Proteolytisch abgebaute Alginat-Hydrogele und hydrophobe Mikrobioreaktoren zur Poren-Oozyten-Verkapselung
Summary
Hier werden zwei Protokolle für die Verkapselung von Schweineeioozyten unter 3D-Kulturbedingungen vorgestellt. In der ersten werden Cumulus-Oozyten-Komplexe (COCs) in Fibrin-Alginat-Perlen eingekapselt. In der zweiten werden sie mit fluorierten Ethylenpropylenpulverpartikeln (Mikrobioreaktoren) umschlossen. Beide Systeme sorgen für optimale Bedingungen, um ihre 3D-Organisation aufrechtzuerhalten.
Abstract
In der Reproduktionsbiologie führte die biotechnologische Revolution, die mit künstlicher Befruchtung und Embryotransfertechnologie begann, zur Entwicklung von Techniken der assistierten Reproduktion wie Eizellen-In-vitro-Reifung (IVM), In-vitro-Fertilisation (IVF) und Klonen von Haustieren durch nuklearen Transfer aus somatomatischen Zellen. IVM ist die Methode von besonderer Bedeutung. Es ist die Plattformtechnologie für die Lieferung von ausgereiften, qualitativ hochwertigen Eizellen für Anwendungen wie die Verringerung des Erzeugungsintervalls bei kommerziell wichtigen oder gefährdeten Arten, die Forschung zur in vitro menschlichen Fortpflanzung und die Produktion von transgenen Tieren für Zelltherapien. Der Begriff Eizellenqualität umfasst seine Kompetenz, die Reifung abzuschließen, zu befruchten und so zu gesunden Nachkommen zu führen. Dies bedeutet, dass Eizellen von guter Qualität für eine erfolgreiche Befruchtung einschließlich IVF-Verfahren von größter Bedeutung sind. Dies wirft viele Schwierigkeiten auf, eine zuverlässige Kulturmethode zu entwickeln, die das Wachstum nicht nur menschlicher Eizellen, sondern auch anderer großer Säugetierarten unterstützen würde. Der erste Schritt in IVM ist die In-vitro-Kultur der Eizellen. Diese Arbeit beschreibt zwei Protokolle für die 3D-Kultur von Schweineeioozyten. Im ersten, 3D-Modell Cumulus-Oocyte-Komplexe (COCs) sind in einem Fibrin-Alginat-Perle-Intervenieren-Netzwerk gekapselt, in dem eine Mischung aus Fibrin und Alginat gleichzeitig gegelt werden. Im zweiten werden COCs in einem Tropfen von Medium suspendiert und mit fluoriertem Ethylenpropylen (FEP; einem Copolymer aus Hexafluorpropylen und Tetrafluorethylen) Pulverpartikeln zu Mikrobioreaktoren, die als Flüssigmarmore (LM) definiert sind, verkapselt. Beide 3D-Systeme erhalten die gasförmige In-vitro-Kulturumgebung. Sie erhalten auch die COCs 3D-Organisation, indem sie ihre Abflachung und die daraus resultierende Störung von Spaltknoten verhindern und so die funktionelle Beziehung zwischen der Eizelle und den umgebenden Follikelzellen erhalten.
Introduction
Die Entwicklung verschiedener Kultursysteme, einschließlich dreidimensionaler (3D) Systeme, zielt darauf ab, optimale Bedingungen für das Wachstum und die Reifung von Eizellen zu schaffen, die von den Follikel isoliert sind, selbst in frühesten Entwicklungsstadien. Dies ist von großer Bedeutung für assistierte Reproduktionstechniken (ART), insbesondere angesichts der steigenden Zahl von Frauen, die nach der Krebsbehandlung mit Unfruchtbarkeit zu kämpfen haben1. Die Reifung von Eizellen in In-vitro-Bedingungen (IVM) ist bereits eine etablierte Technik, die hauptsächlich für die In-vitro-Embryoerzeugung zum Zwecke der Reproduktion von Nutztieren verwendet wird2. Doch selbst wenn bei den meisten Säugetierarten hohe Reiferaten von Cumulus-Oozyten-Komplexen (COCs) erreicht werden können (Bereich 60 bis 90 %)3,ist ihre Entwicklungskompetenz immer noch unzureichend für die Bedürfnisse. Dies liegt daran, dass die Entwicklung der zygoten, die so bis zum Blastozystenstadium erhalten werden, gering ist und nach der Übertragung in Ersatztiere ihre Lebensfähigkeit auf Term reduziert wird. Folglich ist es notwendig, die Entwicklungskompetenz von Embryonen aus Eizellen zu erhöhen, die dem IVM-Verfahren unterzogen wurden4. Daher werden neue Reifungsmedien5 entwickelt und verschiedene Perioden der In-vitro-Kultur getestet6,7 zusammen mit der Supplementierung von Kulturmedien mit verschiedenen Wachstumsfaktoren und Molekülen8,9.
Der erste Schritt eines vollständigen IVM-Systems besteht darin, optimale Bedingungen für ein nachhaltiges Wachstum von Eizellen während der In-vitro-Kultur zu schaffen. Das Eizellenwachstum ist einer der spezifischen Indikatoren für die Fähigkeit der Oozyte, die Meiose wieder aufzunehmen10,11. Darüber hinaus muss ein geeignetes In-vitro-Kultursystem der Oozyten in der Lage sein, seine kernnukleare Reifung und zytoplasmatische Differenzierung zu unterstützen12. Die Morphologie des Cumulus-Oozyten-Komplexes ist ein weiterer wichtiger Indikator, der in ART-Kliniken verwendet wird, um die beste Oozyte für nachfolgende Schritte der In-vitro-Fertilisation (IVF) beim Menschen und Vieh auszuwählen12,13. Zu den morphologischen Merkmalen der untersuchten COCs gehören: der Oozytendurchmesser, seine Zytoplasmagranulation und die erste polare Körperintegrität14,15. Außerdem ist das Eizellenentwicklungspotential mit dem Aussehen und der Verdichtung von Cumuluszellen und der Anzahl ihrer Schichten, die die Oozyte umgeben, korreliert. Sehr wichtig für das geeignete In-vitro-Kultursystem der Oozyten ist auch die Aufrechterhaltung der oozyten-kumulus-Zellen und der Zytoskelettstabilität16,17,18,19. Bisher wurde das In-vitro-Oozytenwachstum innerhalb menschlicher COCs20nachgewiesen. Der Einsatz von Kuh-COCs führte auch zu Lebendgeburten. Diese wurden aus unreifen Eierstockfollikel isoliert und dann 14 Tage lang kultiviert, bis die Oozyte ausreichend groß war, um sich dem IVF-Verfahren zu unterziehen21. In ähnlicher Weise ergaben COCs, die von Pavian-Antralefollikel isoliert wurden und IVM nach In-vitro-Kultur unterworfen waren, Oozyten, die in der Lage waren, die Meiose mit einer normal erscheinenden Spindelstruktur wieder in die Metaphase II zu führen22. In dieser Studie versuchten die Autoren jedoch nicht, sie zu befruchten. Dennoch deuten solche Ergebnisse darauf hin, dass ein ähnliches Verfahren nicht nur auf diese speziellen Säugetierarten angewendet werden könnte, sondern auch auf menschliche Cumulus-Oozyten-Komplexe, die aus Follikel gewonnen werden, was es ermöglichen sollte, Eizellen von guter Qualität zu erhalten, die für eine erfolgreiche IVF-Technik geeignet sind.
Die oben beschriebenen Ergebnisse wurden mit der Anwendung konventioneller IVM-Protokolle erzielt, bei denen Eizellen in zweidimensionalen (2D) Systemen kultiviert wurden. Das Routineverfahren in 2D-Kultursystemen deckt Eizellen, eingetaucht in einen Tropfen eines geeigneten Kulturmediums, mit Mineralöl23,24ab. Es wird angenommen, dass eine Ölüberlagerung während der In-vitro-Oozytenkultur dazu dient, flüssigkeitsverdunstung zu verhindern und so die Aufrechterhaltung des richtigen pH-Werts und des osmotischen Drucks in der Kultur zu gewährleisten. Obwohl ein solches 2D-Kultursystem es ermöglicht, sogar bis zu 87% der reifen Schweineoozyten25zu erhalten, ist es erwiesen, dass die Mineralöl-Overlay verursacht erhebliche Diffusion von lipidlöslichen Materialien, die für die richtige Eizellen Entwicklung notwendig sind26. Zusätzlich, wegen Steroiden (Progesteron und Östrogene) Diffusion in das Mineralöl während der Oozytenkultur, eine Verzögerung der nuklearen Reifung und Verringerung der Entwicklungskompetenz Leistung von Schweineoozyten beobachtet wurde. Dies kann zu einer geringen Anzahl von Zygoten führen, die zusätzlich durch geringe Entwicklungskapazität bis zum Stadium der Blastozyste und durch schlechte Lebensfähigkeit nach dem Transfer in Empfängertiere gekennzeichnet sind27. Daher wird versucht, die Entwicklungskompetenz von Embryonen, die aus Eizellen stammen, die nach dem IVM-Verfahren gewonnen werden, zu erhöhen, indem optimale Bedingungen geschaffen werden, um sowohl zytoplasmatische als auch nukleare Reife von Eizellen zu erreichen, die zusammen mit CCs als Komplexe kultiviert werden, insbesondere mit dreidimensionalen (3D) Systemen. Verschiedene innovative 3D-In-vitro-Kultursysteme wurden in den letzten zwei Jahrzehnten entwickelt28,29. Diese wurden entwickelt, um die natürliche räumliche Organisation von Zellen zu erhalten und ihre Abflachung in Kulturgerichten zu vermeiden, was in den traditionellen 2D-Kulturen nicht erreicht werden kann. Die strukturelle und funktionale Aktivität kultivierter COCs kann durch die Aufrechterhaltung ihrer richtigen Architektur und eine ungestörte Kommunikation durch Spaltverbindungen zwischen verschiedenen Kompartimenten sichergestellt werden30. Die Eignung von Biogerüsten für die 3D-In-vitro-Kultur von Cumulus-Oozyten-Komplexen wurde mit natürlichen Biomaterialien wie verschiedenen Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM; Kollagen und Hyaluronsäure)31 oder inerten Polymeren (Alginat)32bewertet. Diese Versuche, die an mehreren Arten getestet wurden, brachten vielversprechende Ergebnisse in Bezug auf Dieoozyten-Meiose-Wiederaufnahme und die Erreichung ihrer vollen Kompetenz33,34,35. Bisher wurde jedoch kein 3D-System entwickelt, das für die von großen Haustieren isolierte COC-Reifung geeignet ist.
Diese Arbeit beschreibt zwei Protokolle, die für die 3D-Kultur von Schweine-COCs verwendet werden können. Das erste Protokoll beschreibt die Verkapselung in Fibrin-Alginat-Perlen (FAB). FAB kann durch gleichzeitiges Mischen einer Alginat- und Fibrinlösung gebildet werden, die einem synchronen Gelationsprozess unterzogen wird. Diese Kombination bietet eine dynamische mechanische Umgebung, da beide Komponenten zur Matrixsteifigkeit beitragen. Eine ähnliche Lösung wurde bereits für die Eierstockfollikelkultur und Reifung der Maus verwendet36. Im Falle des vorgelegten Protokolls werden zur Vermeidung eines vorzeitigen Abbaus des Alginat-Fibrin-Netzwerks entsprechend höhere Konzentrationen von Calciumchloridlösung verwendet, um einen schnellen und stabilen Gelationsprozess zu gewährleisten. Die dynamische mechanische Umgebung schafft ähnliche Bedingungen in der natürlichen intrafollikulären Umgebung, in der sich COCs befinden und die größer werden. Darüber hinaus zeigt die Arbeit repräsentative Ergebnisse von COCs 3D-Kultursystemen, in denen diese in einem Tropfen von Medium suspendiert und mit fluoriertem Ethylenpropylen (FEP; einem Copolymer von Hexafluorpropylen und Tetrafluorethylen) Pulverpartikeln verkapselt sind, um Mikrobioreaktoren (Liquid Marbles, LM) zu bilden. LM sind eine Form von 3D-Bioreaktor, die zuvor gezeigt haben, dass unter anderem das Wachstum von lebenden Mikroorganismen37, Tumorspheroide38 und embryonale Stammzellen39unterstützen. LMs wurden auch erfolgreich für Schaf-Eizellenkultur40verwendet. In den meisten Experimenten mit LMs wurden Bioreaktoren mit Polytetrafluorethylen (PTFE) Pulverbett mit einer Partikelgröße von 1 m41hergestellt. Das vorgestellte Protokoll verwendet FEP, das in Zusammensetzung und Eigenschaften den Fluorpolymeren PTFE sehr ähnlich ist. Aber FEP ist leichter formbar und weicher als PTFE und was besonders wichtig ist, ist es hochtransparent.
Beide 3D-Systeme erhalten die gasförmige In-vitro-Kulturumgebung. Sie erhalten auch die COCs 3D-Organisation, indem sie ihre Abflachung und daraus resultierende Störung von Spaltknoten verhindern und ihre funktionelle Beziehung zwischen der Eizelle und den umgebenden Follikelzellen erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Fähigkeit, das In-vitro-Wachstum nicht nur der Eizelle, sondern auch der sie umgebenden Cumuluszellen aufrechtzuerhalten und gleichzeitig seine Reifung zu unterstützen, ist äußerst wichtig für die erfolgreichen assistierten Reproduktionstechnologien und für die Förderung des Verständnisses somatischer Zell-Oozyten-Wechselwirkungen, insbesondere bei Arten, die einem längeren Follikelwachstum wie Menschen oder Schweinen leben. Kontinuierlich verbesserte IVM-Techniken werden immer nützlicher Werkzeug, um Fortp…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind sehr dankbar für: dr Waclaw Tworzydlo (Department of Developmental Biology and Invertebrate Morphology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Jagiellonian University) für technische Einrichtungen in TEM; an Frau Beata Snakowska (Abteilung für Endokrinologie, Institut für Zoologie und Biomedizinische Forschung, Jagiellonen-Universität) für technische Hilfe; an die Abteilung für Zellbiologie und Bildgebung, Institut für Zoologie und Biomedizinische Forschung, Jagiellonian University, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokio, Japan). Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium 2018/29/N/NZ9/00983 vom National Science Centre Poland unterstützt.
Materials
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm – EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
Referenzen
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