Proteolytically Bozulmuş Aljinat Hidrojeller ve Porcine Oosit Kapsülleme için Hidrofobik Mikrobiyoreaktörler
Summary
Burada 3D kültür koşullarında domuz oositkapsülasyonu için iki protokol sunulmuştur. İlk olarak, kümülüs-oosit kompleksleri (COCs) fibrin-aljinat boncuklar kapsüllenir. İkincisi, florlu etilen propilen toz parçacıkları (mikrobiyoreaktörler) ile çevrilidir. Her iki sistem de 3B organizasyonlarını sürdürmek için en uygun koşulları sağlar.
Abstract
Üreme biyolojisinde, suni döllenme ve embriyo transfer teknolojisi ile başlayan biyoteknoloji devrimi, yumurta tüp bebek olgunlaşma (IVM), tüp bebek (IVF) ve somatik hücreden nükleer transfer ile evcil hayvanların klonlanması gibi yardımcı üreme tekniklerinin geliştirilmesine yol açmıştır. IVM özellikle önem eger bir yöntemdir. Ticari olarak önemli veya nesli tükenmekte olan türlerde üretim aralığının azaltılması, in vitro insan üremesi ile ilgili araştırmalar ve hücre tedavileri için transgenik hayvanların üretimi gibi uygulamalar için olgun, kaliteli oositlerin tedariki için platform teknolojisidir. Yumurta kalitesi terimi olgunlaşmayı tamamlama, döllenme ve sağlıklı yavrular olma yetkinliğini içerir. Bu iyi kalitede oositler IVF prosedürleri de dahil olmak üzere başarılı döllenme için her şeyden önemli olduğu anlamına gelir. Bu, sadece insan yumurtalarının değil, diğer büyük memeli türlerinin de büyümesini destekleyecek güvenilir bir kültür yöntemi geliştirmekte birçok zorluk teşkil eder. IVM’de ilk adım yumurtaların in vitro kültürüdür. Bu çalışma, domuz yumurtası 3D kültür için iki protokol açıklar. İlk olarak, 3D model kümülüs kompleksleri (COCs) bir fibrin-aljinat boncuk interpenetrating ağ kapsüllenir, hangi fibrin ve aljinat karışımı aynı anda jellenir. İkincisinde, COC’lar bir damla orta alanda askıya alınır ve sıvı mermerler (LM) olarak tanımlanan mikrobiyoreaktörleri oluşturmak için florürlü propilen (FEP; heksofloropropilen ve tetrafloroetilen kopolimeri) ile kapsüllenirler. Her iki 3D sistem de gaz tüp bebek kültür ortamını korur. Ayrıca, boşluk kavşaklarının düzlemesini ve bunun sonucu olarak bozulmalarını önleyerek, yumurta ve çevresindeki foliküler hücreler arasındaki işlevsel ilişkiyi koruyarak COCs 3D organizasyonunu sürdürürler.
Introduction
Üç boyutlu (3D) olanlar da dahil olmak üzere çeşitli kültür sistemlerinin geliştirilmesi, gelişimin en erken aşamalarında bile foliküllerden izole edilen yumurtaların büyümesi ve olgunlaşması için en uygun koşulları sağlamayı amaçlamaktadır. Bu yardımlı üreme teknikleri için büyük önem taşımaktadır (ART), özellikle kanser tedavisi sonrası kısırlık ile mücadele eden kadınların artan sayıda görünümünde1. In vitro koşullarda yumurtaların olgunlaşması (IVM) zaten hayvancılık üreme amacıyla in vitro embriyo üretimi için kullanılan iyi kurulmuş bir tekniktir2. Ancak, çoğu memeli türünde, kümülüs-oosit komplekslerinin (COC) yüksek olgunlaşma oranları elde edilebilse bile (dağılım %60-90)3,gelişimsel yeterlilikleri hala ihtiyaçlara yetersizdir. Bunun nedeni blastosist evresine kadar bile böyle bir şekilde elde edilen zigotların gelişiminin düşük olması ve vekil hayvanlara aktarılmasından sonra dönemsel canlılıklarının azalmasıdır. Sonuç olarak, IVM prosedürüne tabi tutulan yumurtalardan elde edilen embriyoların gelişimsel yeterliliğinin arttırılması gerekmektedir4. Bu nedenle, yeni olgunlaşma medya5 ve in vitro kültürün çeşitli dönemlerde test edilmektedir6,7 çeşitli büyüme faktörleri ve molekülleri ile kültür medya takviyesi ile birlikte8,9.
Herhangi bir komple IVM sisteminin ilk adımı in vitro kültür sırasında yumurtasürdürülebilir büyüme için en uygun koşulları oluşturmaktır. Oosit büyümesi, yumurtanın10,11numaralı mayaya devam etme yeteneğinin belirli göstergelerinden biridir. Buna ek olarak, uygun bir oosit in vitro kültür sistemi nükleer olgunlaşma ve sitoplazmik farklılaşma12destekleyen yeteneğine sahip olmalıdır. Kümülüs-oosit kompleksinin morfolojisi, insan ve hayvanda in vitro fertilizasyon (IVF) prosedürünün sonraki adımları için en iyi yumurtayı seçmek için ART kliniklerinde kullanılan bir diğer önemli göstergedir12,13. Düşünülen COC’ların morfolojik özellikleri arasında: yumurta çapı, sitoplazma granülasyonu ve ilk polar vücut bütünlüğü14,15. Ayrıca, yumurta gelişim potansiyeli kümülüs hücrelerinin görünümü ve sıkıştırma ve yumurta çevreleyen tabakalarının sayısı ile ilişkilidir. Çok uygun oosit in vitro kültür sistemi için önemli de oosit-kümülüs hücrelerinin uygun etkileşimleri ve sitoiskelet istikrar16,17,,18,19bakım . Şimdiye kadar, insan COCs içinde in vitro oosit büyümegösterilmiştir 20. İnek COC’lerinin kullanımı da canlı doğumlarla sonuçlandı. Bu olgunlaşmamış yumurtalık folikülleri izole edildi ve daha sonra 14 gün boyunca kültüre kadar oosit ivf prosedürü21geçmesi için yeterince büyüktü . Benzer şekilde, in vitro kültür den sonra IVM tabi babun antral folikülleri izole COCs normal görünen iğ yapısı ile metafaz II aşamasına mayiosis reinitiating yeteneğine sahip oositler verdi22. Ancak bu çalışmada yazarlar onları döllemeye çalışmadı. Yine de bu tür sonuçlar, benzer bir prosedürün sadece bu memeli türlerine değil, aynı zamanda foliküllerden elde edilen insan kümülüs-oosit komplekslerine de uygulanabileceğini göstermektedir.
Yukarıda açıklanan sonuçlar, yumurtaların iki boyutlu (2D) sistemlerde kültürlendiği konvansiyonel IVM protokollerinin uygulanması ile elde edilmiştir. 2D kültür sistemlerinde rutin prosedür, uygun bir kültür ortamının bir damla batırılmış, mineral yağ23,,24ile oositler kapsayan . Bu in vitro oosit kültürü sırasında bir yağ bindirme sıvı buharlaşmayı önlemek için hizmet, böylece kültürde uygun pH ve ozmotik basınç bakımı sağlanması kabul edilir. Böyle bir 2D kültür sistemi elde etmek için izin rağmen, olgun domuz oositlerin bile% 87 kadar25, bu mineral yağ bindirme uygun yumurta gelişimi için gerekli olan lipid çözünür malzemelerin önemli difüzyon neden olduğu kanıtlanmıştır26. Ayrıca, yumurta kültürü sırasında mineral yağiçine steroidler (progesteron ve östrojenler) difüzyon nedeniyle, nükleer olgunlaşma bir gecikme ve domuz yumurtalarının gelişimsel yeterlilik başarı azalma gözlenmiştir. Bu zigotaz sayıda elde neden olabilir, ayrıca blastosist aşamasına düşük gelişim kapasitesi ile karakterizedir ve alıcı hayvanlara aktarılan sonra kötü canlılık ile27. Bu nedenle, IVM prosedürü nden sonra alınan yumurtalardan elde edilen embriyoların gelişimsel yeterliliğini artırmak için, özellikle üç boyutlu (3D) sistemler kullanılarak, kompleks olarak C’lerle birlikte kültüre sahip yumurtaların hem sitoplazmik hem de nükleer olgunluğa ulaşması için en uygun koşulları yaratarak girişimler yapılmaktadır. Çeşitli yenilikçi 3D in vitro kültür sistemleri son yirmi yılda28,,29geliştirilmiştir. Bunlar, hücrelerin doğal uzamsal organizasyonunu sürdürmek ve geleneksel 2B kültürlerde elde edilemeyen kültür yemeklerinde düzleştirmelerini önlemek için tasarlanmıştır. Kültürlü COC’ların yapısal ve işlevsel aktivitesi, uygun mimarilerinin sürdürülmesi ve çeşitli bölmeler arasındaki boşluk kavşakları aracılığıyla kesintisiz iletişim ile sağlanabilir30. Kümülüs-oosit komplekslerinin 3D in vitro kültürü için biyo-iskelelerin uygunluğu ekstra-hücre dışı matriks (ECM; kollajen ve hyaluronik asit)31 veya inert polimerler (aljinat)32gibi doğal biyomalzemeler kullanılarak değerlendirilmiştir. Çeşitli türlerde test edilen bu girişimler, yumurta lı kekozisin yeniden başlaması ve tam yeterliliklerinin elde edilmesini açısından umut verici sonuçlar almıştır33,34,35. Ancak şimdiye kadar, domuzlar da dahil olmak üzere büyük evcil hayvanlardan izole COCs olgunlaşma için uygun hiçbir 3D sistem geliştirilmiştir.
Bu çalışma, domuz COCs 3D kültür için kullanılabilecek iki protokolleri açıklar. İlk protokol de fibrin-aljinat boncuklarda (FAB) kapsülleme tanımlanır. FAB eşzamanlı bir aljinat ve fibrin çözeltisi karıştırma tarafından oluşturulabilir, hangi bir senkron jelleşme sürecinden geçmesi. Her iki bileşen de matris sertliğine katkıda bulununca, bu kombinasyon dinamik bir mekanik ortam sağlar. Benzer bir çözüm daha önce fare yumurtalık folikül kültürü ve olgunlaşma36için kullanılmıştır. Sunulan protokolde, aljinat-fibrin ağının erken bozulmasını önlemek için, hızlı ve istikrarlı bir jelleşme süreci sağlayarak uygun şekilde daha yüksek kalsiyum klorür çözeltisi konsantrasyonları kullanılır. Dinamik mekanik ortam, COC’lerin bulunduğu ve boyutlarının arttığı doğal foliküler ortamda buna benzer koşullar yaratır. Buna ek olarak, çalışma, mikrobiyoreaktörler (Sıvı Mermerler, LM) oluşturmak için, ortam bir damla askıya alınan ve florlu etilen propilen (FEP; heksofloropropilen ve tetrafloroetilen kopolimer) toz parçacıkları ile kapsüllenmiş cocs 3D kültür sistemlerinin temsili sonuçlarını göstermektedir. LM daha önce destek gösterilmiştir 3D biyoreaktör bir formudur, diğerleri arasında, yaşayan mikroorganizmaların büyüme37, tümör sferoidler38 ve embriyonik kök hücreler39. LMs de başarıyla koyun yumurta kültürü40için kullanılmıştır. LM’ler kullanılarak yapılan deneylerin çoğunda biyoreaktörler 1 μm41partikül boyutuna sahip politetrafloroetilen (PTFE) toz yatağı kullanılarak hazırlanmıştır. Sunulan protokol, floropolimerler PTFE’ye kompozisyon ve özellikleri çok benzer olan FEP’i kullanır. Ama FEP ptfe daha kolay biçimlenebilir ve yumuşak ve ne özellikle önemlidir, son derece şeffaftır.
Her iki 3D sistem de gaz tüp bebek kültür ortamını korur. Ayrıca, oosit ve çevresindeki foliküler hücreler arasındaki işlevsel ilişkiyi koruyarak, boşluk kavşaklarının düzlemesini ve bunun sonucu olarak bozulmasını önleyerek COCs 3D organizasyonunu sürdürürler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sadece yumurtanın değil, onu çevreleyen kümülüs hücrelerinin de tüp bebek büyümesini sürdürebilme ve aynı zamanda olgunlaşmasını destekleyebilme yeteneği, başarılı yardımcı üreme teknolojileri için ve özellikle insan veya domuz gibi uzun süreli foliküler büyüme uygulanan türlerde somatik hücre/oosit etkileşimlerinin anlaşılmasını ilerletmek için son derece önemlidir. Sürekli geliştirilmiş IVM teknikleri polikistik over sendromu (PCOS), erken yumurtalık yetmezliği veya kesin kıs…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar çok müteşekkir: dr Waclaw Tworzydlo (Gelişimbiyoloji ve Omurgasız Morfoloji Bölümü, Zooloji ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü, Jagiellonian Üniversitesi) TEM teknik tesisleri için; Teknik yardım için Bayan Beata Snakowska’ya (Endokrinoloji Anabilim Dalı, Zooloji ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü, Jagiellonian Üniversitesi); Hücre Biyolojisi ve Görüntüleme Bölümü, Zooloji ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü, Jagiellonian Üniversitesi, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Japonya). Bu çalışma Polonya Ulusal Bilim Merkezi’nin 2018/29/N/NZ9/00983 sayılı hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm – EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
Referenzen
- Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
- Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
- Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
- Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
- Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
- You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613 (2012).
- Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
- Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
- Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
- Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
- de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
- Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
- Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Entwicklungsbiologie. 226 (2), 167-179 (2000).
- Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Albertini, D. F., Barrett, S. L. Oocyte-somatic cell communication. Reproduction. Supplement. 61, 49-54 (2003).
- Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
- Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
- Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
- Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
- Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
- Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
- Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
- Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
- Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
- Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
- Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
- Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
- Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
- Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709 (2015).
- Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
- Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
- Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
- Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Ooi, C. H., Nguyen, N. T. Manipulation of liquid marbles. Microfluid Nanofluid. 19, 483-495 (2015).
- Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
- Eppig, J. J., O’Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
- Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
- Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biologie. 6, 35-57 (2017).
- Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695 (2011).
- Aussillous, P., Quere, D. Liquid Marbles. Nature. 411, 924-927 (2001).
- Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
- Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
- Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F., Turksen, K. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. , 291-299 (2017).
