||
| https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE |
References
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