Summary
我们描述了三种生成具有分形特性的 Ln1 聚合物的方法，与未聚合的 Ln1 相比，这些聚合物向细胞发出的信号不同。
Abstract
层粘连蛋白-111 （Ln1） 是上皮、肌肉和神经系统中细胞外基质的重要组成部分。我们之前已经证明，Ln1的微观结构改变了它向细胞发出信号的方式，这可能是因为Ln1组装到网络中暴露了不同的粘附结构域。在该协议中，我们描述了三种生成聚合Ln1的方法。
Introduction
与生长因子或细胞因子不同，细胞外基质 （ECM） 蛋白可以组装成结构网络。由于ECM功能障碍是许多疾病的关键因素，因此细胞从ECM组成、微观结构和生物力学中感知和转导信号的机制是治疗开发的有吸引力的靶标。越来越多的证据表明，这些网络的微观结构在这些蛋白质如何向细胞发出信号方面起着重要作用。迄今为止，ECM 微观结构与细胞功能之间的这种联系已在胶原 I1、纤连蛋白2 和纤维蛋白3 中得到证明。
层粘连蛋白-111 （Ln1） 是一种三聚体十字形蛋白质，是细胞外基质的关键结构成分，可接触上皮细胞4、肌肉细胞5 和神经细胞6。在乳腺中，Ln1 是乳腺上皮细胞功能分化为产奶细胞所必需的 7,8,9，Ln1 对于诱导肿瘤逆转至关重要 10,11。Ln1 和其他层粘连蛋白是肌肉中皮质肌动蛋白网络和肌节组织发育所必需的12,13，以及神经细胞迁移和神经突生长13 所必需的。因此，了解层粘连蛋白向细胞发出信号的机制是一个活跃的研究领域。
Ln1 包含多种受体的多个粘附结构域，包括整合素、突聚糖、肌营养不良聚糖、LBP-110 和 LamR（图 1A）4,14。含有层粘连蛋白 α1 的 c 末端球状结构域的 E8 片段是结合抗肌萎缩聚糖和整合素 α6β1 和 α3β115 所必需的，并且是上皮细胞功能分化所必需的15,16。相比之下，短臂显示出不同的生物活性17，这意味着在网络形成后识别这些不同Ln1结构域的可用性可以改变细胞行为。
我们最近证明，排列成聚合物网络的 Ln1 表现出分形特性（即在多个长度尺度上自相似的结构）18。与缺乏这种排列的 Ln1 相比，分形网络对上皮细胞发出的信号不同19。该分形网络表示特定的组装结构，其中长臂优先暴露于单元18。由于这种不同的长臂显示，上皮细胞经历功能分化为产奶细胞，具有组织良好的紧密连接和肌动蛋白应力纤维的抑制 19。
我们描述了从短臂-短臂结合相互作用中生成 Ln1 网络的 3 种方法，这些方法显示了 Ln1 长臂的高显示：1） 通过与酸性缓冲液的无细胞组装，2） 通过与糖蛋白共孵育，或 3） 通过与细胞表面抗肌萎缩聚糖的相互作用。这三种方法通过三种截然不同的机制产生相似的层粘连蛋白微观结构，从而在实验设计中具有灵活性。先前的研究表明，这三种方法可以代表生物学的稳健性：在乳腺上皮细胞中，细胞表面抗肌萎缩聚糖、糖蛋白或人工结构的层粘连蛋白都可以诱导功能分化19。因此，研究人员可以根据研究对象在这些方法之间进行选择：表达抗肌萎缩聚糖的细胞对 Ln-1 微观结构不敏感，因为细胞膜中的抗肌萎缩聚糖诱导正确的聚合成分形网络19,20。基质凝胶是层粘连蛋白和糖蛋白的混合物21，代表了Ln-1最经济的来源，并提供了诱导抗肌萎缩聚糖敲除乳腺细胞分化所需的微观结构20，但含有具有批次间变异性的复杂蛋白质混合物。PolyLM 代表了提供此功能的最干净、最还原的系统，但与Matrigel 19 相比，诱导乳腺细胞分化的成本更高，功效更低。
这三种方法具有扩散限制聚集的分形网络结构特征18,19，并且与多个实验系统中的聚集层粘连蛋白相比，显示出生物活性的改变22,23,24,25。使用这些方法的未来研究可以识别上皮分化所需的受体和信号传导，并确定在异常微环境20（例如肿瘤）中恢复细胞中的正常细胞-基质相互作用。
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Protocol
1. 解冻和等分试样层粘连蛋白-111
注意：纯化的层粘连蛋白-111 可在市面上买到（通常从作为基质出售的 EHS 基质中纯化），但并非所有来源都能提供完整、未降解的蛋白质。
- 通过获取 Ln1 和运行尺寸排阻色谱26 或聚丙烯酰胺凝胶电泳26 确认 Ln1 未降解。变性 Ln1 应具有 337 kDa、197 kDa 和 177 kDa 的条带，而天然 Ln1 应具有 711 kDa 的单条带。
- 在冰箱中将 Ln1 在冰上解冻过夜，并使用低蛋白结合尖端和无菌技术等分到低蛋白结合微量离心管中（通常以 100 μg/管等分试样进行培养覆盖，或 10 μg 用于包被）27。冷冻等分试样并储存在-80°C。
2. 使用低pH缓冲液进行层粘连蛋白聚合
- 制备polyLM聚合缓冲液：称取1 mM CaCl2 和20 mM乙酸钠在超纯水中混合。然后使用HCl或乙酸将pH调节至4.0。通过0.2μm过滤器进行无菌过滤，并储存在4°C。
- 制备对照聚合缓冲液：混合 1 mM CalCl2 和 20 mM Tris，并根据需要使用 10 N HCl 或 12 N NaOH 将 pH 调节至 7.0。通过0.2μm过滤器进行无菌过滤，并储存在4°C。
注意：协议可以在此处暂停。 - 在冰箱中解冻所需数量的 Ln-1 等分试样过夜。
- 使用无菌细胞培养技术，将适当的缓冲液（步骤2.1中的polyLM聚合缓冲液或步骤2.2中的对照聚合缓冲液）加入到终浓度为100μg/ mL的层粘连蛋白等分试样中（即向50μg等分试样中加入0.5mL），并通过移液轻轻混合。
- 如果使用荧光标记的层粘连蛋白进行可视化，则重新配制并以 1：50 wt/wt 的比例加入（例如 2 μg/100 μg），并通过移液轻轻混合。
注意：如果使用层粘连蛋白作为细胞附着的底物，请按照步骤2.6-2.8操作： - 在适当的缓冲液中稀释后，立即将层粘连蛋白转移到培养塑料或玻璃器皿上，并在37°C的细胞培养箱中孵育过夜。 请注意，涂覆盖玻片时，加入足够大的体积以产生平衡液滴（通常，13 mm圆形盖玻片使用50μL），并在37°C的加湿室中保存过夜。
- 使用无菌技术27，用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤。
- 小心地取出液体。不要让表面完全干燥。
注意：如果使用层粘连蛋白覆盖细胞以诱导牛奶蛋白，请按照步骤2.9-2.12操作： - 培养乳腺上皮细胞。在补充有 2% FBS、0.01 mg/mL 胰岛素、0.005 μg/mL EGF、0.05 mg/mL 庆大霉素和 0.05 g/mL 正霉素的 DMEM-F12 中培养 MepG 抗肌萎缩聚糖敲入 （DgKI） 或 MepG 抗肌萎缩聚糖敲除细胞 （DgKO）。
- 在孔板或盖玻片底部培养皿中以 10,500 个细胞/cm2 的速度接种用于层粘连蛋白刺激的 DgKO 和 DgKI 细胞
- 将稀释的层粘连蛋白在37°C的细胞培养箱中孵育30分钟。
- 将polyLM等分试样以2,000× g 离心20分钟，但由于蛋白质实体的尺寸较小，并且需要更高的速度才能有效收集，因此在20,000× g 的中性pH下离心LM20分钟。
- 使用无菌技术27，轻轻除去上清液，并重悬于补充有3μg/mL催乳素，2.8μM氢化可的松和5μg/mL胰岛素的适当体积的DMEM-F12诱导培养基中
- 立即将层粘连蛋白转移到细胞培养基中以刺激细胞。我们已经成功地用50-800μg/mL Ln1刺激细胞
3. 使用分离的糖蛋白进行层粘连蛋白聚合
- 将重组 nidogen-1 和 Ln1 在冰箱中的冰上轻轻解冻过夜。
- 使用低蛋白结合尖端和试管并使用无菌技术，在细胞培养基中以 1：1 wt/wt 的比例将 Ln1 与 nidogen-1 混合。使用细胞培养基中的纯 Ln1 作为对照。
- 如果使用荧光标记的层粘连蛋白进行可视化，则以 1：50 wt/wt 的比例（例如，2 μg/100 μg）复溶并添加。用移液器轻轻混合。
- 在37°C的细胞培养箱中孵育Ln1-nidogen或对照Ln130分钟。
- 将Ln1-nidogen共聚物以2,000× g 离心30分钟，将对照Ln1以20,000× g 离心30分钟。
- 轻轻除去上清液并重悬于细胞培养基中，终浓度为 100-800 μg 总蛋白/mL。
- 立即用于刺激细胞，或转移到盖玻片上，并在37°C湿润的细胞培养箱中粘附过夜。
- 从盖玻片中取出培养基，用 1x PBS 洗涤盖玻片，然后在室温下用 10% 福尔马林（即 4% 甲醛在 PBS 中）固定 15 分钟。
4. 使用抗肌萎缩聚糖表达细胞的层粘连蛋白聚合
- 培养乳腺上皮细胞。在补充有 2% FBS、0.01 mg/mL 胰岛素、0.005 μg/mL EGF、0.05 mg/mL 庆大霉素和 0.05 g/mL 正霉素的 DMEM-F12 中培养 MepG 抗肌萎缩聚糖敲入 （DgKI） 或 MepG 抗肌萎缩聚糖敲除细胞 （DgKO）。
- 由于生长速率的差异，以 5,000 个细胞/cm2 接种 DgKI 细胞，以 8,000 个细胞/cm2 接种 DgKO 细胞。在37°C湿润培养箱中培养，每2-3天更换一次培养基，每4-5天使用严格的无菌技术传代一次。使用血细胞计数器或自动细胞计数器27 仔细计数细胞，以确保适当的生长速率。
- 在孔板或盖玻片底部培养皿中以 10,500 个细胞/cm2 的强度接种用于层粘连蛋白刺激的细胞并培养 2 天，使用 DgKI 细胞产生分形 Ln1 和 DgKO 细胞作为阴性对照。在冰箱中将 Ln-1 在冰上轻轻解冻过夜，然后与补充有 3 μg/mL 催乳素、2.8 μM 氢化可的松和 5 μg/mL 胰岛素的 DMEM-F12 诱导培养基混合。对于 35 mm 培养皿，使用 1 mL 含有 50-800 μg Ln1 的诱导培养基。
- 如果使用荧光 Ln1，则以 50：1 wt/wt 的比例混合。
- 从细胞中取出培养基，并用补充有 3 μg/mL 催乳素、2.8 μM 氢化可的松和 5 μg/mL 胰岛素的 DMEM-F12 层粘连蛋白和诱导培养基覆盖
- 培养细胞 2 天，然后用 10% 福尔马林固定。
5. 通过光学显微镜表征层粘连蛋白微观结构
- 收集固定样品，并在室温下用1x PBS洗涤3次5分钟。
- 在室温下，用0.5%Triton X-100,3%牛血清白蛋白，10%山羊血清和40μg/ mL抗小鼠阻断抗体片段在1x PBS中封闭和透化样品1小时。
注意： Triton X-100 是危险的。戴上手套和护目镜进行处理并妥善处理。 - 将稀释度为1：100的抗层粘连蛋白抗体与1x PBS与0.5%Triton X-100和3%BSA混合，并在室温下或在4°C下在加湿室中加入样品2小时（通常使用底部带有湿实验室湿巾的尖端盒）。
- 取出一抗，用 1x PBS 和 0.5% Triton X-100 和 3% BSA 洗涤 3 次。
- 在含有0.5%Triton X-100和3%BSA的1x PBS样品中以1：500的稀释度向样品中加入适当的二抗，并在室温下在加湿室中避光孵育。
- 去除二抗，用 1x PBS 和 0.5% Triton X-100 和 3% BSA 洗涤 3 次。
- 对于含有细胞的样品，加入 6 μM 鬼笔环肽 45 分钟，然后用含有 0.5% Triton X-100 和 3% BSA 的 PBS 洗涤 3 次，然后用 PBS 洗涤 3 次。然后用 0.1 μg/mL DAPI 在 PBS 中染色 5 分钟。
- 如果合适，可以挂载样品。
- 使用高分辨率共聚焦显微镜对 ln-1 结构进行成像。使用配备浸没物镜的激光扫描显微镜（水浸复消色差计40X/1.1NA或油浸复消色差计63X/1.4NA）。
6. 通过盒数维度表征层粘连蛋白结构
- 使用 Matlab 工具箱或 ImageJ 中提供的箱计数维度算法分析分形属性。这些方法对层粘连蛋白的图像进行阈值测量，并在对数对数上绘制含有 Ln1 的盒数与盒的大小。这些参数之间关系的斜率是盒数维数：非分形几何的维数为 0、1 或 2，而分形几何的非整数维数为28。
注意：酸处理、糖蛋白处理和 DgKI 细胞附着的 Ln1 的盒计数分形维数均为 ~1.7，而对照 Ln1 的分形维数为 2.0。
7. 通过电子显微镜表征层粘连蛋白构建体
- 将层粘连蛋白重悬于细胞培养基中，并在潮湿的37°C环境中吸附到二氧化硅晶片上90分钟。
- 将基质固定在 pH 7.2 的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中的 2.5% 戊二醛中。
注意：戊二醛是危险的，应在通风橱中处理，并戴上手套和护目镜，并作为危险废物处理。 - 在pH 7.2的0.1M二甲胂酸钠缓冲液中的1%四氧化锇中建立后缀基质。
注意： 四氧化锇是危险的，应在通风橱中处理，并戴上手套和护目镜，并妥善处理。二甲胂酸盐是危险的，应在通风橱中处理，并戴上手套和护目镜，并妥善处理。 - 在pH 7.2的二甲胂酸钠缓冲液中洗涤3次。
- 随着乙醇浓度的增加而脱水。
- 溅射涂层基质上一层薄薄的金。
- 使用扫描电子显微镜进行图像处理。
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Representative Results
层粘连蛋白-111是一种三聚体蛋白，在其短臂末端具有三个自组装结构域（图1A）。如果处理得当，短臂可以聚合成六边形晶格（图1B，1C），在更大的空间尺度上显示出扩散限制的聚集体分形特性（图2）。在含钙的中性pH缓冲液中孵育的层粘连蛋白形成用抗Ln1抗体可视化的小聚集体（图2A），其盒计数分形维数为~2，表明没有分形性。相反，在含钙的pH 4缓冲液（图2B）或与nidogen-1的中性缓冲液（图2C）中孵育的Ln1形成分形维数为~1.7的空间填充花边网络（图3）。用表达抗肌萎缩聚糖的细胞培养的Ln1形成类似的花边网络（图2D，插图显示细胞核）。
当 pH7Ln 和 polyLM 以越来越高的分辨率使用 SEM 成像时，微观结构的差异变得更加明显。在低分辨率下（图2Ei和v），与pH7-Ln相比，polyLM网络看起来更分散，而在高分辨率下，pH7-Ln聚集体明显（图2E iv），而在高分辨率下，polyLM中可以看到扩散的六边形晶格（图2E viii）。
图1：Ln1的背景和聚合方法： 答：Ln1 是一种复杂的三聚体蛋白，具有多个粘附结构域（注意到受体结合位点），可以结合多种整合素和非整合素受体（黑色），并通过短臂-短臂结合（棕褐色）形成聚合物网络。B：Ln1 在钙离子和低 pH 值、糖蛋白（如 nidogen-1）或细胞表面抗营养聚糖存在下可以形成六边形晶格。C：聚合Ln1的SEM示例图像，显示六边形晶格和提出的Ln1组装模型。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：Ln1 聚合的代表性数据。 答：Ln1 在含有钙的中性缓冲液中聚集。当使用抗 Ln1 抗体观察时，可以看到小聚集体。B：Ln1在含酸性钙的缓冲液中聚合成polyLM，呈现分形性质。C：Ln1-nidogen-1混合物（1：1 wt/wt）形成相似的聚合物。D：覆盖在抗肌萎缩聚糖表达细胞上的中性缓冲细胞培养基中的 Ln1 显示出类似的花边网络。插图：显示细胞形态的核复染。E：pH7-Ln和polyLM网络的扫描电子显微镜（自旋法），分辨率不断提高。在pH7-Ln中，低分辨率扫描（i和ii）显示相对紧凑的纤维，在高分辨率扫描中分解为聚集体（iii）。相同浓度的polyLM分布更广（iv&v），高分辨率扫描显示六边形空间填充晶格（vii）。F：这种微观结构变化导致 DgKO 乳腺上皮细胞在功能上分化为产奶细胞19。i：pH7-Ln 刺激的细胞显示出丰富的肌动蛋白应激纤维（红色）和含有紧密连接的杂乱无章的 zo-1（绿色），而 ii：polyLM 刺激的细胞含有较少的总丝状肌动蛋白，肌动蛋白横向定位到细胞-细胞边界和组织良好的 zo-1 含有紧密连接。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：使用盒计数方法进行分形维数估计。 A&B：pH7-Ln和polyLM的原始图像显示形态差异。C&D：对这些图像进行阈值以产生黑白图像，E&F：然后计算包含图像的框数与框大小之比的对数。平均斜率表示计算的箱计数维度 Fd。pH7-Ln 的特征维度为 2.0，表明没有分形特性，而 polyLM 的维度为 ~1.7，表明扩散限制聚集过程。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
层粘连蛋白是上皮、肌肉和神经器官系统中ECM的关键元素，在体外已被证明在调节细胞功能分化中起着重要作用。越来越多的证据表明，向细胞展示的层粘连蛋白结构调节其信号传导和由此产生的细胞表型15,16，因此控制 Ln1 微观结构的方法应该对在这些领域工作的基础生物学家以及寻求概括体外正常行为的组织工程师感兴趣。更一般地说，已知各种细胞外基质蛋白的微观结构调节生物反应，了解微观结构调节细胞功能的机制是一个活跃的研究领域。
在这项工作中，我们描述了三种将层粘连蛋白聚合成具有扩散限制聚集特征的分形微观结构的网络的方法。与聚集的 Ln1 相比，这些 Ln1 聚合物已被证明对细胞发出的信号不同，这可能是由于细胞的粘附结构域显示改变。这三种控制Ln1微观结构的方法可能代表了Ln1组装中的生物冗余，但这对实验工作提出了挑战。使用酸性缓冲液处理控制 Ln1 微观结构仅在添加到抗肌萎缩聚糖敲除细胞中时才会显示效果19,20。因此，实验设计必须考虑要使用的细胞和Ln1的纯度。市售的 Ln1 通常来源于 EHS 基质，其中含有高比例的 nidogens 和其他糖蛋白;EHS 基质中的 Ln1 在中性缓冲系统中正确聚合成分形网络。重组 Ln1 最近已上市，但价格异常昂贵。
Ln1 蛋白质量对于这项工作至关重要，因为短臂片段会阻断聚合。短臂片段（即E4片段）干扰网络形成，因为每个片段在网络29中诱导一个空隙。先前的数据表明，包含 E4 片段可以阻断 Ln1 诱导的表型29,30。同样，我们发现网络形成被少量层粘连蛋白-332（未发表的数据）破坏，与E4片段一样，它包含单个粘附结构域29,30。因此，在开始工作之前，检查 Ln1 是否完整并高度纯化以去除其他层粘连蛋白物种至关重要。
虽然这些方法与研究细胞-基质相互作用的研究人员有关，但应该注意的是，层粘连蛋白家族非常复杂，涉及 15 个已知成员和其他剪接变体31，并且该家族与多种受体、糖蛋白、胶原蛋白和潜在的生长因子相互作用4。因此，聚合的 Ln1 代表了一种还原状态，可以预期它会被细胞功能迅速修饰。此外，不同的器官系统以不同的方式感知、响应和重塑层粘连蛋白：我们已经证明，层粘连蛋白通过肌萎缩聚糖与肌动蛋白的连接对于乳腺是可有可无的 19，而肌萎缩聚糖对于肌细胞功能是绝对必要的32。
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Disclosures
这项工作由劳伦斯利弗莫尔国家实验室在美国能源部的主持下根据合同DE-AC52-07NA27344进行。IM 版本 LLNL-JRNL-799443。
Acknowledgments
这项工作由劳伦斯利弗莫尔国家实验室LDRD 18-ERD-062（C.R.）资助。感谢 John Muschler 赠送的 DgKO 和 DgKI 细胞。感谢加州大学伯克利分校电子显微镜实验室的工作人员在电子显微镜样品制备和数据收集方面提供的建议和帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Anti-Laminin primary antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody | Thermo | A32731 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 or similar | |
| Cell Culture Incubator | Thermo | Heracell 150 or similar | |
| Centrifuge for microcentrifuge tubes | Eppendorf | 5418 or similar | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 or equivalent | |
| Coverslips | Thermo | 25CIR-1 or similar | |
| DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red | Thermo | 11330107 | |
| EGF (Epidermal Growth Factor) | Sigma Aldrich | 11376454001 | |
| Fluorescently Labeled Laminin | Cytoskeleton Inc | LMN02 | |
| Gentamicin | VWR | VWRV0304-10G | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 or similar | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888-5G | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 16634-50mg | |
| MepG Dystroglycan Knockout Cells | LBNL | N/A | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 or similar | |
| Normocin | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma Aldrich | 75633 | |
| Ovine Prolactin | Los Angeles Biomedical Research Institute | Ovine Pituitary Prolactin | |
| Phalloidin | Thermo | A22287 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo | 10010023 or similar | |
| Purified Laminin-111 | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| Recombinant human Nidogen-1, carrier free | R&D systems | 2570-ND-050 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | S2889 or similar | |
| Sodium Cacodylate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Sterile filters | Millipore | SLGP033RS or similar | |
| Tris | Sigma Aldrich | 252859 or similar | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Ultra-low protein binding tubes | VWR | 76322-516, 76322-522 or similar | |
| Ultrapure water | Thermo | 15230253 or similar |
References
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