הידרוג'לים אלג'ינאט מפורקים ופרוטאוליטית ומיקרוביו-סיבה לאנקלוסציה של פורצין אוציט
Summary
מוצגים כאן שני פרוטוקולים לתחינה של ציטים שונים בתנאי תרבות תלת-מידוד. בתחילה, קומפלקסים cumulus-oocyte (COCs) הם עטוף חרוזים fibrin-אלגינט. בשנייה, הם מוקפים פלואורציה אתילן פרופילן אבקת חלקיקי (microbioreactors). שתי המערכות מבטיחות תנאים אופטימליים לשמירה על ארגון תלת-מיוד.
Abstract
בביולוגיה של הרבייה, מהפכת הביוטכנולוגיה שהחלה עם הפריה מלאכותית וטכנולוגיה להעברת עוברים הובילה לפיתוח טכניקות רבייה בסיוע כגון oocyte בהברה חוץ גופית (IVM), הפריה חוץ גופית (IVF) שיבוט של בעלי חיים ביתיים על ידי העברה גרעינית מתא סומטי. IVM היא השיטה בעלת משמעות מיוחדת. זוהי טכנולוגיית הפלטפורמה לאספקת oocytes בוגר, באיכות טובה עבור יישומים כגון צמצום מרווח הדור מינים חשובים מבחינה מסחרית או בסכנת הכחדה, מחקר לגבי רבייה אנושית חוץית, וייצור של בעלי חיים טרנסגניים עבור טיפולים בתא. המונח איכות oocyte כולל את יכולתה להשלים התבגרות, להיות מופרית, ובכך לגרום צאצאים בריאים. משמעות הדבר היא כי oocytes באיכות טובה הם בעלי חשיבות עליונה עבור הפריה מוצלחת כולל הליכי הפריה חוץ גופית. זה מציב קשיים רבים לפתח שיטת תרבות אמינה שתתמוך בצמיחה לא רק של oocytes אנושיים, אלא גם של מינים גדולים אחרים של יונקים. הצעד הראשון בIVM הוא תרבות המבחנה של oocytes. עבודה זו מתארת שני פרוטוקולים לתרבות תלת-מית-מית של ציטים שונים. הראשון, מודל 3D cumulus-oocyte מתחמים (COCs) הם עטוף ברשת חרוז פיברין-אלגינט interחדירה, שבו תערובת של פיברין אלגינט הם ג’ל בו זמנית. בשנייה, COCs מושעים בטיפה של בינוני ועטוף עם פרופילן אתילן פלואורין (FEP; קופולימר של הקספלואורופרופילן וטטטרפלואורואתילן) חלקיקי אבקה כדי ליצור microbioreactors המוגדרים גולות נוזלי (LM). שתי מערכות תלת-מית שומרות על הגזים בסביבת תרבות המבחנה. הם גם מחזיקים בארגון תלת-מיתד COCs על-ידי מניעת שיטוחם ושיבוש כתוצאה מכך של צמתים של פערים, ובכך שומרים על הקשר הפונקציונלי בין האוציט, לבין תאי הזקיקים שמסביב.
Introduction
הפיתוח של מערכות תרבות שונות, כולל אלה תלת מימדי (3D), שמטרתו לספק תנאים אופטימליים לצמיחה והתבגרות של oocytes מבודד מן הזקיקים גם בשלבים המוקדמים ביותר של פיתוח. זה הוא בעל חשיבות רבה עבור טכניקות רבייה בסיוע (ART), במיוחד לאור המספר ההולך וגדל של נשים הנאבקות עם פוריות לאחר טיפול בסרטן1. התבגרות של oocytes בתנאי חוץ גופית (IVM) היא כבר טכניקה מבוססת היטב המשמשת בעיקר עבור יצירת עובר חוץ גופית לצורך רבייה בעלי חיים2. עם זאת, ברוב המינים היונקים, גם אם שיעור גבוה של התבגרות של קומפלקסים cumulus-oocyte (COCs) ניתן להשיג (טווח 60 עד 90 %)3, היכולת ההתפתחותית שלהם עדיין אינה מספקת לצרכים. הסיבה לכך היא הפיתוח של zygotes שהושגו באופן כזה אפילו עד שלב blastocyst הוא נמוך ולאחר ההעברה לבעלי חיים חלופיים הכדאיות שלהם לטווח מצטמצם. כתוצאה מכך, יש צורך להגדיל את היכולת ההתפתחותית של עוברים שהתקבלו מoocytes שהיו נתונים להליך IVM4. לכן, מדיה התבגרותחדשה 5 נמצאים בתכנון ותקופות שונות של תרבות המבחנהנבדקים 6,7 יחד עם תוספי מדיה תרבות עם גורמי גדילהשוניםמולקולות 8,9.
הצעד הראשון של כל מערכת IVM מלאה הוא ליצור תנאים אופטימליים לצמיחה בת קיימא של oocytes במהלך תרבות המבחנה. הצמיחה oocyte הוא אחד האינדיקטורים הספציפיים של היכולת של oocyte לחדש meiosis10,11. בנוסף, oocyte המתאים במערכת תרבות המבחנה חייב להיות מסוגל לתמוך התבגרות גרעינית שלה בידול cytoplasmic12. מורפולוגיה של קומפלקס cumulus-oocyte הוא אינדיקטור חשוב נוסף המשמש במרפאות ART כדי לבחור את oocyte הטוב ביותר עבור השלבים הבאים של הפריה חוץ גופית (הפריה חוץ גופית) הליך בבניאדם ובעלי חיים 12,,13. בין המאפיינים המורפולוגיים של COCs נחשבים: קוטר oocyte, גרגר ציטופלסמה שלה ושלמות גוףהקוטב הראשון 14,15. חוץ מזה, הפוטנציאל ההתפתחותי oocyte הוא בקורלציה המראה והדחיסה של תאי קומולוס ומספר השכבות שלהם סביב oocyte. חשוב מאוד עבור oocyte המתאים במערכת תרבות המבחנה היא גם התחזוקה של תאי oocyte-cumulus אינטראקציות נאותות ויציבות ציטוסקלטון16,17,18,,19. עד כה, במבחנה oocyte צמיחה בתוך COCs אנושי הוכח20. השימוש COCs הפרה הביא גם עם לידות חיות. אלה היו מבודדים זקיקי שחלות ילדותיים ולאחר מכן תרבותי במשך 14 ימים עד oocyte היה גדול מספיק כדי לעבור את הליך הפריהחוץ גופית 21. באופן דומה, COCs מבודד זקיקי בבון אנטרל, נתון IVM לאחר בתרבות המבחנה הניב oocytes מסוגל לתחל מחדש meiosis לשלב metaphase II עם מבנה ציר מופיענורמלי 22. עם זאת, במחקר זה המחברים לא מנסים להפרות אותם. עם זאת, תוצאות כאלה מצביעות על כך שהליך דומה יכול להיות מיושם לא רק על מינים יונקים מסוימים אלה, אלא גם על תסביכים אנושיים cumulus-oocyte שהושגו זקיקים מה צריך לאפשר להשיג oocytes באיכות טובה מתאים טכניקת הפריה חוץ גופית מוצלחת.
התוצאות המתוארות לעיל הושגו עם יישום של פרוטוקולי IVM קונבנציונליים שבמהלכם oocytes היו תרבותיים במערכות דו מימדיות (2D). ההליך השגרתי במערכות תרבות דו-מית-מידיות מכסה את ה-oocytes, השקוע בטיפה של אמצעי תקשורת תרבותיים מתאימים,עם שמן מינרלי 23,24. ההנחה היא כי כיסוי שמן במהלך תרבות oocyte במבחנה משמש כדי למנוע אידוי נוזלי, ובכך להבטיח את התחזוקה של pH תקין ולחץ אוסמוטי בתרבות. למרות מערכת תרבות 2D כזה מאפשר להשיג, אפילו עד 87% של oocytes חזיר בוגר25, הוכח כי כיסוי שמן מינרלי גורם דיפוזיה משמעותית של חומרים מסיסים שומנים אשר נחוצים לפיתוח oocytesנכון 26. בנוסף, בגלל סטרואידים (פרוגסטרון ואסטרוגנים) דיפוזיה לתוך שמן מינרלי במהלך תרבות oocyte, עיכוב של התבגרות גרעינית וצמצום בהישג כשירות התפתחותית של oocytes חזיר נצפתה. הדבר עלול לגרום להשגת מספר קטן של זיגוטים, אשר בנוסף מאופיינים בקיבולת התפתחותית נמוכה לשלב של blastocyst ועל ידי קיימא ירודה לאחר העברה לבעלי חיים נמען27. לכן, נעשות ניסיונות להגביר את היכולת ההתפתחותית של עוברים הנגזרים מoocytes שהתקבלו לאחר הליך IVM, על ידי יצירת תנאים אופטימליים להשגת בגרות הן צטופלסמית והן בגרות גרעינית של oocytes תרבותי יחד עם CCs כמו קומפלקסים, במיוחד באמצעות מערכות תלת מימדיות (3D). 3D חדשניים שונים במערכות תרבות המבחנה פותחו בשני העשורים האחרונים28,29. אלה נועדו לשמור על הארגון המרחבי הטבעי של תאים ולהימנע שיטוח שלהם במנות תרבות מה לא ניתן להשיג בתרבויות הדו-מיD המסורתיות. ניתן להבטיח את הפעילות המבנית והפונקציונלית של COCs תרבותיים על ידי תחזוקת הארכיטקטורה המתאימה שלהם ותקשורת ללא הפרעה באמצעות צמתים בין תאיםשונים 30. התאמת ביו-פיגומים עבור 3D בתרבות המבחנה של קומפלקסים cumulus-oocyte הוערך באמצעות חומרים ביולוגיים טבעיים כגון רכיבים שונים של מטריצה חוץ תאית (ECM; קולגן וחומצה היאלורונית)31 או פולימרים אינרטיים (אלגינט)32. ניסיונות אלה שנבדקו במספר מינים הביאו לתוצאות מבטיחות מבחינת חידוש אוציט מיוזיס והשגת יכולתם המלאה33,34,35. עם זאת, עד כה, לא פותחה מערכת תלת-מית-מית-מית-מית-מז”ד המתאימה לבגרות COCs המבודדת מבעלי חיים ביתיים גדולים, כולל חזירים.
עבודה זו מתארת שני פרוטוקולים שניתן להשתמש בהם עבור תרבות תלת-מית-די של COCs של פורצ’ין. הפרוטוקול הראשון מתאר אנקפולציה בחרוזי פיברין-אלג’ינאט (FAB). FAB יכול להיווצר על ידי ערבוב בו זמנית של תמיסת אלגנאט ופיברין, אשר עוברים תהליך ג’לציה סינכרונית. שילוב זה מספק סביבה מכנית דינמית מכיוון ששני הרכיבים תורמים לקשיחות מטריצה. פתרון דומה שימש בעבר עבור תרבות זקיק השחלות בעכבר והתבגרות36. במקרה של הפרוטוקול המוצג, כדי למנוע השפלה מוקדמת של רשת אלגנאט-פיברין, נעשה שימוש בריכוזים גבוהים יותר של תמיסת סידן כלוריד, המבטיח תהליך ג’לציה מהירה ויציבה. הסביבה המכנית הדינמית יוצרת תנאים דומים לאלה בסביבה התוך-זקיקית הטבעית שבה שוכנים COCs וגדלים. בנוסף, העבודה מציגה תוצאות מייצגות של מערכות תרבות 3D COCs, שבו אלה מושעים בטיפה של בינוני ועטוף עם פרופילן אתילן פלואוריציה (FEP; קופולימר של הקספלואורופרופילן וטטרופלואוראתילן) חלקיקי אבקה, כדי ליצור microbioreactors (גולות נוזליות, LM). LM הם צורה של bioreactor 3D שהופעמי בעבר לתמוך, בין היתר, צמיחה של מיקרואורגניזמיםחיים 37, סרטניםסרטניים 38 ותאי גזעעובריים 39. LMs שימשו בהצלחה גם לתרבות הכבשים40. ברוב הניסויים באמצעות LMs, ביו-כופתים הוכנו באמצעות פוליטקטרפלואורואתילן (PTFE) אבקת מיטה עם גודל חלקיקים של 1 μm41. הפרוטוקול המוצג משתמש FEP, אשר דומה מאוד קומפוזיציה ומאפיינים PTFE fluoropolymers. אבל FEP הוא יותר קל לצורה ורך יותר PTFE ומה חשוב במיוחד, זה שקוף מאוד.
שתי מערכות תלת-מית שומרות על הגזים בסביבת תרבות המבחנה. הם גם שומרים על ארגון תלת-מיתד COCs על ידי מניעת שיטוח שלהם ושיבוש כתוצאה של צמתים פער, שמירה על הקשר הפונקציונלי שלהם בין oocyte ותאי זקיק שמסביב.
Protocol
Representative Results
Discussion
היכולת לשמור על צמיחה במבחנה לא רק של oocyte אלא גם של תאי קומולוס המקיפים אותו ובו זמנית תמיכה התבגרותו היא חיונית ביותר עבור טכנולוגיות הרבייה בסיוע מוצלח תקדם את ההבנה של תא סומטי / oocyte אינטראקציות במיוחד מינים העוברים צמיחה זקיקים ממושכת כגון בני אדם או חזירים. טכניקות IVM משופרות ללא הרף ה…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אסירי תודה: ד”ר Waclaw Tworzydlo (המחלקה לביולוגיה התפתחותית ומורפולוגיה חרת חוליות, המכון לזואולוגיה ומחקר ביו רפואי, אוניברסיטת Jagiellonian) עבור מתקנים טכניים ב TEM; לגב’ ביאטה סנקווסקה (המחלקה לאנדוקרינולוגיה, המכון לזואולוגיה ומחקר ביו-רפואי, האוניברסיטה הג’יג’יבלונית) לקבלת סיוע טכני; למחלקה לביולוגיה והדמיה של תאים, המכון לזואולוגיה ומחקר ביו-רפואי, אוניברסיטת ג’יג’ילוניאן, JEOL JEM 2100HT (JEOL, טוקיו, יפן). עבודה זו נתמכה על ידי מענק 2018/29/N/NZ9/00983 ממרכז המדע הלאומי פולין.
Materials
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm – EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
Referenzen
- Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
- Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
- Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
- Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
- Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
- You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613 (2012).
- Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
- Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
- Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
- Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
- de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
- Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
- Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Entwicklungsbiologie. 226 (2), 167-179 (2000).
- Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Albertini, D. F., Barrett, S. L. Oocyte-somatic cell communication. Reproduction. Supplement. 61, 49-54 (2003).
- Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
- Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
- Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
- Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
- Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
- Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
- Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
- Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
- Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
- Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
- Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
- Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
- Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
- Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709 (2015).
- Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
- Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
- Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
- Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Ooi, C. H., Nguyen, N. T. Manipulation of liquid marbles. Microfluid Nanofluid. 19, 483-495 (2015).
- Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
- Eppig, J. J., O’Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
- Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
- Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biologie. 6, 35-57 (2017).
- Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695 (2011).
- Aussillous, P., Quere, D. Liquid Marbles. Nature. 411, 924-927 (2001).
- Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
- Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
- Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F., Turksen, K. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. , 291-299 (2017).
