ポルシン卵母細胞カプセル化のためのタンパク質分解アルギン酸ヒドロゲルおよび疎水性マイクロバイオリアクター
Summary
ここでは、3D培養条件でのブタ卵母細胞のカプセル化のための2つのプロトコルを示します。第1に、cumulus-oocyte複合体(COC)はフィブリンアルギン酸ビーズにカプセル化される。第2に、フッ素化エチレンプロピレン粉末粒子(マイクロバイオリアクター)で封入される。両システムは、3D組織を維持するために最適な条件を保証します。
Abstract
生殖生物学では、人工授精と胚移植技術から始まったバイオテクノロジー革命は、卵母細胞体中体育(IVM)、体外受精(IVF)、体細胞からの核移動による家畜のクローニングなどの補助生殖技術の開発につながった。IVMは特に重要な方法です。商業的に重要な種や絶滅危惧種の生成間隔の短縮、ヒトの生体内再生に関する研究、細胞療法用トランスジェニック動物の生産など、用途向けの成熟した良質の卵母細胞を供給するプラットフォーム技術です。卵母細胞の品質という用語は、成熟を完了する能力を含み、受精させ、それによって健康な子孫を生じる。これは、IVF手順を含む受精を成功させるためには、良質の卵母細胞が最も重要であることを意味する。これは、ヒトの卵母細胞だけでなく、他の大型哺乳類種の成長を支える信頼性の高い培養方法を開発するのに多くの困難をもたらす。IVMの最初のステップは、卵母細胞のインビトロ培養です。この研究は、ブタ卵母細胞の3D培養のための2つのプロトコルを記述する。第1に、3Dモデルの積雲卵母細胞複合体(COC)は、フィブリンとアルギン酸の混合物を同時にゲル化するフィブリン-アルギン酸ビーズ補間ネットワークにカプセル化される。第2の1では、COCは培地の滴下に懸濁され、フッ素化エチレンプロピレン(FEP;ヘキサフルオロプロピレンとテトラフルオロエチレンの共重合体)粉末粒子を封入し、液体大理石(LM)と定義されるマイクロバイオリアクターを形成する。両3Dシステムは、気体インビトロ培養環境を維持します。また、平坦化とギャップ接合の崩壊を防止することでCOCs3D組織を維持し、卵母細胞と周囲の卵胞細胞との機能的関係を維持します。
Introduction
三次元(3D)を含む様々な培養システムの開発は、発達の初期段階であっても卵胞から分離された卵子の成長と成熟のための最適な条件を提供することを目的としています。これは、特に癌治療後に不妊症に苦しんでいる女性の増加を考慮して、生殖補助技術(ART)にとって非常に重要である1。インビトロ条件下での卵母細胞の成熟(IVM)は、家畜再生を目的として主にインビトロ胚生成に主に使用される確立された技術である2。しかし、ほとんどの哺乳類種では、cumulus-oocyte複合体(COC)の成熟率が高くても(範囲は60〜90%)3であり、その発達3能力は依然としてニーズに不十分である。これは、このような方法で得られた接合体の発達が、胚盤胞期までも低く、代理動物への移管後に、その生存率が期間に低下するためである。その結果、IVM手順4を行った卵母細胞から得られる胚の発達能力を高める必要がある。したがって、新しい成熟培地5が考案され、インビトロ培養の様々な期間が、種々の成長因子および分子8、9を有する培養培地の補充と共に86、7に9試験される。67
完全なIVMシステムの最初のステップは、インビトロ培養中に卵母細胞の持続可能な成長のための最適な条件を作成することです。卵母細胞の成長は、卵母細胞が重症10,11,11を再開する能力の特定の指標の1つである。さらに、適切な卵母細胞の体液培養系は、その核成熟および細胞質分化12を支持することができる必要がある。積雲卵母細胞複合体の形態は、ヒトおよび家畜12、13,13における体外受精(IVF)処置の後続のステップのための最良の卵母細胞を選択するためにARTクリニックで使用されるもう一つの重要な指標である。考慮されるCOCsの形態学的特徴の中には、卵母細胞径、その細胞質顆粒化および第1極体の完全性14、15,15がある。また、卵母細胞の発達ポテンシャルは、cumulus細胞の外観と圧縮と、卵母細胞を取り囲むそれらの層の数と相関している。適切な卵母細胞のインビトロ培養システムにとって非常に重要なのは、卵母細胞-cumulus細胞の適切な相互作用および細胞骨格安定性16、17、18、1917,18,19の維持である。16これまでのところ、ヒトCOC内のインビトロ卵母細胞の成長は20.牛のCOCの使用はまた、出生をもたらした。これらは、未熟な卵巣卵胞から単離され、その後、卵母細胞がIVF手順21を受けるのに十分な大きさになるまで14日間培養した。同様に、ヒヒのアンタル卵胞から分離されたCOCは、インビトロ培養後にIVMを行い、正常に現れる紡錘構造22を有する転移II段階に微細化を生じることができる卵母細胞を得た。しかし、この研究では、著者はそれらを受精しようとしませんでした。それにもかかわらず、このような結果は、これらの特定の哺乳類種だけでなく、正常なIVF技術に適した良質の卵母細胞を得ることを可能にする必要がある卵胞から得られるヒト積雲卵母細胞複合体にも同様の手順を適用できることを示している。
上記の結果は、卵母細胞を2次元(2D)系で培養した従来のIVMプロトコルの適用で得られた。2D培養システムにおけるルーチン手順は、卵母細胞をカバーし、適切な培養培地の一滴に浸漬し、鉱物油23、24,24を用いた。インビトロ卵母細胞培養中のオイルオーバーレイは液体の蒸発を防ぐ役割を果たし、培養中の適切なpHおよび浸透圧の維持を保証するものと仮定されます。このような2D培養システムは、成熟豚卵母細胞25の87%までも得ることができるが、ミネラルオイルオーバーレイが適切な卵母細胞の開発26に必要な脂質溶性物質の実質的な拡散を引き起こすことが証明されている。さらに、卵母細胞培養中にステロイド(プロゲステロンおよびエストロゲン)が鉱油に拡散するため、核成熟の遅れ及び豚卵母細胞の発達能力の低下が観察された。これは、少数のザイゴテを得ることをもたらし、さらに、胚盤胞の段階への発達能力が低く、レシピエント動物27に移された後の生存率が低いことを特徴とする。そこで、IVM処置後に受け取った卵母細胞に由来する胚の発達能力を高める試みがなされており、特に3次元(3D)系を用いて、Cと共に培養した卵母細胞の細胞質および核成熟度の両方を達成するための最適な条件を作り出す。さまざまな革新的な3Dインビトロ培養システムは、過去20年間で開発されました28,,29.これらは、細胞の自然な空間的組織を維持し、伝統的な2D培養では達成できない培養料理の平坦化を避けるために設計されました。培養されたCOCsの構造的および機能的活動は、それらの適切なアーキテクチャの維持と、様々な区画30間のギャップ接合を介した妨げのない通信によって保証することができる。積雲-卵母細胞複合体の3Dインビトロ培養に対するバイオスキャフォールドの適合性は、細胞外マトリックス(ECM;コラーゲンおよびヒアルロン酸)31または不活性ポリマー(アルギン酸)31の様々な成分などの天然生体材料を用いて評価されている。いくつかの種でテストされたこれらの試みは、卵母細胞の明治と完全な能力の達成の面で有望な結果をもたらしました33,,34,,35.しかし、これまで、豚を含む大型家畜から分離されたCOCs成熟に適した3Dシステムは開発されていない。
この研究は、ブタCOCの3D培養に使用できる2つのプロトコルを説明しています。第1のプロトコルは、フィブリンアルギン酸ビーズ(FAB)におけるカプセル化について説明する。FABは、同期ゲル化プロセスを経たアルギン酸溶液とフィブリン溶液を同時に混合することによって形成することができる。この組み合わせは、両方のコンポーネントがマトリックスの剛性に寄与するため、動的な機械的環境を提供します。同様の溶液は、マウス卵巣卵胞培養および成熟36のために以前に使用されてきた。提示されたプロトコルの場合、アルギン酸フィブリンネットワークの早期劣化を避けるために、適切に高濃度の塩化カルシウム溶液が使用され、迅速かつ安定したゲル化プロセスを確保する。動的な機械環境は、COCが存在し、サイズが増加する自然な卵胞内環境で、これらと同様の条件を作成します。さらに、この研究は、これらが培地の滴下に懸濁され、フッ素化エチレンプロピレン(FEP;ヘキサフルオロプロピレンとテトラフルオロエチレンの共重合体)粉末粒子で封入されたCOC3D培養システムの代表的な結果を示し、マイクロバイオリアクター(液体マーブル、LM)を形成する。LMは、以前に支持することが示された3Dバイオリアクターの形態であり、とりわけ、生きている微生物37、腫瘍スフェロイド38 および胚性幹細胞39の増殖。また、羊の卵母細胞培養40にも使用されています。LMsを用いたほとんどの実験では、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)粉末ベッドを1μm41の粒子サイズで作製したバイオリアクターを作製した。提示されたプロトコルは、フルオロポリマーPTFEと組成および特性において非常に類似しているFEPを使用する。しかし、FEPはPTFEよりも簡単に形成でき、柔らかく、特に重要なのは、非常に透明です。
両3Dシステムは、気体インビトロ培養環境を維持します。また、卵母細胞と周囲の濾胞細胞との機能的関係を維持しながら、平坦化とギャップ接合の崩壊を防ぐことでCOC 3D組織を維持します。
Protocol
Representative Results
Discussion
卵母細胞だけでなく、それを取り巻くcumulus細胞の成長を維持し、同時にその成熟を支える能力は、生殖技術の成功と、特にヒトや豚などの長引く濾胞性成長を受けている種における体細胞/卵母細胞相互作用の理解を促進するために非常に不可欠である。継続的に改善されたIVM技術は、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)、早期卵巣不全、または決定的な不妊症(腫瘍療法)の場合に生殖オプションを維持…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、TEMの技術施設に関して、ワクロー・ツーィドロ博士(ジャギエロニア大学動物学・生物医学研究所発生生物学・無脊椎動物形態学科)に非常に感謝しています。ベアタ・スナコフスカ氏(ジャギエロン大学動物学生物医学研究所内分泌学科)に技術支援を依頼する。ジャギヨニアン大学動物生物学・生物医学研究所細胞生物学・イメージング学科(日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本日本)にJEOL JEM 2100HTこの研究は、ポーランド国立科学センターからの助成金2018/29/N/NZ9/00983によって支えられた。
Materials
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm – EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
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