포르신 오시테 캡슐화를 위한 프로틸분해 된 알기네이트 하이드로겔 및 소수성 미생물 반응기
Summary
여기에 제시 된 3D 문화 조건에서 돼지 난모세포의 캡슐화를위한 두 가지 프로토콜이 있습니다. 첫 번째, 적수-oocyte 복합체 (COC) 피브린-알자네이트 구슬에 캡슐화 된다. 두 번째, 그들은 불소 에틸렌 프로필렌 분말 입자로 동봉되어 (미생물 반응기). 두 시스템 모두 최적의 조건을 통해 3D 조직을 유지관리합니다.
Abstract
생식 생물학에서 인공 수정 및 배아 전달 기술로 시작된 생명 공학 혁명은 체외 성숙 (IVM), 체외 수정 (IVF) 및 체세포에서 핵 전송에 의한 국산 동물의 복제와 같은 보조 생식 기술의 개발로 이어졌습니다. IVM은 특히 중요한 방법입니다. 상업적으로 중요하거나 멸종 위기에 처한 종의 생성 간격 의 감소, 체외 인간 생식에 관한 연구, 세포 치료를 위한 형질 전환 동물의 생산 과 같은 응용 분야에 대한 성숙하고 양질의 난모세포의 공급을 위한 플랫폼 기술입니다. 난모세포 품질이라는 용어에는 성숙을 완료하고 수정되어 건강한 자손이 될 수 있는 능력이 포함됩니다. 이것은 좋은 품질의 난모세포가 IVF 절차를 포함하여 성공적인 수정을 위해 가장 중요하다는 것을 의미합니다. 이것은 인간 난모세포의 뿐 아니라 또한 그밖 큰 포유류 종의 성장을 지원하는 믿을 수 있는 문화 방법을 개발하는 많은 어려움을 제기합니다. IVM의 첫 번째 단계는 난모세포의 체외 배양입니다. 이 작품은 돼지 난모세포의 3D 문화에 대한 두 가지 프로토콜을 설명합니다. 첫 번째, 3D 모델 적혈구-oocyte 복합체(COC)는 피브린-알기네이트 비드 상호 침투 네트워크에 캡슐화되어 피브린과 알기네이트의 혼합물이 동시에 겔화된다. 두 번째 하나에서, COC는 액체 대리석 (LM)으로 정의 된 미생물 반응기를 형성하기 위해 응소 에틸렌 프로필렌 (FEP; 헥사 플루오로 프로필렌과 테트라 플루오로로틸렌의 합합체) 분말 입자로 캡슐화 된 중간 방울로 중단됩니다. 두 3D 시스템은 체외 배양 환경에서 기체를 유지합니다. 또한 COC 3D 조직을 유지하여 수축및 갭 접합의 결과적으로 중단을 방지하여 난소 세포와 주변 여포 세포 사이의 기능적 관계를 보존합니다.
Introduction
3차원(3D) 시스템을 포함한 다양한 문화 시스템의 개발은 개발 초기 단계인 여포로부터 분리된 난모세포의 성장과 성숙을 위한 최적의 조건을 제공하는 것을 목표로 하고 있습니다. 이는 특히 암치료후 불임으로 어려움을 겪고 있는 여성의 수가 증가하고 있다는 점에서 보조 생식 기술(ART)에 매우 중요합니다. 체외 조건에서 난모세포의 성숙 (IVM)은 이미 가축 재생을 목적으로 체외 배아 생성에 주로 사용되는 잘 확립 된기술이다 2. 그러나, 대부분의 포유류 종에서는 적혈구-난낭체 복합체(COC)의 성숙률이 높더라도 달성할 수 있다(범위 60~ 90%)3,그들의 발달 능력은 여전히 필요에 부적당하다. 이는 발아세포 단계까지도 그런 방식으로 얻어진 자고테의 발달이 낮고 대리동물로 옮겨진 후 용어에 대한 생존능력이 감소하기 때문이다. 따라서, IVM 시술4를받은 난모세포로부터 얻어진 배아의 발달 능력을 증가시킬 필요가 있다. 따라서, 새로운 성숙배지(5)가 고안되고 있으며, 다양한 성장인자와 분자를 가진 배양매체의5 보충과 함께8,6,,7, 7의 시험관내 배양문화가 시험되고있다.
완전한 IVM 시스템의 첫 번째 단계는 체외 문화 동안 난모세포의 지속 가능한 성장을위한 최적의 조건을 만드는 것입니다. 난소 세포 성장은 meiosis10,,11을재개하는 oocyte의 능력의 특정 지표 중 하나입니다. 또한, 체외 배양 시스템의 적절한 난모세포는 핵 성숙과 세포질분화(12)를지원할 수 있어야 한다. 적혈구-오낭복합체의 형태는 인간과가축(12,,13)에서체외 수정(IVF) 절차의 후속 단계에 가장 적합한 난피티를 선택하기 위해 ART 클리닉에서 사용되는 또 다른 중요한 지표이다. 고려 된 COC의 형태학적 특성 중 에는 난십성 직경, 세포질 과립 및 최초의 극지 체 무결성14,15. 게다가, 난소 세포 발달 잠재력은 나낭세포를 둘러싼 적수 세포의 외관 그리고 다짐 및 수와 상관관계가 있습니다. 체외 배양 시스템에서 적절한 난낭체에 매우 중요한 것은 또한 난퀴트-적혈구 세포의 유지보수가 적절한 상호작용및 세포골격안정성(16,,17,,18,,19)이다. 지금까지, 인간 COC 내의 체외 난십성장은20을입증되었다. 소 COC의 사용은 또한 살아있는 출생으로 귀착되었습니다. 이들은 미숙한 난소 여포에서 격리된 다음 14일 동안 배양되어 난소가 IVF절차(21)를겪을 수 있는 충분히 커졌다. 유사하게, 개코원숭이 개성적인 여포로부터 분리된 COC는, 체외 배양 후 IVM을 실시하여 정상적인 스핀들구조(22)를가진 대사 II 단계에 메이오시스를 재연할 수 있는 난모세포를 산출하였다. 그러나, 이 연구에서 저자는 그들을 비옥하 하려고 하지 않았다. 그럼에도 불구하고 이러한 결과는 유사한 절차가 이러한 특정 포유류 종뿐만 아니라 성공적인 IVF 기술에 적합한 양질의 난동을 얻을 수 있어야 할 여포에서 얻은 인간의 적혈구 -oocyte 복합체에 적용 될 수 있음을 나타냅니다.
상기 설명된 결과는 2차원(2D) 시스템에서 난모세포가 배양되는 동안 기존의 IVM 프로토콜의 적용으로 얻어졌다. 2D 배양 시스템의 일상적인 절차는 미네랄 오일23,24와함께 적절한 배양 매체의 한 방울에 침지 된 난모세포를 다루고 있습니다., 체외 내 분피 배양 중 오일 오버레이는 액체 증발을 방지하여 배양시 적절한 pH 및 삼투압의 유지를 보장하는 역할을 한다고 가정합니다. 이러한 2D 배양 시스템은 성숙한 돼지난우세포(25)의87%까지도 얻을 수 있지만, 미네랄 오일 오버레이가 적절한 난소세포 개발에 필요한 지질 용해성 물질의 상당한 확산을 야기한다는 것이입증되었다(26) 또한, 스테로이드(황체호르몬 및 에스트로겐) 난모세포 배양 시 미네랄 오일로 확산되기 때문에, 돼지 난모세포의 개발 능력 달성의 핵 성숙 및 감소가 관찰되었다. 이로 인해 소수의 zygotes를 획득할 수 있으며, 이는 또한 배반물의 단계에 낮은 발달 능력을 특징으로 하며, 수령인동물(27)으로이송된 후 생존력이 떨어지는 것을 특징으로 한다. 따라서, IVM 시술 후에 수신된 난모세포에서 유래된 배아의 발달 능력을 높이기 위한 시도가 이루어지고 있으며, 특히 3차원(3D) 시스템을 사용하여 복잡한 C와 함께 배양된 난모세포의 세포질 및 핵 성숙도를 달성하기 위한 최적의 조건을 조성함으로써, 특히 3차원(3D) 시스템을 사용하고 있다. 다양한 혁신적인 체외 배양 시스템은 지난28년,29년에개발되었다.28 이들은 세포의 자연적인 공간 조직을 유지하고 전통적인 2D 문화권에서 달성할 수 없는 문화 접시에서 그들의 평탄화를 피하기 위하여 디자인되었습니다. 배양된 COC의 구조적 및 기능적 활동은 다양한구획(30)의간격 접합을 통해 적절한 아키텍처와 방해받지 않는 통신의 유지보수에 의해 보장될 수 있다. 적수-오사이클 복합체의 체외 배양3D에 대한 바이오 스캐폴드의 적합성은 세포외 매트릭스(ECM; 콜라겐 및 히알루론산)31 또는 불활성 중합체(alginate)32의다양한 성분과 같은 천연 생체 물질을 사용하여 평가되었다. 여러 종에서 테스트 이러한 시도는 oocyte meiosis 재개 및 그들의 전체 능력의 성취의 측면에서 유망한 결과를 가져왔다33,,34,,35. 그러나 지금까지 돼지를 포함한 대형 국산 동물으로부터 분리된 COC 성숙에 적합한 3D 시스템은 개발되지 않았습니다.
이 작품은 돼지 COC의 3D 문화에 사용할 수있는 두 가지 프로토콜을 설명합니다. 첫 번째 프로토콜은 피브린 알기네이트 구슬(FAB)의 캡슐화를 설명합니다. FAB는 동기적 젤화 과정을 거치는 알기네이트 및 피브린 용액을 동시에 혼합하여 형성될 수 있다. 이 조합은 두 구성 요소 모두 매트릭스 강성에 기여하기 때문에 동적 기계적 환경을 제공합니다. 마우스 난소 여포 문화와 성숙(36)에대해 유사한 해결책이 이전에 사용되었습니다. 제시된 프로토콜의 경우, 알기네이트-피브린 네트워크의 조기 분해를 피하기 위해, 염화칼슘 용액의 농도가 적절히 높아 빠르고 안정적인 겔화 과정을 보장한다. 역동적인 기계적 환경은 COCs가 상주하고 크기가 증가하는 자연적인 여포 내 환경에서 이와 유사한 조건을 만듭니다. 또한, 이 작품은 이들 중간 의 한 방울에 일시 중단되고 불소 에틸렌 프로필렌 (FEP; 헥사플루오로 프로필렌과 테트라 플루오로로틸렌) 분말 입자로 캡슐화되는 COC 3D 배양 시스템의 대표적인 결과를 보여 주며 미생물 반응기 (액체 대리석, LM)를 형성합니다. LM은 이전에 살아있는미생물(37),종양 스페로이드(38) 및 배아 줄기세포(39)의 성장을 지원하는 것으로39나타난 3D 생물반응기의 한 형태이다.38 LM은 양 오사이클배양(40)에도성공적으로 사용되었습니다. LM을 이용한 대부분의 실험에서, 생물반응기는 1 μm41의입자 크기로 폴리테트라플루오로로틸렌(PTFE) 분말 침대를 사용하여 제조하였다. 제시된 프로토콜은 FEP를 사용하며, 이는 플루오로폴리머 PTFE에 대한 조성 및 특성에서 매우 유사하다. 그러나 FEP는 PTFE보다 더 쉽고 부드럽고 특히 중요한 것은 매우 투명합니다.
두 3D 시스템은 체외 배양 환경에서 기체를 유지합니다. 그(것)들은 또한 그들의 편평하고 간격 접합의 결과로 중단을 방지하고, oocyte와 주변 여포 세포 사이 그들의 기능적인 관계를 보존하여 COCs 3D 조직을 유지합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
체외 성장뿐만 아니라 난소 세포를 둘러싸고 동시에 성숙을 지원하는 능력은 성공적인 보조 생식 기술과 특히 인간이나 돼지와 같은 장기간 여포 성장을 겪고있는 종에서 체세포 / oocyte 상호 작용에 대한 이해를 증진하는 데 매우 중요합니다. 지속적으로 향상된 IVM 기술은 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 조기 난소 실패, 또는 결정적인 불임 (종양 요법)의 경우에 생식 옵션을 보존하는 유용한 도구가되…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 매우 감사: 박사 Waclaw Tworzydlo (발달 생물학 및 무척추 동물 형태학과, 동물학 및 생물 의학 연구 연구소, Jagiellonian 대학) TEM의 기술 시설에 대 한; 기술 지원을 위해 비타 스나코프스카 (내분비학 학과, 동물학 및 생물 의학 연구 연구소, 야기엘로니아 대학)에게; 세포 생물학 및 이미징학과, 동물학 및 생물 의학 연구 연구소, 자지엘로니아 대학, JEOL JEM 2100HT (JEOL, 도쿄, 일본). 이 작품은 폴란드 국립 과학 센터로부터 2018/29/N/NZ9/00983교부금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm – EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
Referenzen
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