Hier worden twee protocollen gepresenteerd voor de inkapseling van varkensocyten in 3D-kweekomstandigheden. In de eerste worden cumulus-eicellencomplexen (COC’s) ingekapseld in fibrin-alginaatkralen. In de tweede zijn ze ingesloten met gefluoreerde ethyleenpropyleenpoederdeeltjes (microbioreactoren). Beide systemen zorgen voor optimale omstandigheden om hun 3D-organisatie te onderhouden.
In de reproductieve biologie leidde de biotechnologierevolutie die begon met kunstmatige inseminatie en embryotransfertechnologie tot de ontwikkeling van geassisteerde voortplantingstechnieken zoals eicel in vitro rijping (IVM), in vitro fertilisatie (IVF) en klonen van huisdieren door nucleaire overdracht van somatische cel. IVM is de methode in het bijzonder van betekenis. Het is het platform technologie voor de levering van volwassen, goede kwaliteit eicellen voor toepassingen zoals vermindering van de generatie interval in commercieel belangrijke of bedreigde soorten, onderzoek met betrekking tot in vitro menselijke voortplanting, en de productie van transgene dieren voor celtherapieën. De term eicelkwaliteit omvat haar competentie om rijping te voltooien, te bevruchten, wat resulteert in gezonde nakomelingen. Dit betekent dat eicellen van goede kwaliteit van het grootste belang zijn voor een succesvolle bevruchting, waaronder IVF-procedures. Dit levert veel problemen op om een betrouwbare cultuurmethode te ontwikkelen die niet alleen de groei van menselijke eicellen, maar ook van andere grote zoogdiersoorten zou ondersteunen. De eerste stap in IVM is de in vitro cultuur van eicellen. Dit werk beschrijft twee protocollen voor de 3D-cultuur van varkensocyten. In het eerste, 3D-model cumulus-eicellen complexen (COCs) zijn ingekapseld in een fibrin-alginaat kraal tussendoordtreting netwerk, waarin een mengsel van fibrine en alginaat gelijktijdig worden gelled. In de tweede worden COC’s opgehangen in een druppel medium en ingekapseld met gefluoreerd ethyleenpropyleen (FEP; een copolymeer van hexafluoropropyleen en tetrafluorethyleen) poederdeeltjes om microbiobioreactoren te vormen gedefinieerd als Vloeibare Knikkers (LM). Beide 3D-systemen onderhouden de gasvormige in vitro cultuuromgeving. Ze handhaven ook COCs 3D organisatie door het voorkomen van hun afvlakking en de daaruit voortvloeiende verstoring van de kloof knooppunten, waardoor het behoud van de functionele relatie tussen de eicellen, en de omliggende folliculaire cellen.
De ontwikkeling van verschillende cultuursystemen, waaronder driedimensionale (3D) systemen, heeft tot doel optimale omstandigheden te bieden voor de groei en rijping van eicellen geïsoleerd van de follikels, zelfs in de vroegste stadia van ontwikkeling. Dit is van groot belang voor geassisteerde voortplantingstechnieken (ART), vooral met het oog op het toenemende aantal vrouwen die worstelen met onvruchtbaarheid na de behandeling van kanker1. Rijping van eicellen in in vitro omstandigheden (IVM) is al een gevestigde techniek die voornamelijk wordt gebruikt voor de productie van in vitro embryo’s voor de voortplanting van vee2. Bij de meeste zoogdiersoorten kan echter, zelfs als er hoge rijpingspercentages van cumulus-eicellencomplexen (COC’s) kunnen worden bereikt (bereik 60 tot 90 %)3, hun ontwikkelingsbevoegdheid nog steeds niet aan de behoeften voldoen. Dit komt omdat de ontwikkeling van de zygotes verkregen op een zodanige wijze zelfs tot de blastocyst stadium is laag en na de overdracht in surrogaat dieren hun levensvatbaarheid tot termijn wordt verminderd. Daarom is het nodig de ontwikkelingsbevoegdheid van embryo’s die zijn verkregen uit eicellen die onder de IVM-procedure4zijn onderworpen , te vergroten . Daarom worden nieuwe rijpingsmedia5 ontwikkeld en verschillende perioden van in vitrocultuur worden getest6,7 samen met suppletie van cultuurmedia met verschillende groeifactoren en moleculen8,9.
De eerste stap van elk compleet IVM-systeem is het creëren van optimale voorwaarden voor duurzame groei van eicellen tijdens de in vitro cultuur. De eicelgroei is een van de specifieke indicatoren van het vermogen van de eicel om meiose10,11te hervatten . Bovendien moet een passend eicel in vitrocultuursysteem in staat zijn zijn nucleaire rijping en cytoplasmatische differentiatie te ondersteunen12. De morfologie van het cumulus-eicelcomplex is een andere belangrijke indicator die in ART-klinieken wordt gebruikt om de beste eicel te selecteren voor latere stappen van in vitro fertilisatie (IVF) procedure bij mensen en vee12,13. Onder morfologische kenmerken van COCs beschouwd zijn: de eiceldiameter, de cytoplasma granulatie en de eerste poollichaam integriteit14,15. Bovendien is het oocyte ontwikkelingspotentieel gecorreleerd aan het uiterlijk en de verdichting van cumuluscellen en het aantal van hun lagen rond de eicel. Zeer belangrijk voor de juiste eicel in vitro cultuur systeem is ook het behoud van eicel-cumulus cellen juiste interacties en cytoskeleton stabiliteit16,17,18,19. Tot nu toe is in vitro oocyte groei binnen menselijke COC’s aangetoond20. Het gebruik van koe COCs resulteerde ook in levende geboorten. Deze werden geïsoleerd van onrijpe eierstokzakjes en vervolgens gekweekt voor 14 dagen tot de eicel was voldoende groot om de IVF-procedure21ondergaan . Op dezelfde manier leverden COC’s geïsoleerd van bavianenanonielen, onderworpen aan IVM na in vitrocultuur, eicellen op die meiose konden herinitieren in het stadium van de metafase II met een normaal verschijnende spindelstructuur22. Echter, in deze studie de auteurs niet proberen om ze te bevruchten. Niettemin wijzen dergelijke resultaten erop dat een soortgelijke procedure niet alleen kan worden toegepast op deze specifieke zoogdiersoorten, maar ook op menselijke cumulus-eicellencomplexen verkregen uit follikels die het mogelijk zouden moeten maken om eicellen van goede kwaliteit te verkrijgen die geschikt zijn voor een succesvolle IVF-techniek.
De hierboven beschreven resultaten werden verkregen met de toepassing van conventionele IVM-protocollen waarbij eicellen werden gekweekt in tweedimensionale (2D) systemen. De routineprocedure in 2D-kweeksystemen omvat eicellen, ondergedompeld in een druppel van een geschikte cultuurmedia, met minerale olie23,24. Aangenomen wordt dat een olieoverlay tijdens de in vitro oocytecultuur dient om vloeibare verdamping te voorkomen, waardoor het behoud van een goede pH en osmotische druk in de cultuur wordt gewaarborgd. Hoewel een dergelijk 2D-kweeksysteem het mogelijk maakt om, zelfs tot 87% van de rijpe varkensoocyten25,te verkrijgen, is bewezen dat de overlay van minerale olie een aanzienlijke verspreiding van lipoïde oplosbare materialen veroorzaakt die nodig zijn voor een goede ontwikkeling van eicellen26. Bovendien, als gevolg van steroïden (progesteron en oestrogenen) diffusie in de minerale olie tijdens eicelcultuur, een vertraging van nucleaire rijping en vermindering van de ontwikkelingscompetentie prestatie van varkens eicellen werd waargenomen. Dit kan leiden tot het verkrijgen van een klein aantal zygotes, die bovendien worden gekenmerkt door een lage ontwikkelingscapaciteit tot het stadium van de blastocyst en door een slechte levensvatbaarheid na overdracht in ontvangende dieren27. Daarom wordt getracht de ontwikkelingsbevoegdheid van embryo’s die zijn afgeleid van eicellen die na de IVM-procedure zijn ontvangen, te vergroten door optimale voorwaarden te scheppen voor het bereiken van zowel cytoplasmatische als nucleaire rijpheid van eicellen die samen met CCs als complexen worden gekweekt, met name met behulp van driedimensionale (3D)-systemen. In de afgelopen tweedecennia,zijn verschillende innovatieve 3D-in-vitrocultuursystemenontwikkeld. Deze werden ontworpen om de natuurlijke ruimtelijke organisatie van cellen te behouden en om te voorkomen dat hun afvlakking in cultuurgerechten wat niet kan worden bereikt in de traditionele 2D-culturen. De structurele en functionele activiteit van gekweekte COC’s kan worden gewaarborgd door het behoud van hun goede architectuur en ongestoorde communicatie via gap-junctions tussen verschillende compartimenten30. De geschiktheid van bio-steigers voor 3D in vitro cultuur van cumulus-eicellen complexen is geëvalueerd met behulp van natuurlijke biomaterialen, zoals verschillende componenten van de extracellulaire matrix (ECM; collageen en hyaluronzuur)31 of inerte polymeren (alginaat)32. Deze pogingen getest in verschillende soorten bracht veelbelovende resultaten in termen van eicel meiose hervatting en het bereiken van hun volledige competentie33,34,35. Tot nu toe is er echter geen 3D-systeem ontwikkeld dat geschikt is voor coc’s, geïsoleerd van grote huisdieren, waaronder varkens, is ontwikkeld.
Dit werk beschrijft twee protocollen die kunnen worden gebruikt voor de 3D-cultuur van varkens COC’s. Het eerste protocol beschrijft inkapseling bij fibrin-alginaatkralen (FAB). FAB kan worden gevormd door gelijktijdig een alginaat en fibrinoplossing te mengen, die een synchrone gelatieproces ondergaan. Deze combinatie zorgt voor een dynamische mechanische omgeving omdat beide componenten bijdragen aan matrixstijfheid. Een soortgelijke oplossing is eerder gebruikt voor de muizenzakzak follikel cultuur en rijping36. In het geval van het gepresenteerde protocol worden, om voortijdige afbraak van het alginaatfibrinnetwerk te voorkomen, op passende wijze hogere concentraties calciumchlorideoplossing gebruikt, waardoor een snel en stabiel gelatieproces wordt gewaarborgd. De dynamische mechanische omgeving creëert soortgelijke omstandigheden in de natuurlijke intra-folliculaire omgeving waarin COC’s zich bevinden en in omvang toenemen. Bovendien toont het werk representatieve resultaten van COC 3D-kweeksystemen, waarin deze worden opgeschort in een druppel medium en ingekapseld met gefluoreerd ethyleenpropyleen (FEP; een copolymeer van hexafluoropropyleen en tetrafluorethyleen) poederdeeltjes, om microbioreactoren te vormen (Knikkers, LM). LM zijn een vorm van 3D bioreactor waarvan eerder is aangetoond dat het onder andere de groei van levende micro-organismen37, tumorsferoïden38 en embryonale stamcellen39ondersteunt. LMs zijn ook met succes gebruikt voor schapen eicelcultuur40. In de meeste experimenten met LMs werden bioreactoren bereid met polytetrafluorethyleen (PTFE) poederbed met een deeltjesgrootte van 1 μm41. Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van FEP, dat qua samenstelling en eigenschappen sterk lijkt op de fluoropolymeren PTFE. Maar FEP is gemakkelijker vormbaar en zachter dan PTFE en wat vooral belangrijk is, het is zeer transparant.
Beide 3D-systemen onderhouden de gasvormige in vitro cultuuromgeving. Ze handhaven ook COCs 3D organisatie door het voorkomen van hun afvlakking en de daaruit voortvloeiende verstoring van de kloof knooppunten, het behoud van hun functionele relatie tussen de eicellen en de omliggende folliculaire cellen.
Het vermogen om in vitro groei te behouden, niet alleen van de eicel, maar ook van cumuluscellen eromheen en tegelijkertijd de rijping ervan te ondersteunen, is uiterst essentieel voor de succesvolle ondersteunde voortplantingstechnologieën en voor het bevorderen van het begrip van somatische cel/eicelinteracties, vooral bij soorten die langdurige folliculaire groei ondergaan, zoals mensen of varkens. Continu verbeterde IVM-technieken worden nuttig instrument om reproductieve opties te behouden in gevallen van polycyste…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs zijn erg dankbaar voor: dr. Waclaw Tworzydlo (Department of Developmental Biology and Invertebrate Morphology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Jagiellonian University) voor technische faciliteiten in TEM; aan mevrouw Beata Snakowska (Departement Endocrinologie, Instituut voor Zoölogie en Biomedisch Onderzoek, Jagiellonian University) voor technische bijstand; aan de afdeling Celbiologie en Imaging, Institute of Zoology and Biomedical Research, Jagiellonian University, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japan). Dit werk werd ondersteund door subsidie 2018/29/N/NZ9/00983 van National Science Centre Polen.
General | |||
Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
Maturation Medium | |||
hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
Fibrin-alginate beads | |||
Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
Liquid Marble | |||
FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
Morphological examination | |||
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm – EthD-1 |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
Ultrastructure examination | |||
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
Specific instruments, tools | |||
30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |