Idrogel alginato degradati proteolylylylyd e microbioreattori idrofobici per l'incapsulamento dell'Oocito Porcine
Summary
Qui presentati sono presentati due protocolli per l’incapsulamento di oociti di porcina in condizioni di coltura 3D. Nel primo, i complessi cumuli-oocici (COC) sono incapsulati in perline fibrin-alginate. Nel secondo, sono racchiusi con particelle di polvere di propilene di etilene fluorrinate (microbioreattori). Entrambi i sistemi garantiscono condizioni ottimali per mantenere la propria organizzazione 3D.
Abstract
Nella biologia riproduttiva, la rivoluzione biotecnologica iniziata con l’inseminazione artificiale e la tecnologia di trasferimento degli embrioni ha portato allo sviluppo di tecniche di riproduzione assistita come la maturazione in vitro di ovociti (IVM), la fecondazione in vitro (IVF) e la clonazione di animali domestici mediante trasferimento nucleare da cellule somatiche. IVM è il metodo particolarmente significativo. È la tecnologia di piattaforma per la fornitura di oociti maturi e di buona qualità per applicazioni quali la riduzione dell’intervallo di generazione in specie commercialmente importanti o in via di estinzione, la ricerca sulla riproduzione umana in vitro e la produzione di animali transgenici per terapie cellulari. Il termine qualità degli oociti include la sua competenza per completare la maturazione, essere fecondato, con conseguente prole sana. Ciò significa che gli oociti di buona qualità sono di primaria importanza per la fecondazione di successo, comprese le procedure di fecondazione in vitro. Ciò pone molte difficoltà a sviluppare un metodo di coltura affidabile che sosterrebbe la crescita non solo degli ovociti umani, ma anche di altre grandi specie di mammiferi. Il primo passo in IVM è la coltura in vitro degli ovociti. Questo lavoro descrive due protocolli per la coltura 3D degli oociti di porcina. Nel primo, i complessi cumuli-oocici modello 3D (COC) sono incapsulati in una rete interpenetrata di perline fibrin-alginate, in cui una miscela di fibrina e alginato viene gelata contemporaneamente. Nel secondo, i COC sono sospesi in una goccia di media e incapsulati con propileti di etilene fluorro (FEP; un copolimero di exafluoropropylene e tetrafluoroetilene) particelle di polvere per formare microbioreattori definiti come marmi liquidi (LM). Entrambi i sistemi 3D mantengono l’ambiente gassoso della coltura in vitro. Mantengono inoltre l’organizzazione 3D dei COC impedendone l’appiattimento e la conseguente interruzione delle giunzioni gap, preservando così la relazione funzionale tra l’ociocite e le cellule follicolari circostanti.
Introduction
Lo sviluppo di vari sistemi di coltura, compresi quelli tridimensionali (3D), mira a fornire condizioni ottimali per la crescita e la maturazione degli oociti isolati dai follicoli anche nelle prime fasi di sviluppo. Questo è di grande importanza per le tecniche di riproduzione assistita (ART), soprattutto in considerazione del crescente numero di donne che stanno lottando con l’infertilità dopo il trattamento delcancro 1. La maturazione degli ovociti in condizioni in vitro (IVM) è già una tecnica consolidata utilizzata principalmente per la generazione di embrioni in vitro ai fini della riproduzione del bestiame2. Tuttavia, nella maggior parte delle specie di mammiferi, anche se è possibile raggiungere alti tassi di maturazione dei complessi cumuli-oocici (COC) (intervallo da 60 a 90 %)3, la loro competenza di sviluppo è ancora inadeguata alle esigenze. Questo perché lo sviluppo degli zigoti ottenuti in modo tale anche fino allo stadio di blastocisti è basso e dopo il trasferimento in animali surrogati la loro vitalità a termine è ridotta. Di conseguenza, è necessario aumentare la competenza di sviluppo degli embrioni ottenuti da ovociti sottoposti alla procedura IVM4. Pertanto, nuovi mezzi dimaturazione 5 sono in fase di escogitazione e vengono testati vari periodi di coltura in vitro6,7 insieme al completamento dei mezzi di coltura con vari fattori di crescita e molecole8,9.
Il primo passo di qualsiasi sistema IVM completo è quello di creare condizioni ottimali per la crescita sostenibile degli ovociti durante la coltura in vitro. La crescita degli oocid è uno degli indicatori specifici della capacità dell’oocid di riprendere la meiosi10,11. Inoltre, un adeguato sistema di coltura in vitro deve essere in grado di sostenere la sua maturazione nucleare e la differenziazione citoplasmica12. La morfologia del complesso cumulus-oocid è un altro indicatore importante utilizzato nelle cliniche ART per selezionare il miglior ovocito per le successive fasi della fecondazione in vitro (IVF) procedura negli esseri umani e bestiame12,13. Tra le caratteristiche morfologiche dei COC considerati sono: il diametro degli oocici, la sua granulazione del citoplasma e la prima integrità del corpo polare14,15. Inoltre, il potenziale di sviluppo degli oocati è correlato all’aspetto e alla compattazione delle cellule cumuli e al numero dei loro strati che circondano l’ociocita. Molto importante per l’appropriato sistema di coltura in vitro di oociti è anche il mantenimento delle cellule oocite-cumulus interazioni corrette e la stabilità del citoscheletro16,17,18,19. Finora, la crescita degli oocici in vitro all’interno dei COC umani è stata dimostrata20. L’uso di COC di mucca ha portato anche a nascite vive. Questi sono stati isolati dai follicoli ovaiosi immaturi e poi colture per 14 giorni fino a quando l’ovocita era sufficientemente grande per sottoporsi alla procedura di fecondazionein vitro 21. Allo stesso modo, i COC isolati dai follicoli antrali del babbuino, sottoposti a IVM dopo che la coltura in vitro ha prodotto ovociti in grado di reinizializzare la meiosi allo stadio metafsie II con una normale struttura del mandrinoche appare 22. Tuttavia, in questo studio gli autori non hanno cercato di fertilizzarli. Tuttavia tali risultati indicano che una procedura simile potrebbe essere applicata non solo a queste specie di mammiferi particolari, ma anche a complessi umani cumuli-oociti ottenuti dai follicoli ciò che dovrebbe consentire di ottenere oociti di buona qualità adatti per una tecnica di fecondazione in vitro di successo.
I risultati descritti sopra sono stati ottenuti con l’applicazione di protocolli IVM convenzionali durante i quali gli ovociti sono stati colturati in sistemi bidimensionali (2D). La procedura di routine nei sistemi di coltura 2D copre gli oociti, immersi in una goccia di un supporto di coltura appropriato, con oliominerale 23,24. Si presume che una sovrapposizione di olio durante la coltura degli ovociti in vitro serva a prevenire l’evaporazione del liquido, garantendo così il mantenimento di un corretto pH e pressione osmotica nella coltura. Anche se un tale sistema di coltura 2D permette di ottenere, anche fino all’87% degli oociti di suini maturi25, è stato dimostrato che la sovrapposizione dell’olio minerale provoca una sostanziale diffusione di materiali lipidi solubili che sono necessari per un corretto sviluppo degli oociti26. Inoltre, a causa di steroidi (progesterone ed estrogeni) diffusione nell’olio minerale durante la coltura di ovociti, un ritardo della maturazione nucleare e la riduzione nella realizzazione di competenza dello sviluppo di ovociti di maiale è stato osservato. Ciò può comportare l’ottenimento di un piccolo numero di zigoti, che inoltre sono caratterizzati da bassa capacità di sviluppo allo stadio della blastocisti e da scarsa vitalità dopo il trasferimento negli animali destinatari27. Pertanto, si sta cercando di aumentare la competenza di sviluppo degli embrioni derivati dagli ovociti ricevuti dopo la procedura IVM, creando condizioni ottimali per raggiungere sia la maturità citoplasmica che nucleare degli ovociti ristrutti insieme ai CC come complessi, in particolare utilizzando sistemi tridimensionali (3D). Negli ultimi due decenni sono stati sviluppati vari sistemi innovativi di coltura in vitro 3D28,29. Questi sono stati progettati per mantenere l’organizzazione spaziale naturale delle cellule e per evitare il loro appiattimento nei piatti di coltura ciò che non può essere raggiunto nelle culture 2D tradizionali. L’attività strutturale e funzionale dei COC coltura può essere assicurata dal mantenimento della loro corretta architettura e dalla comunicazione indisturbata attraverso svincoli tra i varicompartimenti 30. L’idoneità delle bio-scaffold per la coltura in vitro 3D di complessi cumuli-oocici è stata valutata utilizzando biomateriali naturali come vari componenti della matrice extracellulale (ECM; collagene e acido ialuronico)31 o polimeri inerti (alginato)32. Questi tentativi testati in diverse specie hanno portato risultati promettenti in termini di ripresa della meiosi ooccia e realizzazione della loro piena competenza33,34,35. Tuttavia finora non è stato sviluppato alcun sistema 3D adatto alla maturazione di COC isolato da grandi animali domestici, compresi i suini.
Questo lavoro descrive due protocolli che possono essere utilizzati per la coltura 3D dei COC dei porci. Il primo protocollo descrive l’incapsulamento in perline fibrin-alginate (FAB). IL FAB può essere formato mescolando simultaneamente una soluzione di alginato e fibrina, che subisce un processo di gelazione sincrona. Questa combinazione fornisce un ambiente meccanico dinamico perché entrambi i componenti contribuiscono alla rigidità della matrice. Una soluzione simile è stata utilizzata in precedenza per la coltura e la maturazione dei follicoliovaioli del topo 36. Nel caso del protocollo presentato, per evitare la degradazione prematura della rete alginata-fibrina, vengono utilizzate concentrazioni opportunamente più elevate di soluzione di cloruro di calcio, garantendo un processo di gelazione veloce e stabile. L’ambiente meccanico dinamico crea condizioni simili a queste nell’ambiente intra-follicolare naturale in cui risiedono i COC e aumentano di dimensioni. Inoltre, il lavoro mostra i risultati rappresentativi dei sistemi di coltura 3D COC, in cui questi sono sospesi in una goccia di media e incapsulati con propilene di etilene fluorrerato (FEP; un copolimero di particelle di polvere di esafluoropropilene e tetrafluoroetilene), per formare microbioreattori (Marmi liquidi, LM). LM sono una forma di bioreactor 3D che sono stati precedentemente indicati per sostenere, tra gli altri, la crescita di microrganismiviventi 37, sferoidi tumorali38 e cellule staminali embrionali39. LM sono stati utilizzati con successo anche per la cultura degli ovocitiovini 40. Nella maggior parte degli esperimenti con LM, i bioreattori sono stati preparati utilizzando il letto in polvere di politetrafluoroetilene (PTFE) con dimensioni di particelle di 1 m41. Il protocollo presentato utilizza FEP, che è molto simile nella composizione e nelle proprietà ai fluoropolimeri PTFE. Ma FEP è più facilmente formabile e più morbido di PTFE e ciò che è particolarmente importante, è altamente trasparente.
Entrambi i sistemi 3D mantengono l’ambiente gassoso della coltura in vitro. Mantengono inoltre l’organizzazione 3D dei COC impedendo la loro appiattimento e la conseguente interruzione delle giunzioni gap, preservando la loro relazione funzionale tra l’ociocite e le cellule follicolari circostanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacità di mantenere la crescita in vitro non solo dell’oocito, ma anche delle cellule cumuli che la circondano e contemporaneamente sostenere la sua maturazione è estremamente essenziale per le tecnologie di riproduzione assistita di successo e per promuovere la comprensione delle interazioni cellulare/oocite somatiche soprattutto nelle specie che subiscono una crescita follicolare prolungata come gli esseri umani o i maiali. Tecniche IVM continuamente migliorate stanno diventando uno strumento utile per preservar…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono molto grati a: Dr Waclaw Tworzydlo (Dipartimento di Biologia dello Sviluppo e Morfologia Invertebrata, Istituto di zoologia e ricerca biomedica, Università Jagiellonian) per strutture tecniche in TEM; beata Snakowska (Dipartimento di Endocrinologia, Istituto di zoologia e ricerca biomedica dell’Università jagielloniana) per assistenza tecnica; al Dipartimento di Biologia Cellulare e Imaging, Istituto di zoologia e ricerca biomedica, Università Jagielloniana, JEOL JEM 2100HT (JEOL, Tokyo, Giappone). Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzione 2018/29/N/N/N/00983 dal National Science Centre Polonia.
Materials
| General | |||
| Antibiotic Antimycotic (100x) 100ml | Thermo Fisher | 15240062 | 2.5% final concentration for Handling Medium. 1% in PBS (step 1.2) |
| DMEM/F12 (500ml) | Sigma-Aldrich | D8062 | Handling and Maturation Medium |
| DPBS (w/o Ca, Mg), 1x, 500ml | Thermo Fisher | 14190144 | |
| FCS (100 ml) | Thermo Fisher | 16140063 | 10% final concentration for both Handling Medium and Maturation Medium. (steps: 1.5. 2.6.) |
| PBS (1x, pH 7.4) 500ml | Thermo Fisher | 10010023 | |
| TBS Stock Solution (10x, pH 7.4) 500 ml | Cayman Chemicals | 600232 | 1x final concentration. Other brand can be use |
| Maturation Medium | |||
| hCG (1 VIAL of 10 000 U) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| PMSG | BioVendor | RP1782721000 | |
| Fibrin-alginate beads | |||
| Alginate Lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | (Step 2.11.1) |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T9326-150UN | (Step 2.1) |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | (Step 2.1) |
| Fibrinogen (250mg) | Sigma-Aldrich | F3879 | (Step 2.2) |
| Sodium Alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | (Step 2.3) use for alginate solution |
| Liquid Marble | |||
| FEP | Dyneon GmbH 3M AdMD | A-66670 | |
| Morphological examination | |||
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher | L3224 | (Step 4.1.) Emitted fluorescence: 494 nm for calcein, 528 nm for EthD-1; measure: 517 nm for calcein, 617 nm – EthD-1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium |
| Ultrastructure examination | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G5882 | 2.5% final concentraion (Step 4.2.1.) |
| LR White resin | Sigma-Aldrich | L9774 | (Step 4.2.4.) |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | (Step 4.2.5.) |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | O5500 | (Step 4.2.3.) |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | Use for preparing 0.1M sodium cacodylate buffer (pH 7.2) |
| Uranyl Acetate | POCH | 868540111 | (Step 4.2.4.) |
| Specific instruments, tools | |||
| 30 mm Pteri dish | TPP | 93040 | |
| 60 mm IVF Petri dish | Falcon | 353653 | |
| Ez-Grid Premium Cell Handling Pipettor | RI Life Sciences | 8-72-288 | |
| Ez-Tip | RI Life Sciences | 8-72-4155/20 | |
| Heating Table | SEMIC | Other brands can be used | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC-PE | Other brands can be used |
| Sterile petri dish (10 cm) | NEST Biotechnology | 704002 | |
| Sterile syringe filters with 0.2 µm | GOOGLAB SCIENTIFIC | GB-30-022PES | |
| Thermos | Quechua | 5602589 | Other brands can be used |
Referenzen
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