Summary
Описаны три метода генерации полимеров Ln1 с фрактальными свойствами, которые сигнализируют клеткам по-разному по сравнению с неполимеризованным Ln1.
Abstract
Ламинин-111 (Ln1) является неотъемлемой частью внеклеточного матрикса эпителия, мышечной и нервной систем. Ранее мы продемонстрировали, что микроструктура Ln1 изменяет способ передачи сигналов клеткам, возможно, из-за того, что сборка Ln1 в сети обнажает различные адгезивные домены. В этом протоколе мы описываем три метода получения полимеризованного Ln1.
Introduction
В отличие от факторов роста или цитокинов, белки внеклеточного матрикса (ECM) могут собираться в структурные сети. Поскольку дисфункция ВКМ является ключевым элементом многих заболеваний, механизмы, с помощью которых клетки воспринимают и передают сигналы от состава, микроструктуры и биомеханики ВКМ, являются привлекательными мишенями для терапевтических разработок. Все больше данных свидетельствуют о том, что микроструктура этих сетей играет важную роль в том, как эти белки передают сигналы клеткам. На сегодняшний день эта связь между микроструктурой ECM и функцией клеток была показана для коллагена I1, фибронектина2 и фибрина3.
Ламинин-111 (Ln1) представляет собой тримерный крестообразный белок, который является ключевым структурным компонентом внеклеточного матрикса, который контактирует с эпителиальными клетками4, мышечными клетками5 и нервными клетками6. В молочной железе Ln1 необходим для функциональной дифференцировки эпителиальных клеток молочной железы в клетки, продуцирующие молоко 7,8,9, а Ln1 имеет решающее значение для индукции реверсии опухоли 10,11. Ln1 и другие ламинины необходимы для развития кортикальных актиновых сетей и организации сарколеммы в мышцах12,13, а также для миграции нервных клеток и роста нейритов13. Таким образом, понимание механизмов, с помощью которых ламинин посылает сигналы клеткам, является активной областью исследований.
Ln1 содержит несколько адгезивных доменов для широкого спектра рецепторов, включая интегрины, синдеканы, дистрогликан, LBP-110 и LamR (рис. 1A)4,14. Фрагмент Е8, содержащий c-концевые глобулярные домены ламинина α1, необходим для связывания дистрогликана и интегринов α6β1 и α3β115, а также необходим для функциональной дифференцировки эпителиальных клеток15,16. Напротив, короткие плечи демонстрируют различную биологическую активность17, а это означает, что доступность для распознавания этих различных доменов Ln1 после формирования сети может изменить поведение клетки.
Недавно мы продемонстрировали, что Ln1, организованный в полимерную сеть, проявляет фрактальные свойства (т.е. структуру, которая самоподобна в различных масштабах длины)18. Фрактальные сети по-разному сигнализируют эпителиальным клеткам по сравнению с Ln1, у которого отсутствует такое расположение19. Эта фрактальная сеть указывает на особую структуру сборки, где длинное плечо преимущественно подвержено воздействию ячеек18. В результате этого различного дисплея длинного плеча эпителиальные клетки подвергаются функциональной дифференцировке в клетки, продуцирующие молоко, с хорошо организованными плотными соединениями и подавлением волокон актинового стресса19.
Описаны 3 метода генерации сетей Ln1 из взаимодействий связывания короткого плеча с коротким плечом, которые показывают высокую демонстрацию длинного плеча Ln1: 1) путем бесклеточной сборки с кислотными буферами, 2) путем совместной инкубации с гликопротеинами или 3) путем взаимодействия с дистрогликаном на поверхности клетки. Эти три метода генерируют схожие микроструктуры ламинина с помощью трех совершенно разных механизмов, что обеспечивает гибкость при планировании экспериментов. Предыдущая работа предполагает, что эти три метода могут представлять биологическую устойчивость: в эпителии молочной железы либо дистрогликан клеточной поверхности, либо гликопротеины, либо искусственно структурированный ламинин могут индуцировать функциональную дифференцировку. Таким образом, исследователи могут выбирать между этими методами в зависимости от предмета исследования: клетки, экспрессирующие дистрогликан, не проявляют чувствительности к микроструктуре Ln-1, так как дистрогликан в клеточной мембране индуцирует правильную полимеризацию во фрактальную сеть19,20. Матригель, смесь ламининов и гликопротеинов21, представляет собой наиболее экономичный источник Ln-1 и предлагает необходимую микроструктуру, чтобы индуцировать дифференцировку клеток молочной железы с нокаутом дистрогликанов20, но содержит сложную смесь белков с изменчивостью от партии к партии. PolyLM представляет собой самую чистую, наиболее редукционистскую систему, которая обеспечивает эту функцию, но с более высокой стоимостью и меньшей эффективностью для индуцирования дифференцировки клеток молочной железы по сравнению с Matrigel19.
Эти три метода имеют фрактальную сетчатую структуру, характерную для диффузионно-ограниченной агрегации18,19, и показывают измененную биологическую активность по сравнению с агрегированным ламинином в множественных экспериментальных системах 22,23,24,25. Будущие исследования с использованием этих методов могут идентифицировать рецепторы и сигналы, необходимые для дифференцировки эпителия, и определить восстановление нормальных межклеточных взаимодействий в клетках в аномальном микроокружении, таком как опухоли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Размораживание и аликвотный ламинин-111
ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенный ламинин-111 доступен в продаже (обычно очищенный из матрицы EHS, продаваемой как Матригель), но не все источники содержат неповрежденный, неразлагаемый белок.
- Убедитесь в том, что Ln1 не разрушается, используя Ln1 и эксклюзионную хроматографию26 или электрофорез в полиакриламидном геле26. Денатурированный Ln1 должен иметь полосы 337 кДа, 197 кДа и 177 кДа, а родной Ln1 должен иметь одну полосу 711 кДа.
- Ln1 размораживают на льду в холодильнике в течение ночи и аликвотируют в микроцентрифужные пробирки с низким содержанием белка (обычно аликвотные по 100 мкг/пробирку для наложения культур или 10 мкг для покрытий) с использованием наконечников с низким содержанием связывания белка и стерильной техники27. Заморозьте аликвоты и храните при температуре -80 °C.
2. Полимеризация ламинина с использованием буферных растворов с низким pH
- Сделайте полимеризационный буфер polyLM: взвесьте и смешайте 1 мМ CaCl2 и 20 мМ ацетата натрия в сверхчистой воде. Затем отрегулируйте рН до 4,0, используя HCl или уксусную кислоту. Стерильно процедите через фильтр 0,2 мкм и храните при температуре 4 °C.
- Сделайте контрольный полимеризационный буфер: смешайте 1 мМ CalCl2 и 20 мМ Tris и отрегулируйте pH до 7,0, используя 10 N HCl или 12 N NaOH по мере необходимости. Стерильно процедите через фильтр 0,2 мкм и храните при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. - Разморозьте необходимое количество аликвот Ln-1 в холодильнике в течение ночи.
- Используя метод стерильной клеточной культуры, добавьте соответствующий буфер (либо полимеризационный буфер polyLM из стадии 2.1, либо буфер для контрольной полимеризации из стадии 2.2) к аликвотам ламинина в конечной концентрации 100 мкг/мл (т. е. добавить 0,5 мл к аликвотам 50 мкг) и осторожно перемешать пипетированием.
- Если для визуализации используется ламинин с флуоресцентной меткой, восстановите и добавьте в соотношении 1:50 масс/массу (например, 2 мкг/100 мкг) и осторожно перемешайте пипеткой.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании ламининов в качестве субстрата для прикрепления клеток выполните шаги 2.6-2.8: - Сразу после разведения в соответствующем буфере переносят ламинины на культуральную пластиковую или стеклянную посуду и инкубируют в течение ночи в инкубаторе клеточных культур при 37 °C. Обратите внимание, что при нанесении покрытия на покровные стекла добавьте достаточно большой объем, чтобы получить равновесную каплю (как правило, используйте 50 мкл для круглого покровного стекла диаметром 13 мм) и храните в увлажненной камере в течение ночи при температуре 37 °C.
- Используя стерильную технику27, промыть 1x фосфатно-солевым буфером (PBS).
- Осторожно удалите жидкость. Не допускайте полного высыхания поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании ламининов для покрытия клеток индукцией молочного белка выполните шаги 2.9-2.12: - Культивирование эпителиальных клеток молочной железы. Культуральный ввод дистрогликанов MepG (DgKI) или клеток с нокаутом дистрогликана MepG (DgKO) в DMEM-F12 с добавлением 2% FBS, инсулина 0,01 мг/мл, EGF 0,005 мкг/мл, гентамицина 0,05 мг/мл и нормоцина 0,05 г/мл.
- Семена клеток DgKO и DgKI для стимуляции ламинином в концентрации 10 500 клеток/см2 в луночных планшетах или чашках с покровным дном
- Инкубируют разбавленные ламинины в инкубаторе клеточных культур при 37 °C в течение 30 мин.
- Центрифуга polyLM аликвотирует при 2 000 x g в течение 20 минут, но центрифуга LM при нейтральном pH при 20 000 x g в течение 20 минут из-за меньшего размера белковых объектов и необходимости более высоких скоростей для эффективного сбора.
- Используя стерильную технику27, осторожно удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют в соответствующем объеме индукционной среды DMEM-F12 с добавлением 3 мкг/мл пролактина, 2,8 мкМ гидрокортизона и 5 мкг/мл инсулина
- Перенос ламинина в клеточную культуральную среду немедленно для стимуляции клеток. Мы успешно стимулировали клетки 50-800 мкг/мл Ln1
3. Полимеризация ламинина с использованием изолированных гликопротеинов
- Разморозьте рекомбинантные нидогены-1 и Ln1 на льду в холодильнике на ночь.
- Смешайте Ln1 с нидогеном-1 в соотношении 1:1 по массе в питательной среде для клеточных культур, используя наконечники и пробирки с низким связыванием белка и стерильную технику. Используют чистый Ln1 в питательной среде клеток в качестве контроля.
- Если для визуализации используется ламинин с флуоресцентной меткой, восстановите и добавьте в соотношении 1:50 масса/массу (например, 2 мкг/100 мкг). Аккуратно перемешайте пипеткой.
- Инкубируют Ln1-нидоген или контролируют Ln1 в инкубаторе клеточных культур при 37 °C в течение 30 мин.
- Центрифуга Ln1-нидогеновых сополимеров при 2 000 х г в течение 30 мин и контрольная Ln1 при 20 000 х г в течение 30 мин.
- Осторожно удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют в питательной среде до конечной концентрации 100-800 мкг общего белка/мл.
- Используйте немедленно для стимуляции клеток или переложите на покровные стекла и оставьте на ночь при 37 °C во влажных инкубаторах для клеточных культур.
- Удалите питательную среду с покровных стекол, промойте покровные стекла 1x PBS, а затем зафиксируйте 10% формалином (т. е. 4% формальдегидом в PBS) в течение 15 минут при комнатной температуре.
4. Полимеризация ламинина с использованием клеток, экспрессирующих дистрогликаны
- Культивирование эпителиальных клеток молочной железы. Культуральный ввод дистрогликанов MepG (DgKI) или клеток с нокаутом дистрогликана MepG (DgKO) в DMEM-F12 с добавлением 2% FBS, инсулина 0,01 мг/мл, EGF 0,005 мкг/мл, гентамицина 0,05 мг/мл и нормоцина 0,05 г/мл.
- Высевают клетки DgKI со скоростью 5 000 клеток/см2 и клетки DgKO со скоростью 8 000 клеток/см2 из-за различий в скорости роста. Культивирование при 37 °C в увлажненных инкубаторах со сменой сред каждые 2-3 дня и пассажами каждые 4-5 дней с использованием строгой стерильной техники. Тщательно подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток27 , чтобы обеспечить соответствующие темпы роста.
- Затравочные клетки для стимуляции ламинином в концентрации 10 500 клеток/см2 в луночных планшетах или покровных чашках и культивировании в течение 2 дней с использованием клеток DgKI для генерации фрактальных клеток Ln1 и DgKO в качестве отрицательного контроля. Осторожно разморозьте Ln-1 в течение ночи на льду в холодильнике, а затем смешайте с индукционной средой DMEM-F12 с добавлением 3 мкг/мл пролактина, 2,8 мкМ гидрокортизона и 5 мкг/мл инсулина. Для чашки диаметром 35 мм используйте 1 мл индукционной среды с 50-800 мкг Ln1.
- При использовании флуоресцентного Ln1 смешайте в соотношении 50:1 к массе.
- Удалить среду из клеток и покрыть ламинином и индукционной средой DMEM-F12 с добавлением 3 мкг/мл пролактина, 2,8 мкМ гидрокортизона и инсулина 5 мкг/мл
- Культивируют клетки в течение 2 суток, а затем фиксируют 10% формалином.
5. Характеристика микроструктуры ламинина с помощью оптической микроскопии
- Соберите фиксированные образцы и промойте 3 раза 1x PBS при комнатной температуре в течение 5 минут.
- Блокируйте и пермеабилизируйте образцы в 1x PBS с 0,5% Triton X-100, 3% бычьим сывороточным альбумином, 10% козьей сывороткой и 40 мкг/мл фрагмента антитела, блокирующего мышей, в течение 1 ч при комнатной температуре в увлажненной камере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Triton X-100 опасен. Обращайтесь с перчатками и защитными средствами для глаз и утилизируйте надлежащим образом. - Смешайте антиламининовые антитела в разведении 1:100 с 1x PBS с 0,5% Triton X-100 и 3% BSA и добавляйте к образцам в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C в увлажненной камере (обычно используют коробки для наконечников с влажной лабораторной салфеткой на дне).
- Удалите первичные антитела и промойте 3 раза 1x PBS с 0,5% Triton X-100 и 3% BSA.
- Добавьте соответствующее вторичное антитело в разведении 1:500 к образцам в 1x PBS с 0,5% Triton X-100 и 3% BSA и инкубируйте при комнатной температуре в темноте во влажной камере.
- Удалите вторичные антитела и промойте 3 раза 1x PBS с 0,5% Triton X-100 и 3% BSA.
- Для образцов, содержащих клетки, добавляют 6 мкМ фаллоидина в течение 45 мин, затем 3 промывки PBS с 0,5% Triton X-100 и 3% BSA, а затем 3 промывки PBS. Затем окрасьте 0,1 мкг/мл DAPI в PBS в течение 5 минут.
- При необходимости монтируйте образцы.
- Изображение структуры ln-1 с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения. Используйте лазерный сканирующий микроскоп, оснащенный иммерсионными объективами (для погружения в воду Plan Apochromat 40X/1.1NA или масляного иммерсионного Plan Apochromat 63X/1.4NA).
6. Характеристика ламининовых конструкций с помощью коробчатой размерности
- Анализ фрактальных свойств с помощью алгоритмов подсчета размеров, доступных в наборах инструментов Matlab или в ImageJ. Эти методы определяют пороговые значения изображений ламинина и наносят на логарифмический график количество коробок, содержащих Ln1, по сравнению с размером коробок. Наклон соотношения между этими параметрами и есть размерность, подсчитывающая ящики: нефрактальные геометрии будут иметь размерность 0, 1 или 2, тогда как фрактальные геометрии будут иметь нецелочисленную размерность28.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обработанный кислотой, гликопротеином и прикрепленный к клеткам DgKI Ln1 имеет фрактальную размерность ~1,7, в то время как контрольная Ln1 имеет фрактальную размерность 2,0.
7. Характеристика ламининовых конструкций с помощью электронной микроскопии
- Ресуспендировать ламинины в питательных средах клеток и адсорбировать на кремнеземных пластинах в течение 90 мин во влажной среде 37 °C.
- Фиксируют матрицы в 2,5% глутаровом альдегиде в 0,1 М буфере какодилата натрия при рН 7,2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Глутаровый альдегид опасен, и с ним следует обращаться в вытяжном шкафу в перчатках и средствах защиты глаз и утилизировать как опасные отходы. - Постфиксные матрицы в 1% тетраоксиде осмия в 0,1 М буфере какодилата натрия при рН 7,2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тетраоксид осмия опасен, и с ним следует обращаться в вытяжном шкафу в перчатках и средствах защиты глаз и утилизировать надлежащим образом. Какодилят опасен, и с ним следует обращаться в вытяжном шкафу в перчатках и средствах защиты глаз и утилизировать надлежащим образом. - Промыть 3 раза в буфере какодилата натрия при рН 7,2.
- Обезвоживание с увеличением концентрации этанола.
- Напылите матрицы тонким слоем золота.
- Изображение с помощью сканирующей электронной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ламинин-111 представляет собой тримерный белок с тремя самоорганизующимися доменами на концах коротких плеч (рис. 1А). При правильном обращении короткие плечи могут полимеризоваться в гексагональную решетку (рис. 1B, 1C), которая проявляет ограниченные диффузией агрегатные фрактальные свойства в больших пространственных масштабах (рис. 2). Ламинин, инкубированный в кальцийсодержащих буферах с нейтральным pH, образует небольшие агрегаты, визуализированные антителом против Ln1 (рис. 2A), которые имеют фрактальную размерность ~2, что указывает на отсутствие фрактальности. Напротив, Ln1, инкубированный в кальцийсодержащем буфере pH4 (рис. 2B) или в нейтральном буфере с нидогеном-1 (рис. 2C), образует кружевные сети с фрактальной размерностью ~1,7 (рис. 3). Ln1, культивируемый клетками, экспрессирующими дистрогликан, образует аналогичные кружевные сети (рис. 2D, на врезке показаны ядра клеток).
При визуализации pH7Ln и polyLM с помощью РЭМ с возрастающим разрешением различия в микроструктуре становятся более очевидными. При низком разрешении (рис. 2Ei и v) сети polyLM кажутся более рассредоточенными по сравнению с pH7-Ln, а при высоком разрешении видны агрегаты pH7-Ln (рис. 2E iv), в то время как в polyLM при высоком разрешении можно увидеть гексагональную решетку с расширением (рис. 2E viii).
Рисунок 1: Предыстория Ln1 и метода полимеризации: Ответ: Ln1 представляет собой сложный тримерный белок с несколькими адгезивными доменами (отмечены сайты связывания рецепторов), который может связывать различные интегриновые и неинтегриновые рецепторы (выделен черным цветом) и образовывать полимерные сети путем связывания короткого плеча и короткого плеча (коричневого цвета). B: Ln1 может образовывать гексагональную решетку в присутствии ионов кальция и гликопротеинов с низким pH, таких как нидоген-1 или дистрогликан клеточной поверхности. C: пример СЭМ-изображения полимеризованного Ln1, показывающий гексагональную решетку и предлагаемую модель сборки Ln1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные данные полимеризации Ln1. О: Ln1 агрегатируется в нейтральных буферах с кальцием. При визуализации с антителом к Ln1 можно увидеть небольшие агрегаты. B: Ln1 в кислом кальцийсодержащем буфере полимеризуется в polyLM, который проявляет фрактальные свойства. Смесь C:Ln1-нидоген-1 (1:1 масс./масс.) образует аналогичные полимеры. D: Ln1 в нейтральной буферной питательной среде клеток, наложенной на клетки, экспрессирующие дистрогликан, показывает аналогичную кружевную сеть. Врезка: ядерное контрокрашивание, показывающее морфологию клеток. E: Сканирующая электронная микроскопия сетей pH7-Ln и polyLM (метод spin down) с возрастающим разрешением. При pH7-Ln при сканировании с низким разрешением (i и ii) видны относительно компактные волокна, которые при сканировании с высоким разрешением разрешаются в виде агрегатов (iii). polyLM при той же концентрации гораздо более распространен (iv&v), а сканы высокого разрешения показывают гексагональную, заполняющую пространство решетку (vii). F: Это микроструктурное изменение приводит к тому, что эпителиальные клетки молочной железы DgKO функционально дифференцируются в клетки, продуцирующие молоко19. i: клетки, стимулированные pH7-Ln, демонстрируют большое количество клетчаток актинового стресса (красный) и дезорганизованный ZO-1, содержащий плотные контакты (зеленый), в то время как ii: клетки, стимулированные polyLM, содержат меньше общего нитчатого актина, латеральную локализацию актина на границе клетка-клетка и хорошо организованный zo-1, содержащий плотные соединения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Оценка фрактальной размерности методом подсчета ящиков. A&B: Необработанные изображения pH7-Ln и polyLM показывают различия в морфологии. C&D: эти изображения имеют пороговое значение, чтобы получить черно-белое изображение, E&F: затем вычисляется логарифм отношения количества коробок, содержащих изображение, к размеру коробки. Средний уклон представляет собой вычисляемый размер подсчета Fd. pH7-Ln имеет характерную размерность 2,0, что указывает на отсутствие фрактальных свойств, в то время как polyLM имеет размерность ~1,7, что указывает на процесс агрегации с ограничением диффузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ламинины представляют собой ключевой элемент ECM в эпителиальной, мышечной и нервной системах органов, и было показано, что in vitro они играют важную роль в регуляции функциональной дифференцировки клеток. Растущее количество данных указывает на то, что структура ламинина, отображаемая клетками, регулирует его сигнализацию и результирующий клеточный фенотип15,16, поэтому методы контроля микроструктуры Ln1 должны представлять интерес для биологов, работающих в этих областях, и для тканевых инженеров, стремящихся повторить нормальное поведение in vitro. В более общем плане, микроструктура различных белков внеклеточного матрикса, как известно, регулирует биологическую реакцию, и понимание механизмов, с помощью которых микроструктура модулирует функцию клеток, является активной областью исследований.
В данной работе описаны три метода полимеризации ламинина в сети с фрактальной микроструктурой, характерной для диффузионно-ограниченной агрегации. Было показано, что эти полимеры Ln1 по-разному сигнализируют клеткам по сравнению с агрегированным Ln1, возможно, из-за изменения отображения адгезивного домена в клетках. Эти три метода контроля микроструктуры Ln1 могут представлять собой биологическую избыточность при сборке Ln1, но это представляет собой проблему для экспериментальной работы. Контроль микроструктуры Ln1 с помощью кислотной буферной обработки покажет эффект только при добавлении к клеткам нокаута дистрогликанов19,20. Таким образом, при планировании эксперимента необходимо учитывать используемые ячейки и чистоту Ln1. Коммерчески доступный Ln1 обычно получают из матрицы EHS, которая содержит высокий процент нидогенов и других гликопротеинов; Ln1 в матрице EHS корректно полимеризуется во фрактальные сети в нейтральных буферных системах. Рекомбинантный Ln1 недавно стал коммерчески доступен, но является исключительно дорогим.
Качество белка Ln1 имеет решающее значение для этой работы, так как короткие фрагменты плеча могут блокировать полимеризацию. Короткие фрагменты плеча (т.е. фрагмент Е4) препятствуют формированию сети, поскольку каждый фрагмент индуцирует пустоту в сети29. Предыдущие данные показывают, что включение фрагментов Е4 может блокировать индуцированные Ln1 фенотипы 29,30. Кроме того, мы обнаружили, что формирование сети нарушается небольшими количествами ламинина-332 (неопубликованные данные), который, как и фрагменты Е4, содержит один адгезивный домен29,30. Таким образом, перед началом работы крайне важно убедиться в том, что Ln1 не поврежден и высокоочищен, чтобы удалить другие виды ламинина.
Хотя эти методы актуальны для исследователей, изучающих взаимодействие клеток и матрикса, следует отметить, что семейство ламининов очень сложное, включающее 15 известных членов и дополнительные варианты сплайсинга31, и это семейство взаимодействует с широким спектром рецепторов, гликопротеинов, коллагенов и, возможно, факторов роста. Таким образом, полимеризованный Ln1 представляет собой редукционистское состояние, которое, как можно ожидать, будет быстро модифицироваться в зависимости от функции клетки. Кроме того, различные системы органов по-разному воспринимают, реагируют и ремоделируют ламинины: мы продемонстрировали, что связь ламинина с актином через дистрогликан необязательна для молочной железы19, в то время как дистрогликан абсолютно необходим для функции миоцитов32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эта работа была выполнена под эгидой Министерства энергетики США Ливерморской национальной лабораторией им. Лоуренса по контракту DE-AC52-07NA27344. Выпуск IM LLNL-JRNL-799443.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Ливерморской национальной лабораторией им. Лоуренса LDRD 18-ERD-062 (К.Р.). Спасибо Джону Мушлеру за его любезный подарок в виде клеток DgKO и DgKI. Благодарим сотрудников Лаборатории электронного микроскопа Калифорнийского университета в Беркли за консультации и помощь в подготовке образцов для электронной микроскопии и сборе данных.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Anti-Laminin primary antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody | Thermo | A32731 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 or similar | |
| Cell Culture Incubator | Thermo | Heracell 150 or similar | |
| Centrifuge for microcentrifuge tubes | Eppendorf | 5418 or similar | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 or equivalent | |
| Coverslips | Thermo | 25CIR-1 or similar | |
| DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red | Thermo | 11330107 | |
| EGF (Epidermal Growth Factor) | Sigma Aldrich | 11376454001 | |
| Fluorescently Labeled Laminin | Cytoskeleton Inc | LMN02 | |
| Gentamicin | VWR | VWRV0304-10G | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 or similar | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888-5G | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 16634-50mg | |
| MepG Dystroglycan Knockout Cells | LBNL | N/A | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 or similar | |
| Normocin | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma Aldrich | 75633 | |
| Ovine Prolactin | Los Angeles Biomedical Research Institute | Ovine Pituitary Prolactin | |
| Phalloidin | Thermo | A22287 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo | 10010023 or similar | |
| Purified Laminin-111 | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| Recombinant human Nidogen-1, carrier free | R&D systems | 2570-ND-050 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | S2889 or similar | |
| Sodium Cacodylate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Sterile filters | Millipore | SLGP033RS or similar | |
| Tris | Sigma Aldrich | 252859 or similar | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Ultra-low protein binding tubes | VWR | 76322-516, 76322-522 or similar | |
| Ultrapure water | Thermo | 15230253 or similar |
References
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Wang, K., et al. Stiffening and unfolding of early deposited-fibronectin increase proangiogenic factor secretion by breast cancer-associated stromal cells. Biomaterials. 54, 63-71 (2015).
- Bruekers, S. M. C., et al. Fibrin-fiber architecture influences cell spreading and differentiation. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 495-504 (2016).
- Yurchenco, P. D. Integrating Activities of Laminins that Drive Basement Membrane Assembly and Function. Curr Top Membr. 76, 1-30 (2015).
- Colognato, H., Winkelmann, D. A., Yurchenco, P. D. Laminin Polymerization Induces a Receptor-Cytoskeleton Network. The Journal of Cell Biology. 145 (3), 619-631 (1999).
- Powell, S. K., Kleinman, H. K. Neuronal laminins and their cellular receptors. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 29 (3), 401-414 (1997).
- Li, M. L., et al. Influence of a reconstituted basement membrane and its components on casein gene expression and secretion in mouse mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (1), 136-140 (1987).
- Fiore, A., et al. Laminin-111 and the Level of Nuclear Actin Regulate Epithelial Quiescence via Exportin-6. Cell Rep. 19 (10), 2102-2115 (2017).
- Inman, J. L., Robertson, C., Mott, J. D., Bissell, M. J. Mammary gland development: cell fate specification, stem cells and the microenvironment. Development. 142 (6), 1028-1042 (2015).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Furuta, S., Ren, G., Mao, J. -H., Bissell, M. J. Laminin signals initiate the reciprocal loop that informs breast-specific gene expression and homeostasis by activating NO, p53 and microRNAs. eLife. 7, 26148 (2018).
- Brown, S. C., et al. Dystrophic phenotype induced in vitro by antibody blockade of muscle alpha-dystroglycan-laminin interaction. Journal of Cell Science. 112 (2), 209 (1999).
- Calof, A. L., Campanero, M. R., O'Rear, J. J., Yurchenco, P. D., Landert, A. D. Domain-specific activation of neuronal migration and neurite outgrowth-promoting activities of laminin. Neuron. 13 (1), 117-130 (1994).
- Li, S., et al. Laminin-sulfatide binding initiates basement membrane assembly and enables receptor signaling in Schwann cells and fibroblasts. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 179-189 (2005).
- Sonnenberg, A., et al. Integrin recognition of different cell-binding fragments of laminin (P1, E3, E8) and evidence that alpha 6 beta 1 but not alpha 6 beta 4 functions as a major receptor for fragment E8. The Journal of Cell Biology. 110 (6), 2145-2155 (1990).
- Sorokin, L., Sonnenberg, A., Aumailley, M., Timpl, R., Ekblom, P. Recognition of the laminin E8 cell-binding site by an integrin possessing the alpha 6 subunit is essential for epithelial polarization in developing kidney tubules. The Journal of Cell Biology. 111 (3), 1265-1273 (1990).
- Horejs, C. -M., et al. Biologically-active laminin-111 fragment that modulates the epithelial-to-mesenchymal transition in embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5908-5913 (2014).
- Hochman-Mendez, C., Cantini, M., Moratal, D., Salmeron-Sanchez, M., Coelho-Sampaio, T. A Fractal Nature for Polymerized Laminin. PLOS ONE. 9 (10), 109388 (2014).
- Kent, A. J., et al. The microstructure of laminin-111 compensates for dystroglycan loss in mammary epithelial cells in downstream expression of milk proteins. Biomaterials. 218, 119337 (2019).
- Weir, M. L., et al. Dystroglycan loss disrupts polarity and beta-casein induction in mammary epithelial cells by perturbing laminin anchoring. Journal of Cell Science. 119, Pt 19 4047-4058 (2006).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Palmero, C. Y., et al. The follicular thyroid cell line PCCL3 responds differently to laminin and to polylaminin, a polymer of laminin assembled in acidic pH. Molecular and Cellular Endocrinology. 376 (1), 12-22 (2013).
- Hochman-Mendez, C., Lacerda de Menezes, J. R., Sholl-Franco, A., Coelho-Sampaio, T.
- Leal-Lopes, C., Grazioli, G., Mares-Guia, T. R., Coelho-Sampaio, T., Sogayar, M. C. Polymerized laminin incorporation into alginate-based microcapsules reduces pericapsular overgrowth and inflammation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 13 (10), 1912-1922 (2019).
- Paccola Mesquita, F. C., Hochman-Mendez, C., Morrissey, J., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Laminin as a Potent Substrate for Large-Scale Expansion of Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Closed Cell Expansion System. Stem Cells International. 2019, 9 (2019).
- Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 61-67 (2002).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques. 7th edition. , John Wiley and Sons. (2016).
- Mandelbrot, B. The Fractal Geometry of Nature. , WH Freedman and Company. (1982).
- Schittny, J. C., Yurchenco, P. D. Terminal short arm domains of basement membrane laminin are critical for its self-assembly. Journal of Cell Biology. 110 (3), 825-832 (1990).
- Schuger, L., Yurchenco, P., Relan, N. K., Yang, Y. Laminin fragment E4 inhibition studies: basement membrane assembly and embryonic lung epithelial cell polarization requires laminin polymerization. International Journal of Developmental Biology. 42 (2), 217-220 (1998).
- Colognato, H., Yurchenco, P. D. Form and function: the laminin family of heterotrimers. Developmental Dynamics. 218 (2), 213-234 (2000).
- Kabaeva, Z., Meekhof, K. E., Michele, D. E. Sarcolemma instability during mechanical activity in Large myd cardiac myocytes with loss of dystroglycan extracellular matrix receptor function. Human Molecular Genetics. 20 (17), 3346-3355 (2011).
