Hidrogéis alginatos desordeiros descabidos proteolíticos e microbiorreatores hidrofóbicos para encapsulamento de oócito suíno
Summary
Apresentados aqui estão dois protocolos para o encapsulamento de oócitos suínos em condições culturais 3D. No primeiro, os complexos cumulus-oocyte (COCs) são encapsulados em contas fibrina-alginato. No segundo, são fechados com partículas fluoradas de propileno de etileno (microbioreatores). Ambos os sistemas garantem condições ideais para manter sua organização 3D.
Abstract
Na biologia reprodutiva, a revolução da biotecnologia que começou com a inseminação artificial e a tecnologia de transferência de embriões levou ao desenvolvimento de técnicas de reprodução assistida, como oócito na maturação in vitro (IVM), fertilização in vitro (FIV) e clonagem de animais domésticos por transferência nuclear de células somáticas. IVM é o método particularmente importante. É a tecnologia de plataforma para o fornecimento de oócitos maduros e de boa qualidade para aplicações como redução do intervalo de geração em espécies comercialmente importantes ou ameaçadas, pesquisas sobre reprodução humana in vitro e produção de animais transgênicos para terapias celulares. O termo qualidade oócito inclui sua competência para completar o amadurecimento, ser fertilizado, resultando assim em descendentes saudáveis. Isso significa que os oócitos de boa qualidade são primordiais para a fertilização bem sucedida, incluindo procedimentos de FIV. Isso coloca muitas dificuldades para desenvolver um método de cultura confiável que apoiaria o crescimento não só dos oócitos humanos, mas também de outras grandes espécies de mamíferos. O primeiro passo no IVM é a cultura in vitro dos oócitos. Este trabalho descreve dois protocolos para a cultura 3D de oócitos suínos. No primeiro, os complexos cumulus-oocyte do modelo 3D (COCs) são encapsulados em uma rede interpenetrating de contas fibrina-alginato, na qual uma mistura de fibrina e alginato são geladas simultaneamente. No segundo, os COCs são suspensos em uma gota de partículas de pó de médio e encapsulado com etileno fluorado (FEP; copolímero de partículas de hexafluoropropileno e tetrafluoroetileno) para formar microbioreatores definidos como Mármores Líquidos (LM). Ambos os sistemas 3D mantêm o ambiente gasoso de cultura in vitro. Eles também mantêm a organização 3D dos COCs, impedindo seu achatamento e consequente interrupção das junções de lacunas, preservando assim a relação funcional entre o oócito e as células foliculares circundantes.
Introduction
O desenvolvimento de diversos sistemas culturais, incluindo tridimensionais (3D), visa fornecer condições ideais para o crescimento e maturação de oócitos isolados dos folículos mesmo em estágios iniciais de desenvolvimento. Isso é de grande importância para as técnicas de reprodução assistida (TARV), especialmente tendo em vista o crescente número de mulheres que lutam contra a infertilidade após o tratamento do câncer1. A maturação de oócitos em condições in vitro (IVM) já é uma técnica bem estabelecida usada principalmente para a geração de embriões in vitro para fins de reprodução pecuária2. No entanto, na maioria das espécies de mamíferos, mesmo que altas taxas de maturação de complexos cumulus-oócitos (COCs) possam ser alcançadas (faixas de 60 a 90 %)3, sua competência de desenvolvimento ainda é inadequada às necessidades. Isso porque o desenvolvimento das zygotes obtidas de tal forma até o estágio blastocisto é baixo e após a transferência para animais substitutos sua viabilidade de termo é reduzida. Consequentemente, é necessário aumentar a competência de desenvolvimento dos embriões obtidos a partir de oócitos submetidos ao procedimento IVM4. Portanto, novas mídias de maturação5 estão sendo elaboradas e vários períodos de cultura in vitro são testados6,7 juntamente com a suplementação de meios culturais com diversos fatores de crescimento e moléculas8,,9.
O primeiro passo de qualquer sistema IVM completo é criar condições ideais para o crescimento sustentável de oócitos durante a cultura in vitro. O crescimento do oócito é um dos indicadores específicos da capacidade do oócito de retomar a meiose10,11. Além disso, um sistema de cultura in vitro oócito adequado deve ser capaz de suportar sua maturação nuclear e diferenciação citoplasmática12. A morfologia do complexo cumulus-oocyte é outro indicador importante usado nas clínicas de TARV para selecionar o melhor oócito para etapas subsequentes do procedimento de fertilização in vitro (FIV) em humanos e animais12,13. Entre as características morfológicas dos COCs considerados estão: o diâmetro do oóclito, sua granulação citoplasma e a primeira integridade do corpo polar14,15. Além disso, o potencial de desenvolvimento oócito está correlacionado com a aparência e compactação de células cumulus e número de suas camadas em torno do oócito. Muito importante para o sistema de cultura in vitro oócito apropriado é também a manutenção de células oócida-cumulus interações adequadas e estabilidade do citoesqueleto16,17,,18,19. Até agora, o crescimento in vitro de oócitos dentro de COCs humanos foi demonstrado20. O uso de COCs de vaca também resultou em nascidos vivos. Estes foram isolados de folículos ovarianos imaturos e depois cultivados por 14 dias até que o oócito fosse suficientemente grande para se submeter ao procedimento de FIV21. Da mesma forma, cocs isolados de folículos antral babuínos, submetidos ao IVM após a cultura in vitro produzir oócitos capazes de reiniciar a meiose ao estágio metafase II com uma estrutura de fuso de aparecimento normal22. No entanto, neste estudo, os autores não tentaram fertilizá-los. No entanto, tais resultados indicam que um procedimento semelhante poderia ser aplicado não apenas a essas espécies de mamíferos particulares, mas também a complexos humanos cumulus-oócitos obtidos a partir de folículos que deveriam permitir a obtenção de oócitos de boa qualidade adequados para uma técnica de FIV bem sucedida.
Os resultados descritos acima foram obtidos com a aplicação de protocolos ivm convencionais durante os quais os oócitos foram cultivados em sistemas bidimensionais (2D). O procedimento de rotina em sistemas de cultura 2D abrange oócitos, imersos em uma gota de uma mídia cultural adequada, com óleo mineral23,24. Supõe-se que uma sobreposição de óleo durante a cultura in vitro oócito serve para evitar a evaporação líquida, garantindo assim a manutenção do pH adequado e da pressão osmótica na cultura. Embora tal sistema de cultura 2D permita obter, mesmo até 87% dos oócitos suínos maduros25,foi comprovado que a sobreposição de óleo mineral causa difusão substancial de materiais solúveis lipídicos necessários para o desenvolvimento adequado de oócitos26. Além disso, devido à difusão de esteroides (progesterona e estrogênios) no óleo mineral durante a cultura dos oócitos, observou-se um atraso na maturação nuclear e redução da realização da competência de desenvolvimento dos oócitos suínos. Isso pode resultar na obtenção de um pequeno número de zigotas, que além disso são caracterizadas pela baixa capacidade de desenvolvimento para o estágio do blastocisto e pela baixa viabilidade após a transferência para animais receptores27. Portanto, estão sendo feitas tentativas de aumentar a competência de desenvolvimento de embriões derivados de oócitos recebidos após o procedimento de IVM, criando condições ideais para alcançar a maturidade citoplasmática e nuclear dos oócitos cultivados em conjunto com os CCs como complexos, especialmente utilizando sistemas tridimensionais (3D). Vários inovadores sistemas de cultura in vitro 3D foram desenvolvidos nas últimas duas décadas28,29. Estes foram projetados para manter a organização espacial natural das células e evitar seu achatamento em pratos culturais que não podem ser alcançados nas culturas 2D tradicionais. A atividade estrutural e funcional de COCs cultivados pode ser garantida pela manutenção de sua arquitetura adequada e comunicação não perturbada através de cruzamentos de lacunas entre vários compartimentos30. A adequação dos andaimes biopesais para a cultura in vitro 3D de complexos cumulus-oócitos tem sido avaliada utilizando biomateriais naturais, como vários componentes da matriz extracelular (ECM; colágeno e ácido hialurônico)31 ou polímeros inertes (alginato)32. Essas tentativas testadas em diversas espécies trouxeram resultados promissores em termos de retomada da meiose oócito e realização de sua competência plena33,34,,35. No entanto, até agora, nenhum sistema 3D adequado para a maturação de COCs isolado de animais domésticos de grande porte, incluindo suínos, foi desenvolvido.
Este trabalho descreve dois protocolos que podem ser usados para a cultura 3D de COCs suínos. O primeiro protocolo descreve o encapsulamento em contas fibrina-alginato (FAB). A FAB pode ser formada por uma solução de alginato e fibrina, que passa por um processo de gelação síncrona. Essa combinação proporciona um ambiente mecânico dinâmico porque ambos os componentes contribuem para a rigidez da matriz. Uma solução semelhante já foi usada anteriormente para a cultura do folículo ovariano do rato e a maturação36. No caso do protocolo apresentado, para evitar a degradação prematura da rede alginato-fibrina, são utilizadas concentrações adequadamente maiores de solução de cloreto de cálcio, garantindo um processo de gelação rápido e estável. O ambiente mecânico dinâmico cria condições semelhantes a estas no ambiente intra-folicular natural no qual os COCs residem e aumentam de tamanho. Além disso, o trabalho mostra resultados representativos de sistemas de cultura 3D de COCs, nos quais estes são suspensos em uma gota de média e encapsulada com propileno fluorado de etileno (FEP; copolímero de partículas de hexafluoropropileno e tetrafluoroetileno), para formar microbioreatores (Mármores Líquidos, LM). LM é uma forma de bioreator 3D que já foi demonstrado anteriormente para apoiar, entre outros, o crescimento de microrganismos vivos37,esferoides tumorais38 e células-tronco embrionárias39. Os LMs também têm sido usados com sucesso para a cultura oócitode ovelhas 40. Na maioria dos experimentos utilizando LMs, os bioreatores foram preparados utilizando o leito de pó politetrafluoroetileno (PTFE) com tamanho de partícula de 1 μm41. O protocolo apresentado utiliza FEP, que é muito semelhante em composição e propriedades aos fluoropolímeros PTFE. Mas a FEP é mais facilmente formada e mais macia que o PTFE e o que é especialmente importante, é altamente transparente.
Ambos os sistemas 3D mantêm o ambiente gasoso de cultura in vitro. Eles também mantêm a organização 3D dos COCs, impedindo seu achatamento e consequente interrupção das junções de lacunas, preservando sua relação funcional entre o oócito e as células foliculares circundantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
A capacidade de manter o crescimento in vitro não só do oócito, mas também das células cumulus ao seu redor e simultaneamente apoiar sua maturação é extremamente essencial para as tecnologias reprodutivas assistidas bem sucedidas e para promover a compreensão das interações somáticas de células/oócitos especialmente em espécies submetidas ao crescimento folicular prolongado, como seres humanos ou suínos. Técnicas de IVM continuamente melhoradas estão se tornando ferramentas úteis para preservar opçõe…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são muito gratos: dr. Waclaw Tworzydlo (Departamento de Biologia do Desenvolvimento e Morfologia de Invertebrados, Instituto de Zoologia e Pesquisa Biomédica da Universidade Jagiellonian) para instalações técnicas no TEM; à Sra. Beata Snakowska (Departamento de Endocrinologia, Instituto de Zoologia e Pesquisa Biomédica da Universidade Jagiellonian) para assistência técnica; para o Departamento de Biologia Celular e Imagem, Instituto de Zoologia e Pesquisa Biomédica, Universidade Jagiellonian, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tóquio, Japão). Este trabalho foi apoiado pela bolsa 2018/29/N/NZ9/00983 do National Science Centre Poland.
Materials
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm – EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
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