Summary
Descrevemos três métodos para gerar polímeros Ln1 com propriedades fractais que sinalizam para as células de forma diferente em comparação com Ln1 não polimerizado.
Abstract
A laminina-111 (Ln1) é parte essencial da matriz extracelular nos epitélios, sistemas muscular e neural. Nós demonstramos anteriormente que a microestrutura de Ln1 altera a maneira como ele sinaliza para as células, possivelmente porque a montagem de Ln1 em redes expõe diferentes domínios adesivos. Neste protocolo, descrevemos três métodos para gerar Ln1 polimerizado.
Introduction
Ao contrário dos fatores de crescimento ou citocinas, as proteínas da matriz extracelular (MEC) podem se agrupar em redes estruturais. Como a disfunção da MEC é um elemento-chave de muitas condições de doença, os mecanismos pelos quais as células detectam e transduzem sinais da composição, microestrutura e biomecânica da MEC são alvos atraentes para o desenvolvimento terapêutico. Evidências crescentes sugerem que a microestrutura dessas redes desempenha um papel importante em como essas proteínas sinalizam para as células. Até o momento, essa ligação entre a microestrutura da MEC e a função celular tem sido demonstrada para colágeno I1, fibronectina2 e fibrina3.
A laminina-111 (Ln1) é uma proteína trimérica, em forma de cruz, que é um componente estrutural chave da matriz extracelular que entra em contato com células epiteliais4, células musculares5 e células neurais6. Na glândula mamária, o Ln1 é necessário para a diferenciação funcional das células epiteliais da glândula mamária em células produtoras de leite7,8,9, e o Ln1 é crucial para a indução da reversão tumoral 10,11. Ln1 e outras lamininas são necessárias para o desenvolvimento de redes corticais de actina e organização do sarcolema no músculo12,13, e para migração de células neurais e crescimento de neuritos13 . Assim, compreender os mecanismos pelos quais a laminina sinaliza para as células é uma área ativa de pesquisa.
Ln1 contém múltiplos domínios adesivos para uma ampla gama de receptores, incluindo integrinas, sindecanos, distroglicanos, LBP-110 e LamR (Figura 1A)4,14. O fragmento E8, que contém os domínios globulares c-terminais da laminina α1, é necessário para a ligação de distroglicanos e integrinas α6β1 e α3β115, sendo necessário para a diferenciação funcional das células epiteliais 15,16. Em contraste, os braços curtos apresentam atividade biológica diferente17, o que significa que a disponibilidade para o reconhecimento desses diferentes domínios Ln1 após a formação da rede poderia alterar o comportamento celular.
Recentemente, demonstramos que Ln1 arranjado em uma rede polimérica exibe propriedades fractais (isto é, uma estrutura que é auto-similar em múltiplas escalas de comprimento)18. As redes fractais sinalizam diferentemente às células epiteliais em relação ao Ln1, que não possui esse arranjo19. Essa rede fractal indica uma estrutura particular de montagem, onde o braço longo é preferencialmente exposto às células18. Como resultado dessa exibição de braço longo diferente, as células epiteliais sofrem diferenciação funcional em células produtoras de leite com tight junctions bem organizadas e supressão das fibras de estresse de actina19.
Descrevemos 3 métodos para gerar redes Ln1 a partir de interações de ligação braço curto-braço curto, que mostram uma alta exibição do braço longo de Ln1: 1) por montagem livre de células com tampões ácidos, 2) por co-incubação com glicoproteínas, ou 3) por interação com distroglicanos de superfície celular. Estes três métodos geram microestruturas de laminina semelhantes através de três mecanismos muito diferentes, permitindo flexibilidade no planejamento experimental. Trabalhos anteriores sugerem que esses três métodos podem representar robustez biológica: no epitélio da glândula mamária, tanto distroglicanos de superfície celular, glicoproteínas ou laminina estruturada artificialmente podem induzir diferenciação funcional19. Assim, os pesquisadores podem escolher entre esses métodos com base no objeto de estudo: células que expressam distroglicanos não apresentam sensibilidade à microestrutura de Ln-1, pois o distroglicano na membrana celular induz a polimerização correta em uma rede fractal19,20. Matrigel, uma mistura de lamininas e glicoproteínas21, representa a fonte mais econômica de Ln-1, e oferece a microestrutura necessária para induzir células mamárias knockout distroglicanos a diferenciar20, mas contém uma mistura complexa de proteínas com variabilidade lote a lote. O PolyLM representa o sistema mais limpo e reducionista que proporciona essa função, porém com maior custo e menor eficácia para induzir a diferenciação das células mamárias em relação ao Matrigel19.
Esses três métodos apresentam estrutura de rede fractal característica de agregação limitada àdifusão18,19 e apresentam atividade biológica alterada em relação à laminina agregada em múltiplos sistemas experimentais22,23,24,25. Estudos futuros utilizando esses métodos poderiam identificar os receptores e a sinalização necessários para a diferenciação epitelial e determinar a restauração de interações normais célula-matriz em células em microambientesanormais20, como tumores.
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Protocol
1. Descongelar e alíquota laminina-111
NOTA: A laminina-111 purificada está disponível comercialmente (normalmente purificada a partir da matriz de EHS vendida como Matrigel), mas nem todas as fontes fornecem proteína intacta e não degradada.
- Confirmar que Ln1 não é degradado por fornecimento de Ln1 e cromatografia de exclusão de tamanho de corrida26 ou eletroforese em gel de poliacrilamida26. Ln1 desnaturado deve ter bandas em 337 kDa, 197 kDa e 177 kDa, e Ln1 nativo deve ter uma única banda em 711 kDa.
- Descongelar Ln1 no gelo em geladeira durante a noite e alíquota em tubos de microcentrífuga de baixa ligação a proteínas (tipicamente alíquota a 100 μg/tubo para sobreposições de cultura, ou 10 μg para revestimentos) usando pontas de baixa ligação a proteínas e técnica estéril27. Congelar alíquotas e conservar a -80 °C.
2. Polimerização da laminina usando tampões de pH baixo
- Faça tampão de polimerização poliLM: Pesar e misturar 1 mM de CaCl2 e 20 mM de acetato de sódio em água ultrapura. Em seguida, ajuste o pH para 4,0, usando HCl ou ácido acético. Filtrar estéril através de um filtro de 0,2 μm e conservar a 4 °C.
- Faça o controle do tampão de polimerização: Misture 1 mM CalCl2 e 20 mM Tris e ajuste o pH para 7,0, usando 10 N HCl ou 12 N NaOH conforme necessário. Filtrar estéril através de um filtro de 0,2 μm e conservar a 4 °C.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. - Descongele o número necessário de alíquotas de Ln-1 em uma geladeira durante a noite.
- Usando a técnica de cultura de células estéreis, adicione o tampão apropriado (tampão de polimerização poliLM da etapa 2.1 ou tampão de polimerização de controle da etapa 2.2) às alíquotas de laminina na concentração final de 100 μg/mL (ou seja, adicione 0,5 mL a 50 μg de alíquotas) e misture suavemente por pipetagem.
- Se utilizar laminina fluorescentemente marcada para visualização, reconstitua e adicione na proporção 1:50 m/peso (por exemplo, 2 μg/100 μg) e misture suavemente por pipetagem.
Observação : se usando laminins como um substrato para a fixação celular, execute as etapas 2.6-2.8: - Imediatamente após a diluição em tampão apropriado, transferir lamininas para plástico de cultura ou vidraria e incubar durante a noite em uma incubadora de cultura celular a 37 °C. Observe que, ao cobrir o revestimento, adicione um volume suficientemente grande para produzir uma queda equilibrada (normalmente, use 50 μL para uma lamínula redonda de 13 mm) e mantenha em uma câmara umidificada durante a noite a 37 °C.
- Utilizando técnica estéril27, lavar com solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x.
- Retire o líquido com cuidado. Não deixe a superfície completamente seca.
NOTA: Se estiver usando lamininas para cobrir as células para indução de proteína do leite, siga as etapas 2.9-2.12: - Cultura de células epiteliais mamárias. Cultura MepG dystroglycan knock in (DgKI) ou células MepG dystroglycan knockout cells (DgKO) em DMEM-F12 suplementado com 2% FBS, 0,01 mg/mL insulina, 0,005 μg/mL EGF, 0,05 mg/mL gentamicina e 0,05 g/mL normocina.
- Células DgKO e DgKI de sementes para estimulação de laminina a 10.500 células/cm2 em placas de poço ou placas de fundo de lamínula
- Incubar lamininas diluídas em uma incubadora de cultura celular a 37 °C por 30 min.
- Centrifugar alíquotas de poliLM a 2.000 x g por 20 minutos, mas centrifugar LM em pH neutro a 20.000 x g por 20 minutos devido ao menor tamanho das entidades proteicas e necessidade de velocidades mais altas para coletar efetivamente.
- Por técnica estéril27, retirar suavemente o sobrenadante e ressuspender em volume apropriado de meio de indução DMEM-F12 suplementado com 3 μg/mL de prolactina, 2,8 μM de hidrocortisona e 5 μg/mL de insulina
- Transferir laminina em meio de cultura celular imediatamente para estimular as células. Estimulamos células com 50-800 μg/mL Ln1
3. Polimerização da laminina utilizando glicoproteínas isoladas
- Descongele nidogênio-1 recombinante e Ln1 suavemente no gelo na geladeira durante a noite.
- Misturar Ln1 com nidogênio-1 na proporção 1:1 em peso em meio de cultura celular usando pontas e tubos de baixa ligação a proteínas e usando técnica estéril. Utilizar Ln1 puro em meio de cultura celular como controle.
- Se usar laminina fluorescentemente marcada para visualização, reconstitua e adicione na proporção 1:50 m/peso (por exemplo, 2 μg/100 μg). Misture suavemente por pipetagem.
- Incubar Ln1-nidogênio ou controlar Ln1 em incubadora de cultura celular a 37 °C por 30 min.
- Centrífuga de copolímeros de Ln1-nidogênio a 2.000 x g por 30 min e controle Ln1 a 20.000 x g por 30 min.
- Remover suavemente o sobrenadante e ressuspender em meio de cultura celular até uma concentração final de 100-800 μg de proteína total/mL.
- Use imediatamente para estimular as células, ou transfira para lamínulas e deixe aderir durante a noite a 37 °C em incubadoras de cultura de células umedecidas.
- Remova o meio de cultura das lamínulas, lave as lamínulas com 1x PBS e, em seguida, fixe com formalina a 10% (ou seja, formaldeído a 4% em PBS) por 15 minutos à temperatura ambiente.
4. Polimerização de laminina utilizando células que expressam distroglicanos
- Cultura de células epiteliais mamárias. Cultura MepG dystroglycan knock in (DgKI) ou células MepG dystroglycan knockout cells (DgKO) em DMEM-F12 suplementado com 2% FBS, 0,01 mg/mL insulina, 0,005 μg/mL EGF, 0,05 mg/mL gentamicina e 0,05 g/mL normocina.
- Sementes de células DgKI a 5.000 células/cm2 e células DgKO de sementes a 8.000 células/cm2 devido a diferenças nas taxas de crescimento. Cultura a 37 °C em incubadoras umedecidas com trocas de meios a cada 2-3 dias e passagens a cada 4-5 dias usando uma técnica estéril rigorosa. Contar as células cuidadosamente com um hemocitômetro ou contador automático de células27 para garantir taxas de crescimento adequadas.
- Células de sementes para estimulação de laminina a 10.500 células/cm2 em placas de poço ou placas de fundo de cobertura e cultura por 2 dias, usando células DgKI para gerar células fractais Ln1 e DgKO como controles negativos. Descongelar Ln-1 suavemente durante a noite em gelo em um refrigerador e, em seguida, misturar com meio de indução de DMEM-F12 suplementado com 3 μg/mL de prolactina, 2,8 μM de hidrocortisona e 5 μg/mL de insulina. Para uma placa de 35 mm, use 1 mL de meio de indução com 50-800 μg de Ln1.
- Se estiver usando Ln1 fluorescente, misture na proporção 50:1 em peso/mwt.
- Remover o meio das células e cobrir com laminina e meio de indução de DMEM-F12 suplementado com 3 μg/mL de prolactina, 2,8 μM de hidrocortisona e 5 μg/mL de insulina
- Cultivar células por 2 dias e, em seguida, fixar com formalina a 10%.
5. Caracterização da microestrutura da laminina via microscopia óptica
- Coletar amostras fixas e lavar 3 vezes com 1x PBS à temperatura ambiente por 5 min.
- Bloquear e permeabilizar amostras em 1x PBS com Triton X-100 a 0,5%, albumina de soro bovino a 3%, soro caprino a 10% e fragmento de anticorpo bloqueador de camundongo a 40 μg/mL por 1 h à temperatura ambiente em câmara umedecida.
NOTA: Triton X-100 é perigoso. Manuseie com luvas e proteção ocular e descarte adequadamente. - Misture o anticorpo antilaminina numa diluição de 1:100 com 1x PBS com Triton X-100 a 0,5% e BSA a 3% e adicione às amostras durante 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C numa câmara humidificada (normalmente utilize caixas de ponta com um lenço de laboratório molhado no fundo).
- Remover o anticorpo primário e lavar 3 vezes com 1x PBS com Triton X-100 a 0,5% e BSA a 3%.
- Adicionar um anticorpo secundário adequado numa diluição de 1:500 às amostras em 1x PBS com Triton X-100 a 0,5% e BSA a 3% e incubar à temperatura ambiente no escuro numa câmara umedecida.
- Remover o anticorpo secundário e lavar 3 vezes com 1x PBS com Triton X-100 a 0,5% e BSA a 3%.
- Para amostras contendo células, adicionar 6 μM de faloidina por 45 min, seguido de 3 lavagens com PBS com Triton X-100 a 0,5% e BSA 3%, e seguidas de 3 lavagens com PBS. Em seguida, corar com 0,1 μg/mL DAPI em PBS por 5 minutos.
- Monte amostras, se for o caso.
- Estrutura da imagem ln-1 utilizando microscopia confocal de alta resolução. Use um microscópio de varredura a laser equipado com objetivas de imersão (Plano de imersão em água Apochromat 40X/1.1NA ou Plano de imersão em óleo Apochromat 63X/1.4NA).
6. Caracterização de construções de laminina via dimensão de contagem de caixas
- Analise as propriedades fractais usando algoritmos de dimensão de contagem de caixas disponíveis nas caixas de ferramentas do Matlab ou no ImageJ. Esses métodos limiares imagens de laminina e plotam em um log-log plotar o número de caixas contendo Ln1 em comparação com o tamanho das caixas. A inclinação da relação entre esses parâmetros é a dimensão de contagem de caixas: geometrias não-fractais terão uma dimensão de 0, 1 ou 2, enquanto geometrias fractais terão uma dimensão não-inteira28.
NOTA: Ln1 tratado com ácido, glicoproteína e ligado a células DgKI tem uma dimensão fractal de contagem de caixa de ~1,7, enquanto Ln1 de controle tem uma dimensão fractal de 2,0.
7. Caracterização de construções de laminina via microscopia eletrônica
- Ressuspender as lamininas em meios de cultura celular e deixar adsorver wafers de sílica por 90 min em um ambiente úmido de 37 °C.
- Matrizes de fixação em glutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2.
NOTA: O glutaraldeído é perigoso e deve ser manuseado em uma capela com luvas e proteção ocular e descartado como resíduo perigoso. - Matrizes pós-fixas em tetróxido de ósmio a 1% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2.
NOTA: O tetróxido de ósmio é perigoso e deve ser manuseado em um exaustor com luvas e proteção ocular e descartado adequadamente. O cacodilato é perigoso e deve ser manuseado em um exaustor com luvas e proteção ocular e descartado adequadamente. - Lavar 3 vezes em tampão cacodilato de sódio a pH 7,2.
- Desidratar com concentrações crescentes de etanol.
- Sputter reveste matrizes com uma fina camada de ouro.
- Imagem utilizando microscopia eletrônica de varredura.
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Representative Results
A laminina-111 é uma proteína trimérica com três domínios automontáveis no final de seus braços curtos (Figura 1A). Quando tratados adequadamente, os braços curtos podem polimerizar-se em uma rede hexagonal (Figura 1B,1C), que exibe propriedades fractais de agregados limitadas à difusão em escalas espaciais maiores (Figura 2). A laminina incubada em tampões de pH neutro contendo cálcio forma pequenos agregados visualizados com um anticorpo anti-Ln1 (Figura 2A), que têm uma dimensão fractal de contagem de caixa de ~2, indicando ausência de fractalidade. Em contraste, Ln1 incubado em tampão pH4 contendo cálcio (Figura 2B), ou em tampão neutro com nidogênio-1 (Figura 2C) formam redes rendilhadas de preenchimento espacial com dimensão fractal de ~1,7 (Figura 3). Ln1 cultivado com células que expressam distroglicanos forma redes rendilhadas semelhantes (Figura 2D, inset mostra núcleos celulares).
Quando pH7Ln e polyLM são imageados com MEV com resolução crescente, as diferenças na microestrutura tornam-se mais aparentes. Em baixa resolução (Figura 2Ei e v), as redes poliLM aparecem mais dispersas em comparação com o pH7-Ln, e em alta resolução, os agregados pH7-Ln são aparentes (Figura 2E iv), enquanto uma rede hexagonal espalhada pode ser vista no polyLM em alta resolução (Figura 2E viii).
Figura 1: Antecedentes do Ln1 e do método de polimerização: R: Ln1 é uma proteína trimérica complexa com múltiplos domínios adesivos (sítios de ligação ao receptor observados), que pode se ligar a uma variedade de receptores de integrina e não-integrina (em preto) e formar redes poliméricas por ligação de braço curto (em tan). B: Ln1 pode formar uma rede hexagonal na presença de íons cálcio e pH baixo, glicoproteínas como nidogênio-1 ou distroglicano de superfície celular. C: exemplo de imagem MEV de Ln1 polimerizado mostrando rede hexagonal e modelo de montagem proposto para Ln1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dados representativos da polimerização do Ln1. A: Ln1 agrega em tampões neutros com cálcio. Quando visualizados com um anticorpo anti-Ln1, pequenos agregados podem ser observados. B: Ln1 em cálcio ácido contendo tampão polimeriza-se em poliLM, que apresenta propriedades fractais. C: A mistura de Ln1-nidogênio-1 (1:1 em peso) forma polímeros semelhantes. D: Ln1 em meio de cultura neutro de células tamponadas sobreposto a células que expressam distroglicanos mostra uma rede rendilhada semelhante. Inset: contracoloração nuclear mostrando morfologia celular. E: Microscopia eletrônica de varredura de redes pH7-Ln e poliLM (método spin down) com resolução crescente. No pH7-Ln, varreduras de baixa resolução (i & ii) mostram fibras relativamente compactas, que se resolvem como agregados em varreduras de alta resolução (iii). poliLM na mesma concentração é muito mais espalhado (iv&v), e varreduras de alta resolução mostram uma rede hexagonal de preenchimento de espaço (vii). F: Essa alteração microestrutural faz com que as células epiteliais da glândula mamária DgKO se diferenciem funcionalmente em células produtoras de leite19. i: células estimuladas por pH7-Ln apresentam abundantes fibras de estresse por actina (vermelho) e zo-1 desorganizado contendo tight junctions (verde), enquanto ii: células estimuladas por poliLM contêm menos actina filamentosa total, localização lateral da actina na fronteira célula-célula e zo-1 bem organizado contendo tight junctions. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Estimativa da dimensão fractal pelo método de contagem de caixas. A&B: Imagem bruta de pH7-Ln e poliLM mostram diferenças na morfologia. C&D: essas imagens são limitadas para dar origem a uma imagem em preto e branco, E&F: então é calculado o log da razão entre o número de caixas que contêm a imagem e o tamanho da caixa. A inclinação média representa a dimensão de contagem de caixa Fd é calculada. O pH7-Ln tem uma dimensão característica de 2,0, indicando nenhuma propriedade fractal, enquanto o poliLM tem uma dimensão de ~1,7, indicativo de um processo de agregação limitado por difusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As lamininas representam um elemento-chave da MEC em sistemas epiteliais, musculares e de órgãos neurais, e têm demonstrado in vitro desempenhar papéis essenciais na regulação da diferenciação funcional das células. Evidências crescentes indicam que a estrutura da laminina exibida às células regula sua sinalização e o fenótipo celular resultante 15,16, portanto, métodos para controlar a microestrutura de Ln1 devem ser de interesse para biólogos básicos que trabalham nessas áreas e para engenheiros de tecidos que buscam recapitular o comportamento normal in vitro. De forma mais geral, sabe-se que a microestrutura de uma variedade de proteínas da matriz extracelular regula a resposta biológica e a compreensão dos mecanismos pelos quais a microestrutura modula a função celular é uma área ativa de pesquisa.
Neste trabalho, descrevemos três métodos para polimerizar a laminina em redes com microestrutura fractal característica de agregação limitada à difusão. Foi demonstrado que esses polímeros de Ln1 sinalizam de forma diferente para as células em comparação com o agregado Ln1, potencialmente devido à exibição alterada do domínio adesivo nas células. Estes três métodos para controlar a microestrutura de Ln1 podem representar redundância biológica na montagem de Ln1, mas isso representa um desafio para o trabalho experimental. O controle da microestrutura de Ln1 por meio de tampão ácido só surtirá efeito quando adicionado às células knockout dos distroglicanos19,20. Assim, o planejamento experimental deve considerar as células e a pureza do Ln1 a ser utilizado. O Ln1 comercialmente disponível é comumente derivado da matriz de EHS, que contém uma alta porcentagem de nidogênios e outras glicoproteínas; Ln1 em matriz de EHS polimeriza-se corretamente em redes fractais em sistemas neutros tamponados. Ln1 recombinante tornou-se recentemente disponível comercialmente, mas é excepcionalmente caro.
A qualidade da proteína Ln1 é crucial para este trabalho, pois fragmentos de braço curto podem bloquear a polimerização. Fragmentos de braço curto (i.e., o fragmento E4) interferem na formação da rede, pois cada fragmento induz um vazio na rede29. Dados prévios mostram que a inclusão de fragmentos E4 pode bloquear fenótipos induzidos por Ln129,30. Da mesma forma, verificamos que a formação da rede é interrompida por pequenas quantidades de laminina-332 (dados não publicados), que assim como os fragmentos de E4 contém um único domínio adesivo29,30. Assim, é crucial verificar se o Ln1 está intacto e altamente purificado para remover outras espécies de laminina antes de iniciar o trabalho.
Embora esses métodos sejam relevantes para os pesquisadores que estudam as interações célula-matriz, deve-se notar que a família das lamininas é altamente complexa, envolvendo 15 membros conhecidos e variantes de emenda adicionais31, e essa família interage com uma ampla gama de receptores, glicoproteínas, colágenos e potencialmente fatores de crescimento4. Assim, o Ln1 polimerizado representa um estado reducionista que se pode esperar que seja modificado rapidamente pela função celular. Além disso, diferentes sistemas orgânicos detectam, respondem e remodelam os laminins de forma diferente: demonstramos que a ligação da laminina à actina através do distroglicano é dispensável para a glândula mamária19, enquanto o distroglicano é absolutamente necessário para a função do miócito32.
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Disclosures
Este trabalho foi realizado sob os auspícios do Departamento de Energia dos EUA pelo Lawrence Livermore National Laboratory sob o Contrato DE-AC52-07NA27344. Lançamento de IM LLNL-JRNL-799443.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por Lawrence Livermore National Lab LDRD 18-ERD-062 (para C.R.). Obrigado a John Muschler por seu gentil presente das células DgKO e DgKI. Obrigado à equipe do Laboratório de Microscópio Eletrônico da Universidade da Califórnia em Berkeley pelo aconselhamento e assistência na preparação de amostras de microscopia eletrônica e coleta de dados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Anti-Laminin primary antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody | Thermo | A32731 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 or similar | |
| Cell Culture Incubator | Thermo | Heracell 150 or similar | |
| Centrifuge for microcentrifuge tubes | Eppendorf | 5418 or similar | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 or equivalent | |
| Coverslips | Thermo | 25CIR-1 or similar | |
| DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red | Thermo | 11330107 | |
| EGF (Epidermal Growth Factor) | Sigma Aldrich | 11376454001 | |
| Fluorescently Labeled Laminin | Cytoskeleton Inc | LMN02 | |
| Gentamicin | VWR | VWRV0304-10G | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 or similar | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888-5G | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 16634-50mg | |
| MepG Dystroglycan Knockout Cells | LBNL | N/A | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 or similar | |
| Normocin | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma Aldrich | 75633 | |
| Ovine Prolactin | Los Angeles Biomedical Research Institute | Ovine Pituitary Prolactin | |
| Phalloidin | Thermo | A22287 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo | 10010023 or similar | |
| Purified Laminin-111 | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| Recombinant human Nidogen-1, carrier free | R&D systems | 2570-ND-050 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | S2889 or similar | |
| Sodium Cacodylate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Sterile filters | Millipore | SLGP033RS or similar | |
| Tris | Sigma Aldrich | 252859 or similar | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Ultra-low protein binding tubes | VWR | 76322-516, 76322-522 or similar | |
| Ultrapure water | Thermo | 15230253 or similar |
References
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