Протеолитически деградированных альгинат гидрогели и гидрофобных микробиореакторов для инкапсуляции порцина Ооцита
Summary
Здесь представлены два протокола инкапсуляции свиных яйцеклеток в условиях 3D культуры. Во-первых, кумулятивно-ооцитные комплексы (КОК) инкапсулируются фибрино-альгинатным бисером. Во втором, они заключены с фторированными частицами порошка этилена пропилена (микробиореакторы). Обе системы обеспечивают оптимальные условия для поддержания их 3D-организации.
Abstract
В репродуктивной биологии биотехнологическая революция, начатая с искусственного оплодотворения и технологии переноса эмбрионов, привела к разработке вспомогательных методов воспроизводства, таких как созревание яйцеклеток в пробирке (IVM), экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) и клонирование домашних животных путем ядерной передачи из соматических клеток. IVM является методом, особенно значение. Это платформа технологии для поставок зрелых, хорошего качества яйцеклеток для таких приложений, как сокращение интервала генерации в коммерчески важных или находящихся под угрозой исчезновения видов, исследования, касающиеся воспроизводства человека в пробирке, и производство трансгенных животных для клеточной терапии. Термин oocyte качество включает в себя его компетенцию для завершения созревания, быть оплодотворены, тем самым в результате здорового потомства. Это означает, что яйцеклетки хорошего качества имеют первостепенное значение для успешного оплодотворения, включая процедуры ЭКО. Это создает много трудностей для разработки надежного метода культуры, который будет поддерживать рост не только человеческих яйцеклеток, но и других крупных видов млекопитающих. Первым шагом в IVM является культура in vitro яйцеклеток. В этой работе описаны два протокола для 3D-культуры свиных ооцитов. Во-первых, 3D-модель кумулятивно-ооцитных комплексов (COCs) инкапсулированы в фибрино-альгинатной сети между бисером, в которой смесь фибрина и альгината гелеобразуется одновременно. Во втором, COCs приостановлены в капле среднего и инкапсулируется с фторированным этилен пропиленом (FEP; кополимер гексафторопропилена и тетрафторэтилена) порошковых частиц для формирования микробиореакторов определяется как жидкие мраморы (LM). Обе 3D-системы поддерживают газоэкутную культурную среду in vitro. Они также поддерживают 3D-организацию COC, предотвращая их уплощение и последующее нарушение разрывных соединений, тем самым сохраняя функциональную связь между яйцеклеткой и окружающими фолликулярными клетками.
Introduction
Развитие различных культурных систем, в том числе трехмерных (3D), направлено на создание оптимальных условий для роста и созревания яйцеклеток, изолированных от фолликулов даже на самых ранних стадиях развития. Это имеет большое значение для вспомогательных репродуктивных методов (АРТ), особенно в связи с увеличением числа женщин, которые борются с бесплодием после лечения рака1. Созревание яйцеклеток в условиях in vitro (IVM) уже является устоявшейся техникой, в основном используемой для выработки эмбрионов in vitro с целью воспроизводстваскота 2. Однако, в большинстве видов млекопитающих, даже если высокие темпы созревания кумуляций-ооцитов комплексов (COCs) могут быть достигнуты (диапазон от 60 до 90 %)3, их компетенции в области развития по-прежнему недостаточно для нужд. Это связано с тем, что развитие зиготов, полученных таким образом, даже до стадии бластоцист низкой, а после передачи в суррогатных животных их жизнеспособность снижается. Следовательно, необходимо повысить компетентность в развитии эмбрионов, полученных из яйцеклеток, которые подверглись процедуре IVM4. Таким образом, новые средства созревания5 в настоящее время разработаны и различные периоды культуры in vitroпроверяются 6,7 наряду с добавкой культуры средств массовой информации с различнымифакторами роста и молекул 8,9.
Первым шагом любой полной системы IVM является создание оптимальных условий для устойчивого роста яйцеклеток во время культуры in vitro. Рост яйцеклеток является одним из специфических показателей способности яйцеклетки возобновить мейоз10,,11. Кроме того, соответствующая система культуры oocyte in vitro должна быть способна поддерживать ее ядерное созревание и цитоплазмическую дифференциацию12. Морфология кумулятивно-ооцитного комплекса является еще одним важным показателем, используемым в клиниках АРТ для выбора лучшего яйцеклетки для последующих шагов процедуры экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) улюдей и скота 12,13. Среди морфологических характеристик COCs рассмотрены: диаметр яйцеклетки, его цитоплазма гранулирования и первойполярной целостности тела 14,15. Кроме того, потенциал развития яйцеклеток коррелирует с появлением и уплотнением кучевых клеток и количества их слоев, окружающих яйцеклетку. Очень важным для соответствующей системы культуры oocyte in vitro также является поддержание клеток ооцита-кумула надлежащего взаимодействия ицитоскелет стабильности 16,17,18,19. До сих пор, в пробирке ооцитов роста в организме человека COCs былопродемонстрировано 20. Использование коровьих КОК также привело к живорождению. Они были изолированы от незрелых фолликулов яичников, а затем культурировали в течение 14 дней, пока яйцеклетка была достаточно большой, чтобы пройтипроцедуру ЭКО 21. Аналогичным образом, COCs изолированы от бабуина антралятивных фолликулов, подвергаются IVM после в пробирке культуры дали ооцитов, способных повторного мейоза на стадии метафазы II с нормальным появлением прядильнуюструктуру 22. Однако в этом исследовании авторы не пытались оплодотворить их. Тем не менее такие результаты свидетельствуют о том, что аналогичная процедура может быть применена не только к этим конкретным видам млекопитающих, но и к человеческим кумулятиво-ооцитным комплексам, полученным из фолликулов, что должно позволить получить яйцеклетки хорошего качества, подходящие для успешной техники ЭКО.
Вышеупомянутые описанные результаты были получены с применением обычных протоколов IVM, в ходе которых яйцеклетки были культуры в двумерных (2D) системах. Обычная процедура в системах 2D культуры охватывает яйцеклетки, погруженные в каплю соответствующих культурных средств массовой информации, сминеральным маслом 23,24. Предполагается, что наложение масла во время экстракорпорального ооцита культуры служит для предотвращения испарения жидкости, обеспечивая тем самым поддержание надлежащего рН и осмотического давления в культуре. Хотя такая система 2D культуры позволяет получить, даже до 87% зрелых свиней ооцитов25, было доказано, что наложение минерального масла вызывает существенное распространение липидных растворимых материалов, которые необходимы для надлежащего развития яйцеклеток26. Кроме того, из-за стероидов (прогестерона и эстрогенов) диффузии в минеральное масло во время культуры яйцеклеток наблюдалась задержка ядерного созревания и снижение компетентности в развитии свиноводных яйцеклеток. Это может привести к получению небольшого количества зиготов, которые дополнительно характеризуются низкой способностью развития к стадии бластоцист и плохой жизнеспособностью после передачи в реципиентживотных 27. Поэтому предпринимаются попытки повысить компетенцию эмбрионов в области развития, полученных из яйцеклеток, полученных после процедуры IVM, путем создания оптимальных условий для достижения как цитоплазмической, так и ядерной зрелости яйцеклеток, культурных вместе с ХК как комплексов, особенно с использованием трехмерных (3D) систем. Различные инновационные 3D в пробирке культуры системы были разработаны в течение последнихдвух десятилетий 28,29. Они были разработаны для поддержания естественной пространственной организации клеток и для того, чтобы избежать их уплощения в культурных блюдах, чего нельзя достичь в традиционных 2D культурах. Структурная и функциональная деятельность культурных COCs может быть обеспечена путем поддержания их надлежащей архитектуры и спокойной связи через разрыв-соединения между различнымиотсеками 30. Пригодность био-лесов для 3D-культуры в пробирке кумулятивно-ооцитных комплексов была оценена с использованием природных биоматериалов, таких как различные компоненты экстра-клеточной матрицы (ECM; коллаген и гиалуроноваякислота) 31 или инертных полимеров(альгинат) 32. Эти попытки, опробованные в нескольких видах, принесли многообещающие результаты с точки зрения возобновления мейозаяйцеклеток и достижения их полной компетентности 33,,34,,35. Однако до сих пор не было разработано 3D-системы, пригодной для созревания КОК, изолированной от крупных домашних животных, включая свиней.
В этой работе описаны два протокола, которые могут быть использованы для 3D культуры свиных COCs. Первый протокол описывает инкапсуляцию фибрино-альгинатных бусин (FAB). FAB может быть сформирован путем одновременного смешивания альгината и фибрина раствор, которые проходят синхронный процесс гелизации. Эта комбинация обеспечивает динамическую механическую среду, поскольку оба компонента способствуют жесткости матрицы. Аналогичное решение было использовано ранее для мыши яичников фолликула культуры и созревания36. В случае представленного протокола, чтобы избежать преждевременной деградации сети альгинат-фибрина, используются соответственно более высокие концентрации раствора хлорида кальция, обеспечивая быстрый и стабильный процесс гелеобразования. Динамическая механическая среда создает условия, аналогичные тем, которые находятся в естественной внутриясной среде, в которой находятся КОК, и увеличиваются в размерах. Кроме того, в работе показаны репрезентативные результаты систем 3D культуры COC, в которых они подвешены в капле среднего и инкапсулированы фторированным этиленовым пропиленом (FEP; кополимер гексафторопропилена и тетрафторэтилена) частицами порошка, чтобы сформировать микробиореакторы (жидкие мраморы, ЛМ). LM являются одной из форм 3D биореактора, которые ранее были показаны для поддержки, среди прочего,рост живых микроорганизмов 37, опухолевыхсфероидов 38 и эмбриональных стволовыхклеток 39. LMs также успешно используются для овцы ооцитов культуры40. В большинстве экспериментов с использованием LMs, биореакторы были подготовлены с использованием политетрафторэтилена (PTFE) порошковое ложе с размером частиц 1мкм 41. В представленном протоколе используется FEP, который очень похож по составу и свойствам на фторполимеры PTFE. Но FEP является более легко формируемым и мягче, чем PTFE и что особенно важно, это очень прозрачно.
Обе 3D-системы поддерживают газоэкутную культурную среду in vitro. Они также поддерживают 3D-организацию COCs, предотвращая их уплощение и последующее нарушение разрывных соединений, сохраняя их функциональную связь между яйцеклеткой и окружающими фолликулярными клетками.
Protocol
Representative Results
Discussion
Способность поддерживать рост в пробирке не только яйцеклетки, но и кучевых клеток, окружающих его и одновременно поддерживая его созревание, чрезвычайно важна для успешных вспомогательных репродуктивных технологий и для содействия пониманию взаимодействия соматических клеток/ооци…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы очень благодарны: д-р Вацлав Tworzydlo (департамент биологии развития и беспозвоночных морфологии, Институт зоологии и биомедицинских исследований, Ягеллонский университет) для технических объектов в ТЕМ; г-же Беатой Снаковской (департамент эндокринологии, Институт зоологии и биомедицинских исследований Ягеллонского университета) за техническую помощь; на кафедру клеточной биологии и визуализации, Институт зоологии и биомедицинских исследований, Ягеллонский университет, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Токио, Япония). Эта работа была поддержана грантом 2018/29/N/N’9/00983 от Национального научного центра Польши.
Materials
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm – EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
Referenzen
- Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
- Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
- Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
- Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
- Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
- You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613 (2012).
- Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
- Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
- Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
- Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
- de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
- Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
- Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Entwicklungsbiologie. 226 (2), 167-179 (2000).
- Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Albertini, D. F., Barrett, S. L. Oocyte-somatic cell communication. Reproduction. Supplement. 61, 49-54 (2003).
- Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
- Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
- Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
- Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
- Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
- Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
- Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
- Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
- Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
- Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
- Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
- Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
- Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
- Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709 (2015).
- Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
- Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
- Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
- Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
- Ooi, C. H., Nguyen, N. T. Manipulation of liquid marbles. Microfluid Nanofluid. 19, 483-495 (2015).
- Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
- Eppig, J. J., O’Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
- Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
- Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biologie. 6, 35-57 (2017).
- Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695 (2011).
- Aussillous, P., Quere, D. Liquid Marbles. Nature. 411, 924-927 (2001).
- Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
- Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
- Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F., Turksen, K. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. , 291-299 (2017).
