Hidrogeles de Alginato degradados proteolíticamente y microbiorreactores hidrófobos para encapsulación de oocitos porcinos
Summary
Aquí se presentan dos protocolos para la encapsulación de ovocitos porcinos en condiciones de cultivo 3D. En el primero, los complejos cúmulos-oocitos (COC) se encapsulan en perlas de fibrina-alginato. En el segundo, se encierran con partículas fluoradas de etileno propileno propileno (microbiorreos). Ambos sistemas garantizan condiciones óptimas para mantener su organización 3D.
Abstract
En biología reproductiva, la revolución biotecnológica que comenzó con la inseminación artificial y la tecnología de transferencia de embriones condujo al desarrollo de técnicas de reproducción asistida como la maduración in vitro de ovocitos (IVM), la fertilización in vitro (FIV) y la clonación de animales domésticos mediante transferencia nuclear desde células somáticas. El IVM es el método particularmente importante. Es la tecnología de plataforma para el suministro de ovocitos maduros y de buena calidad para aplicaciones tales como la reducción del intervalo de generación en especies de importancia comercial o en peligro de extinción, la investigación relativa a la reproducción humana in vitro y la producción de animales transgénicos para terapias celulares. El término calidad de los ovocitos incluye su competencia para completar la maduración, ser fertilizado, dando lugar a una descendencia sana. Esto significa que los ovocitos de buena calidad son primordiales para una fertilización exitosa, incluidos los procedimientos de FIV. Esto plantea muchas dificultades para desarrollar un método de cultivo confiable que apoyaría el crecimiento no sólo de ovocitos humanos, sino también de otras especies de mamíferos grandes. El primer paso en IVM es el cultivo in vitro de ovocitos. Este trabajo describe dos protocolos para el cultivo 3D de ovocitos porcinos. En el primero, los complejos de cúmulos-oocitos (COC) modelo 3D se encapsulan en una red de interpenetración de perlas de fibrina-alginato, en la que una mezcla de fibrina y alginato se gelifican simultáneamente. En el segundo, los COC se suspenden en una gota de medio y se encapsulan con microbiolenos de etileno fluorado (FEP; un copolímero de hexafluoropropileno y tetrafluoroetileno) partículas en polvo para formar microbioctores de forma definidas como líquidos de mármol (LM). Ambos sistemas 3D mantienen el ambiente de cultivo in vitro gaseoso. También mantienen la organización 3D de LOS COC evitando su aplanamiento y la consiguiente interrupción de las uniones de separación, preservando así la relación funcional entre el ócito y las células foliculares circundantes.
Introduction
El desarrollo de varios sistemas de cultivo, incluidos los tridimensionales (3D), tiene como objetivo proporcionar condiciones óptimas para el crecimiento y la maduración de ovocitos aislados de los folículos incluso en las primeras etapas de desarrollo. Esto es de gran importancia para las técnicas de reproducción asistida (TAR), especialmente en vista del creciente número de mujeres que están luchando con la infertilidad después del tratamiento oncológico1. La maduración de ovocitos en condiciones in vitro (IVM) es ya una técnica bien establecida utilizada principalmente para la generación in vitro de embriones con fines de reproducción ganadera2. Sin embargo, en la mayoría de las especies de mamíferos, incluso si se pueden alcanzar altas tasas de maduración de los complejos cúmulos-oocitos (COC) (rango 60 a 90 %)3, su competencia en desarrollo sigue siendo inadecuada para las necesidades. Esto se debe a que el desarrollo de los cigotos obtenidos de tal manera incluso hasta la etapa del blastocisto es bajo y después de la transferencia a animales sustitutos se reduce su viabilidad al término. Por consiguiente, es necesario aumentar la competencia de desarrollo de los embriones obtenidos a partir de ovocitos sometidos al procedimiento4de la IVM. Por lo tanto, nuevos medios de maduración5 están siendo ideados y varios períodos de cultivo in vitro se prueban6,7 junto con la suplementación de medios de cultivo con varios factores de crecimiento y moléculas8,9.
El primer paso de cualquier sistema completo de IVM es crear condiciones óptimas para el crecimiento sostenible de ovocitos durante el cultivo in vitro. El crecimiento de los ovocitos es uno de los indicadores específicos de la capacidad del ócito para reanudar la meiosis10,11. Además, un sistema de cultivo in vitro de ovocitos adecuado debe ser capaz de apoyar su maduración nuclear y su diferenciación citoplasma12. La morfología del complejo cúmulo- ovocitos es otro indicador importante utilizado en las clínicas de TAR para seleccionar el mejor ócito para los pasos posteriores del procedimiento de fertilización in vitro (FIV) en humanos y ganado12,,13. Entre las características morfológicas de los COC considerados se encuentran: el diámetro de los óocitos, su granulación del citoplasma y la primera integridad del cuerpo polar14,15. Además, el potencial de desarrollo de ovocitos está correlacionado con la aparición y compactación de células cúmulos y el número de sus capas que rodean el ovocitos. Muy importante para el sistema de cultivo in vitro de ovocitos adecuado es también el mantenimiento de las células ovocitos-cúmulos interacciones adecuadas y la estabilidad del citoesqueleto16,17,18,19. Hasta ahora, el crecimiento de ovocitos in vitro dentro de los COC humanos ha demostrado20. El uso de COC de vaca también resultó con nacimientos vivos. Estos fueron aislados de los folículos ováricos inmaduros y luego cultivados durante 14 días hasta que el ócito fue lo suficientemente grande como para someterse al procedimiento de FIV21. Del mismo modo, los COC aislados de los folículos antrales de babuino, sometidos a IVM después del cultivo in vitro, producen ovocitos capaces de reiniciar la meiosis a la etapa metafásica II con una estructura de husillo normal que aparece22. Sin embargo, en este estudio los autores no trataron de fertilizarlos. Sin embargo, tales resultados indican que un procedimiento similar podría aplicarse no sólo a estas especies particulares de mamíferos, sino también a los complejos humanos de cúmulos-ovocitos obtenidos a partir de folículos lo que debería permitir obtener ovocitos de buena calidad adecuados para una técnica exitosa de FIV.
Los resultados descritos anteriormente se obtuvieron con la aplicación de protocolos IVM convencionales durante los cuales los ovocitos se cultivaron en sistemas bidimensionales (2D). El procedimiento rutinario en los sistemas de cultivo 2D abarca los ovocitos, inmersos en una gota de un medio de cultivo adecuado, con aceite mineral23,,24. Se supone que una recubrimiento de aceite durante el cultivo de ovocitos in vitro sirve para prevenir la evaporación del líquido, asegurando así el mantenimiento del pH adecuado y la presión osmótica en el cultivo. Aunque este sistema de cultivo 2D permite obtener, incluso hasta el 87% de los ovocitos de cerdo maduros25,se ha demostrado que la recubrimiento de aceite mineral provoca una difusión sustancial de materiales solubles en lípidos que son necesarios para el desarrollo adecuado de ovocitos26. Además, debido a los esteroides (progesterona y estrógenos) difusión en el aceite mineral durante el cultivo de ovocitos, se observó un retraso de la maduración nuclear y la reducción en el logro de la competencia de desarrollo de ovocitos de cerdo. Esto puede dar lugar a la obtención de un pequeño número de cigotos, que además se caracterizan por una baja capacidad de desarrollo a la etapa del blastocisto y por una mala viabilidad después de la transferencia a los animales receptores27. Por lo tanto, se intenta aumentar la competencia de desarrollo de los embriones derivados de los ovocitos recibidos después del procedimiento IVM, creando condiciones óptimas para lograr tanto la madurez citoplasmática como nuclear de los ovocitos cultivados junto con los CC como complejos, especialmente utilizando sistemas tridimensionales (3D). En las últimas dos décadas se han desarrollado varios sistemas innovadores de cultivo in vitro 3D en las últimas dosdécadas, 28y29. Estos fueron diseñados para mantener la organización espacial natural de las células y evitar su aplanamiento en los platos de cultivo lo que no se puede lograr en las culturas 2D tradicionales. La actividad estructural y funcional de los COC cultivados puede garantizarse mediante el mantenimiento de su arquitectura adecuada y la comunicación sin interrupciones a través de cruces entre varios compartimentos30. La idoneidad de los bioestirios para el cultivo in vitro 3D de complejos cúmulos-oocitos se ha evaluado utilizando biomateriales naturales como varios componentes de la matriz extracelular (ECM; colágeno y ácido hialurónico)31 o polímeros inertes (alginato)32. Estos intentos probados en varias especies trajeron resultados prometedores en términos de la reanudación de la meiosis de ovocitos y el logro de su plena competencia33,,34,,35. Sin embargo, hasta ahora no se ha desarrollado ningún sistema 3D adecuado para la maduración de LOS COC aislado de grandes animales domésticos, incluidos los cerdos.
Este trabajo describe dos protocolos que se pueden utilizar para la cultura 3D de COC porcinos. El primer protocolo describe la encapsulación en perlas de fibrina-alginato (FAB). FAB se puede formar mezclando simultáneamente una solución de alginato y fibrina, que se someten a un proceso de gelización síncrona. Esta combinación proporciona un entorno mecánico dinámico porque ambos componentes contribuyen a la rigidez de la matriz. Una solución similar se ha utilizado previamente para el cultivo de folículo ovárico ratón y la maduración36. En el caso del protocolo presentado, para evitar la degradación prematura de la red de alginato-fibrina, se utilizan concentraciones apropiadamente más altas de solución de cloruro de calcio, asegurando un proceso de gelación rápido y estable. El entorno mecánico dinámico crea condiciones similares a estas en el entorno intrafolicular natural en el que residen los COC y aumentan de tamaño. Además, el trabajo muestra resultados representativos de los sistemas de cultivo 3D de COC, en los que estos se suspenden en una gota de medio y encapsulan con etileno propileno fluorado (FEP; un copolímero de hexafluoropropileno y tetrafluoroetileno) partículas de polvo, para formar microbioreactores (Marble líquido, LM). Lm son una forma de biorreactor 3D que se ha demostrado previamente para apoyar, entre otros, el crecimiento de microorganismos vivos37,esferoides tumorales38 y células madre embrionarias39. Los LMs también se han utilizado con éxito para el cultivo de ovocitos de oveja40. En la mayoría de los experimentos con LMs, los biorreactores se prepararon utilizando lecho de polvo de politetrafluoroetileno (PTFE) con un tamaño de partícula de 1 m41. El protocolo presentado utiliza FEP, que es muy similar en composición y propiedades a los fluoropolímeros PTFE. Pero FEP es más fácilmente formable y más suave que el PTFE y lo que es especialmente importante, es altamente transparente.
Ambos sistemas 3D mantienen el ambiente de cultivo in vitro gaseoso. También mantienen la organización 3D de LOS COC evitando su aplanamiento y la consiguiente interrupción de las uniones de separación, preservando su relación funcional entre el ócito y las células foliculares circundantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacidad de mantener el crecimiento in vitro no sólo del ócito, sino también de las células cúmulos que lo rodean y al mismo tiempo apoyar su maduración es extremadamente esencial para las tecnologías de reproducción asistida exitosas y para promover la comprensión de las interacciones de células/ovocitos somáticos, especialmente en especies sometidas a un crecimiento folicular prolongado como seres humanos o cerdos. Las técnicas de IVM mejoradas continuamente se están convirtiendo en herramientas útile…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores están muy agradecidos a: Dr Waclaw Tworzydlo (Departamento de Biología del Desarrollo y Morfología invertebrada, Instituto de Zoología e Investigación Biomédica, Universidad Jaguelónica) para instalaciones técnicas en TEM; a la Sra. Beata Snakowska (Departamento de Endocrinología, Instituto de Zoología e Investigación Biomédica, Universidad Jaguelónica) para la asistencia técnica; al Departamento de Biología Celular e Imagen, Instituto de Zoología e Investigación Biomédica, Universidad Jaguelónica, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokio, Japón). Este trabajo fue apoyado por la subvención 2018/29/N/NZ9/00983 del Centro Nacional de Ciencias de Polonia.
Materials
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm – EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
Referenzen
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