Summary
Vi beskriver tre metoder för att generera Ln1-polymerer med fraktala egenskaper som signalerar till celler annorlunda jämfört med opolymeriserat Ln1.
Abstract
Laminin-111 (Ln1) är en viktig del av den extracellulära matrisen i epitel-, muskel- och nervsystem. Vi har tidigare visat att mikrostrukturen hos Ln1 förändrar hur den signalerar till celler, möjligen på grund av att Ln1-sammansättning i nätverk exponerar olika adhesiva domäner. I detta protokoll beskriver vi tre metoder för att generera polymeriserat Ln1.
Introduction
Till skillnad från tillväxtfaktorer eller cytokiner kan extracellulära matrixproteiner (ECM) samlas i strukturella nätverk. Eftersom ECM-dysfunktion är en viktig del av många sjukdomstillstånd är de mekanismer genom vilka celler känner av och överför signaler från ECM-sammansättning, mikrostruktur och biomekanik attraktiva mål för terapeutisk utveckling. Allt fler bevis tyder på att mikrostrukturen i dessa nätverk spelar en viktig roll för hur dessa proteiner signalerar till cellerna. Hittills har denna koppling mellan ECM-mikrostruktur och cellfunktion visats för kollagen I1, fibronektin2 och fibrin3.
Laminin-111 (Ln1) är ett trimeriskt, korsformat protein som är en viktig strukturell komponent i den extracellulära matrisen som kontaktar epitelceller4, muskelceller5 och neurala celler6. I bröstkörteln är Ln1 nödvändigt för funktionell differentiering av bröstkörtelepitelceller till mjölkproducerande celler 7,8,9, och Ln1 är avgörande för induktion av tumörreversion10,11. Ln1 och andra lamininer är nödvändiga för utveckling av kortikala aktinnätverk och sarkolemmaorganisation i muskel12,13, och för neural cellmigration och neuritutväxt13 . Att förstå mekanismerna genom vilka laminin signalerar till celler är därför ett aktivt forskningsområde.
Ln1 innehåller flera adhesiva domäner för ett brett spektrum av receptorer, inklusive integriner, syndekaner, dystroglykan, LBP-110 och LamR (Figur 1A)4,14. E8-fragmentet, som innehåller de klotformiga c-terminaldomänerna av laminin α1, är nödvändigt för att binda dystroglykan och integriner α6β1 och α3β115, och det är nödvändigt för funktionell differentiering av epitelceller15,16. Däremot visar de korta armarna olika biologisk aktivitet17, vilket innebär att tillgängligheten för igenkänning av dessa olika Ln1-domäner efter nätverksbildning kan förändra cellbeteendet.
Vi har nyligen visat att Ln1 arrangerad i ett polymert nätverk uppvisar fraktala egenskaper (dvs. en struktur som är självlikartad över flera längdskalor)18. Fraktala nätverk signalerar annorlunda än epitelceller jämfört med Ln1, som saknar detta arrangemang19. Detta fraktala nätverk indikerar en särskild sammansättningsstruktur, där den långa armen företrädesvis exponeras för celler18. Som ett resultat av denna annorlunda långarmsdisplay genomgår epitelceller funktionell differentiering till mjölkproducerande celler med välorganiserade täta korsningar och undertryckande av aktinstressfibrer19.
Vi beskriver 3 metoder för att generera Ln1-nätverk från bindningsinteraktioner mellan kort arm och kort arm, som visar en hög förekomst av Ln1-den långa armen: 1) genom cellfri sammansättning med sura buffertar, 2) genom saminkubation med glykoproteiner, eller 3) genom interaktion med cellytedystroglykan. Dessa tre metoder genererar liknande lamininmikrostrukturer genom tre mycket olika mekanismer, vilket möjliggör flexibilitet i experimentell design. Tidigare forskning tyder på att dessa tre metoder kan representera biologisk robusthet: i bröstkörtelepiteln kan antingen cellytedystroglykan, glykoproteiner eller artificiellt strukturerat laminin inducera funktionell differentiering19. Således kan forskare välja mellan dessa metoder baserat på studieobjektet: dystroglykanuttryckande celler visar ingen känslighet för Ln-1-mikrostruktur, eftersom dystroglykan i cellmembranet inducerar korrekt polymerisation till ett fraktalt nätverk19,20. Matrigel, en blandning av lamininer och glykoproteiner21, representerar den mest ekonomiska källan till Ln-1 och erbjuder den nödvändiga mikrostrukturen för att inducera dystroglykanknockout-bröstceller för att differentiera20, men innehåller en komplex blandning av proteiner med variation från parti till parti. PolyLM representerar det renaste, mest reduktionistiska systemet som tillhandahåller denna funktion, men till ökad kostnad och lägre effektivitet för att inducera juvercellsdifferentiering jämfört med Matrigel19.
Dessa tre metoder har en fraktal nätverksstruktur som är karakteristisk för diffusionsbegränsad aggregering18,19, och visar förändrad biologisk aktivitet jämfört med aggregerat laminin i multipla experimentella system 22,23,24,25. Framtida studier med hjälp av dessa metoder kan identifiera de receptorer och signalering som är nödvändiga för epiteldifferentiering och bestämma för att återställa normala cell-matrixinteraktioner i celler i onormala mikromiljöer20, såsom tumörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Upptining och alikvot laminin-111
OBS: Renat laminin-111 är kommersiellt tillgängligt (vanligtvis renat från EHS-matris som säljs som Matrigel), men inte alla källor ger intakt, icke-nedbrutet protein.
- Bekräfta att Ln1 inte bryts ned genom att använda Ln1 och utesluta kromatografi26 eller polyakrylamidgelelektrofores26. Denaturerad Ln1 bör ha band vid 337 kDa, 197 kDa och 177 kDa, och infödd Ln1 bör ha ett enda band vid 711 kDa.
- Tina Ln1 på is i kylskåp över natten och alikvot i mikrocentrifugrör med låg proteinbindning (vanligtvis alikvot vid 100 μg/rör för odlingsöverlägg eller 10 μg för beläggningar) med hjälp av spetsar med låg proteinbindning och steril teknik27. Frys in alikvoter och förvara vid -80 °C.
2. Lamininpolymerisation med buffertar med lågt pH
- Gör polyLM-polymerisationsbuffert: Väg upp och blanda 1 mM CaCl2 och 20 mM natriumacetat i ultrarent vatten. Justera sedan pH-värdet till 4,0 med HCl eller ättiksyra. Sterilt filter genom 0,2 μm filter och förvara vid 4 °C.
- Gör kontrollpolymerisationsbuffert: Blanda 1 mM CalCl2 och 20 mM Tris och justera pH till 7.0, med 10 N HCl eller 12 N NaOH efter behov. Sterilt filter genom 0,2 μm filter och förvara vid 4 °C.
OBS: Protokollet kan pausas här. - Tina det nödvändiga antalet Ln-1-alikvoter i kylskåp över natten.
- Tillsätt lämplig buffert (antingen polyLM-polymerisationsbuffert från steg 2.1 eller kontrollpolymerisationsbuffert från steg 2.2) till lamininalikvoter med en slutlig koncentration på 100 μg/ml (dvs. tillsätt 0,5 ml till 50 μg alikvoter med steril cellodlingsteknik) och blanda försiktigt med pipettering.
- Om fluorescerande märkt laminin används för visualisering, bered och tillsätt i förhållandet 1:50 vikt/vikt (t.ex. 2 μg/100 μg) och blanda försiktigt med pipettering.
OBS: Om du använder lamininer som substrat för cellbindning, följ steg 2.6-2.8: - Omedelbart efter spädning i lämplig buffert överförs lamininer till odlingsartiklar av plast eller glas och inkuberas över natten i en cellodlingsinkubator vid 37 °C. Observera att när du belägger täckglas, tillsätt en tillräckligt stor volym för att producera en jämviktsdroppe (använd vanligtvis 50 μL för en 13 mm rund täckglas) och förvara i en fuktad kammare över natten vid 37 °C.
- Tvätta med steril teknik27 med 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Ta försiktigt bort vätskan. Låt inte ytan vara helt torr.
OBS: Om du använder lamininer för att täcka celler för mjölkproteininduktion, följ steg 2.9-2.12: - Odling av bröstepitelceller. Odling MepG dystroglykanknock in (DgKI) eller MepG dystroglykanknockoutceller (DgKO) celler i DMEM-F12 kompletterat med 2% FBS, 0,01 mg/ml insulin, 0,005 μg/ml EGF, 0,05 mg/ml gentamycin och 0,05 g/ml normocin.
- Frö DgKO- och DgKI-celler för lamininstimulering vid 10 500 celler/cm2 i brunnsplattor eller täckglas bottenskålar
- Inkubera utspädda lamininer i en cellodlingsinkubator vid 37 °C i 30 minuter.
- Centrifugera polyLM-alikvoter vid 2 000 x g i 20 minuter, men centrifugera LM i neutralt pH vid 20 000 x g i 20 minuter på grund av proteinenheternas mindre storlek och behovet av högre hastigheter för att samlas in effektivt.
- Använd steril teknik27 för att försiktigt avlägsna supernatanten och återsuspendera DMEM-F12 i lämplig volym induktionsmedium kompletterat med 3 μg/ml prolaktin, 2,8 μM hydrokortison och 5 μg/ml insulin
- Överför omedelbart laminin i cellodlingsmediet för att stimulera cellerna. Vi har framgångsrikt stimulerat celler med 50-800 μg/ml Ln1
3. Lamininpolymerisation med användning av isolerade glykoproteiner
- Tina rekombinant nidogen-1 och Ln1 försiktigt på is i kylskåpet över natten.
- Blanda Ln1 med nidogen-1 i förhållandet 1:1 vikt/vikt i cellodlingsmedium med hjälp av spetsar och rör med låg proteinbindning och med steril teknik. Använd rent Ln1 i cellodlingsmedium som kontroll.
- Om fluorescerande märkt laminin används för visualisering, bered och tillsätt i förhållandet 1:50 vikt/vikt (t.ex. 2 μg/100 μg). Blanda försiktigt genom att pipettera.
- Inkubera Ln1-nidogen eller kontrollera Ln1 i en cellodlingsinkubator vid 37 °C i 30 min.
- Centrifugera Ln1-nidogen-sampolymerer vid 2 000 x g i 30 minuter och kontrollen Ln1 vid 20 000 x g i 30 minuter.
- Avlägsna försiktigt supernatanten och återsuspendera i cellodlingsmediet till en slutlig koncentration på 100–800 μg totalt protein/ml.
- Använd omedelbart för att stimulera cellerna, eller överför till täckglas och låt fästa över natten vid 37 °C i fuktade cellodlingsinkubatorer.
- Ta bort odlingsmediet från täckglasen, tvätta täckglasen med 1x PBS och fixera sedan med 10 % formalin (dvs. 4 % formaldehyd i PBS) i 15 minuter i rumstemperatur.
4. Lamininpolymerisation med hjälp av dystroglykanuttryckande celler
- Odling av bröstepitelceller. Odling MepG dystroglykanknock in (DgKI) eller MepG dystroglykanknockoutceller (DgKO) celler i DMEM-F12 kompletterat med 2% FBS, 0,01 mg/ml insulin, 0,005 μg/ml EGF, 0,05 mg/ml gentamycin och 0,05 g/ml normocin.
- Frö DgKI-celler vid 5 000 celler/cm2 och frö DgKO-celler vid 8 000 celler/cm2 på grund av skillnader i tillväxthastighet. Odling vid 37 °C i fuktade inkubatorer med mediebyte var 2-3:e dag och passager var 4-5:e dag med en rigorös steril teknik. Räkna cellerna noggrant med en hemocytometer eller automatiserad cellräknare27 för att säkerställa lämpliga tillväxthastigheter.
- Fröceller för lamininstimulering vid 10 500 celler/cm2 i brunnsplattor eller täckglas bottenskålar och kultur i 2 dagar, med användning av DgKI-celler för att generera fraktala Ln1- och DgKO-celler som negativa kontroller. Tina Ln-1 försiktigt över natten på is i kylskåp och blanda sedan med induktionsmedium av DMEM-F12 kompletterat med 3 μg/ml prolaktin, 2,8 μM hydrokortison och 5 μg/ml insulin. För en 35 mm skål, använd 1 ml induktionsmedia med 50-800 μg Ln1.
- Om du använder fluorescerande Ln1, blanda i förhållandet 50:1 vikt/vikt.
- Ta bort media från cellerna och täck med laminin och induktionsmedia av DMEM-F12 kompletterat med 3 μg/ml prolaktin, 2,8 μM hydrokortison och 5 μg/ml insulin
- Odla cellerna i 2 dagar och fixera sedan med 10% formalin.
5. Karakterisering av lamininmikrostruktur via optisk mikroskopi
- Samla fasta prover och tvätta 3 gånger med 1x PBS i rumstemperatur i 5 min.
- Blockera och permeabilisera samples i 1x PBS med 0.5 % Triton X-100, 3 % bovint serumalbumin, 10 % getserum och 40 μg/ml anti-musblockerande antikroppsfragment i 1 timme vid rumstemperatur i en fuktad kammare.
OBS: Triton X-100 är farlig. Hantera med handskar och ögonskydd och kassera på lämpligt sätt. - Blanda anti-lamininantikroppar i en spädning av 1:100 med 1x PBS med 0,5 % Triton X-100 och 3 % BSA och tillsätt till prover i 2 timmar vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C i en fuktad kammare (använd vanligtvis spetslådor med en våt laboratorieservett i botten).
- Ta bort primär antikropp och tvätta 3 gånger med 1x PBS med 0,5 % Triton X-100 och 3 % BSA.
- Tillsätt en lämplig sekundär antikropp i en spädning av 1:500 till proverna i 1x PBS med 0,5 % Triton X-100 och 3 % BSA och inkubera vid rumstemperatur i mörker i en fuktad kammare.
- Ta bort sekundär antikropp och tvätta 3 gånger med 1x PBS med 0,5 % Triton X-100 och 3 % BSA.
- För prover som innehåller celler, tillsätt 6 μM falloidin i 45 minuter, följt av 3 tvättar med PBS med 0,5 % Triton X-100 och 3 % BSA, och följt av 3 tvättar med PBS. Färga sedan med 0,1 μg/ml DAPI i PBS i 5 minuter.
- Montera provexemplar om det är lämpligt.
- Bild ln-1 struktur med högupplösande konfokalmikroskopi. Använd ett laserskanningsmikroskop utrustat med nedsänkningsobjektiv (vattennedsänkningsplan Apochromat 40X/1.1NA eller oljenedsänkningsplan Apochromat 63X/1.4NA).
6. Karakterisering av lamininkonstruktioner via lådräkningsdimension
- Analysera fraktala egenskaper med hjälp av dimensionsalgoritmer för lådräkning som finns tillgängliga i Matlab-verktygslådor eller i ImageJ. Dessa metoder tröskelbilder av laminin och plottar på ett log-log plot antalet lådor som innehåller Ln1 jämfört med storleken på lådorna. Lutningen på förhållandet mellan dessa parametrar är boxräkningsdimensionen: icke-fraktala geometrier kommer att ha en dimension på 0, 1 eller 2, medan fraktala geometrier har en icke-heltalsdimension28.
OBS: Syrabehandlad, glykoproteinbehandlad och DgKI-cellbunden Ln1 har alla en boxräknande fraktaldimension på ~1,7, medan kontroll-Ln1 har en fraktal dimension på 2,0.
7. Karakterisering av lamininkonstruktioner via elektronmikroskopi
- Återsuspendera lamininer i cellodlingssubstrat och låt adsorbera kiseldioxidplattor i 90 minuter i en fuktig 37 °C-miljö.
- Fixera matriser i 2,5 % glutaraldehyd i 0,1 M natriumkakodylatbuffert vid pH 7,2.
OBS: Glutaraldehyd är farligt och ska hanteras i dragskåp med handskar och ögonskydd och kasseras som farligt avfall. - Postfixmatriser i 1 % osmiumtetroxid i 0,1 M natriumkakodylatbuffert vid pH 7,2.
OBS: Osmiumtetroxid är farligt och bör hanteras i ett dragskåp med handskar och ögonskydd och kasseras på lämpligt sätt. Kakodylat är farligt och ska hanteras i dragskåp med handskar och ögonskydd och kasseras på lämpligt sätt. - Tvätta 3 gånger i natriumkakodylatbuffert vid pH 7,2.
- Torka med ökande koncentrationer av etanol.
- Sputtra matriser med ett tunt lager guld.
- Bild med svepelektronmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laminin-111 är ett trimeriskt protein med tre självorganiserande domäner i slutet av sina korta armar (Figur 1A). När de behandlas på lämpligt sätt kan de korta armarna polymeriseras till ett sexkantigt gitter (figur 1B, 1C), som uppvisar diffusionsbegränsade aggregerade fraktala egenskaper vid större rumsliga skalor (figur 2). Laminin inkuberat i kalciumhaltiga neutrala pH-buffertar bildar små aggregat visualiserade med en anti-Ln1-antikropp (Figur 2A), som har en fraktaldimension på ~2, vilket indikerar ingen fraktalitet. Däremot bildar Ln1 inkuberat i kalciumhaltig pH4-buffert (Figur 2B), eller i neutral buffert med nidogen-1 (Figur 2C) utrymmesfyllande spetsnätverk med en fraktal dimension på ~1,7 (Figur 3). Ln1 odlad med dystroglykanuttryckande celler bildar liknande spetsnätverk (Figur 2D, infälld visar cellkärnor).
När pH7Ln och polyLM avbildas med SEM med ökande upplösning blir skillnaderna i mikrostruktur tydligare. Vid låg upplösning (Figur 2Ei och v) verkar polyLM-nätverk mer spridda jämfört med pH7-Ln, och vid hög upplösning är pH7-Ln-aggregat uppenbara (Figur 2E iv) medan ett spridd hexagonalt gitter kan ses i polyLM vid hög upplösning (Figur 2E viii).
Figur 1: Bakgrund till Ln1 och polymerisationsmetod: S: Ln1 är ett komplext trimeriskt protein med flera adhesiva domäner (receptorbindningsställen noterade), som kan binda en mängd olika integrin- och icke-integrinreceptorer (i svart) och bilda polymera nätverk genom bindning av kort arm och kort arm (i tan). B: Ln1 kan bilda ett hexagonalt gitter i närvaro av kalciumjoner och antingen lågt pH, glykoproteiner som nidogen-1 eller cellytedystroglykan. C: exempel på SEM-bild av polymeriserad Ln1 som visar hexagonalt gitter och föreslagen Ln1-monteringsmodell. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa data för Ln1-polymerisation. S: Ln1 aggregerar i neutrala buffertar med kalcium. När det visualiseras med en anti-Ln1-antikropp kan små aggregat ses. B: Ln1 i sur kalciuminnehållande buffert polymeriseras till polyLM, vilket visar fraktala egenskaper. C: Ln1-nidogen-1-blandning (1:1 vikt/vikt) bildar liknande polymerer. D: Ln1 i neutralbuffrat cellodlingsmedium överlagrat på dystroglykanuttryckande celler visar ett liknande spetsigt nätverk. Infälld: nukleär motfärgning som visar cellmorfologi. E: Svepelektronmikroskopi av pH7-Ln och polyLM-nätverk (spin down-metod) med ökande upplösning. I pH7-Ln visar lågupplösta skanningar (i och ii) relativt kompakta fibrer, som upplöses som aggregat i högupplösta skanningar (iii). polyLM vid samma koncentration är mycket mer spridd (iv&v), och högupplösta skanningar visar ett sexkantigt, utrymmesfyllande gitter (vii). F: Denna mikrostrukturella förändring gör att DgKO-bröstkörtelepitelceller funktionellt differentieras till mjölkproducerande celler19. i: pH7-Ln-stimulerade celler uppvisar rikligt med aktinstressfibrer (röda) och oorganiserade zo-1 som innehåller täta korsningar (gröna), medan ii: polyLM-stimulerade celler innehåller mindre totalt filamentöst aktin, lateral lokalisering av aktin i cell-cellgränsen och välorganiserad zo-1 som innehåller täta korsningar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Uppskattning av fraktaldimensioner med lådräkningsmetoden. A&B: Rå bild av pH7-Ln och polyLM visar skillnader i morfologi. C&D: dessa bilder är tröskelvärden för att ge upphov till en svartvit bild, E&F: sedan beräknas loggen av förhållandet mellan antalet rutor som innehåller bilden och rutans storlek. Den genomsnittliga lutningen representerar lådräkningsdimensionen Fd beräknas. pH7-Ln har en karakteristisk dimension på 2,0, vilket indikerar inga fraktala egenskaper, medan polyLM har en dimension på ~1,7, vilket tyder på en diffusionsbegränsad aggregeringsprocess. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lamininer representerar en nyckeldel av ECM i epitel-, muskel- och neurala organsystem och har visat sig spela viktiga roller in vitro för att reglera den funktionella differentieringen av celler. Växande bevis tyder på att strukturen av laminin som visas för celler reglerar dess signalering och resulterande cellfenotyp15,16, varför metoder för att kontrollera Ln1-mikrostruktur bör vara av intresse för grundläggande biologer som arbetar inom dessa områden, och för vävnadsingenjörer som vill rekapitulera normalt beteende in vitro. Mer allmänt är mikrostrukturen hos en mängd olika extracellulära matrixproteiner känd för att reglera biologisk respons och att förstå mekanismerna genom vilka mikrostruktur modulerar cellfunktion är ett aktivt forskningsområde.
I detta arbete beskriver vi tre metoder för att polymerisera laminin till nätverk med fraktal mikrostruktur som är karakteristisk för diffusionsbegränsad aggregering. Dessa Ln1-polymerer har visat sig signalera annorlunda till celler jämfört med aggregerad Ln1, möjligen på grund av förändrad adhesiv domänvisning till celler. Dessa tre metoder för att kontrollera Ln1-mikrostrukturen kan representera biologisk redundans vid sammansättning av Ln1, men detta utgör en utmaning för experimentellt arbete. Kontroll av Ln1-mikrostruktur med hjälp av sur buffertbehandling kommer endast att visa effekter när den tillsätts till dystroglykanknockoutceller19,20. Experimentell design måste därför ta hänsyn till cellerna och renheten hos Ln1 som ska användas. Kommersiellt tillgängligt Ln1 härrör vanligtvis från EHS-matrisen, som innehåller en hög andel nidogens och andra glykoproteiner; Ln1 i EHS-matrisen polymeriserar korrekt till fraktala nätverk i neutrala buffrade system. Rekombinant Ln1 har nyligen blivit kommersiellt tillgängligt men är exceptionellt dyrt.
Ln1-proteinets kvalitet är avgörande för detta arbete eftersom korta armfragment kan blockera polymerisation. Korta armfragment (dvs. E4-fragmentet) stör nätverksbildningen eftersom varje fragment inducerar ett tomrum i nätverket29. Tidigare data visar att inkludering av E4-fragment kan blockera Ln1-inducerade fenotyper 29,30. På samma sätt har vi funnit att nätverksbildningen störs av små mängder laminin-332 (opublicerade data), som liksom E4-fragment innehåller en enda adhesiv domän 29,30. Därför är det viktigt att kontrollera att Ln1 är intakt och mycket renat för att avlägsna andra lamininarter innan arbetet påbörjas.
Även om dessa metoder är relevanta för forskare som studerar cell-matrix-interaktioner, bör det noteras att lamininfamiljen är mycket komplex, med 15 kända medlemmar och ytterligare skarvvarianter31, och denna familj interagerar med ett brett spektrum av receptorer, glykoproteiner, kollagener och potentiellt tillväxtfaktorer4. Polymeriserat Ln1 representerar således ett reduktionistiskt tillstånd som kan förväntas modifieras snabbt av cellfunktion. Dessutom känner olika organsystem av, reagerar på och omformar lamininer på olika sätt: vi har visat att koppling av laminin till aktin genom dystroglykan är umbärlig för bröstkörteln19, medan dystroglykan är absolut nödvändig för myocytfunktionen32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete utfördes under överinseende av U.S. Department of Energy av Lawrence Livermore National Laboratory under kontrakt DE-AC52-07NA27344. IM-utgåva LLNL-JRNL-799443.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Lawrence Livermore National Lab LDRD 18-ERD-062 (till C.R.). Tack till John Muschler för hans vänliga gåva av DgKO- och DgKI-cellerna. Tack till personalen vid University of California Berkeley Electron Microscope Laboratory för råd och hjälp med elektronmikroskopiprovberedning och datainsamling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Anti-Laminin primary antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody | Thermo | A32731 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 or similar | |
| Cell Culture Incubator | Thermo | Heracell 150 or similar | |
| Centrifuge for microcentrifuge tubes | Eppendorf | 5418 or similar | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 or equivalent | |
| Coverslips | Thermo | 25CIR-1 or similar | |
| DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red | Thermo | 11330107 | |
| EGF (Epidermal Growth Factor) | Sigma Aldrich | 11376454001 | |
| Fluorescently Labeled Laminin | Cytoskeleton Inc | LMN02 | |
| Gentamicin | VWR | VWRV0304-10G | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 or similar | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888-5G | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 16634-50mg | |
| MepG Dystroglycan Knockout Cells | LBNL | N/A | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 or similar | |
| Normocin | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma Aldrich | 75633 | |
| Ovine Prolactin | Los Angeles Biomedical Research Institute | Ovine Pituitary Prolactin | |
| Phalloidin | Thermo | A22287 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo | 10010023 or similar | |
| Purified Laminin-111 | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| Recombinant human Nidogen-1, carrier free | R&D systems | 2570-ND-050 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | S2889 or similar | |
| Sodium Cacodylate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Sterile filters | Millipore | SLGP033RS or similar | |
| Tris | Sigma Aldrich | 252859 or similar | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Ultra-low protein binding tubes | VWR | 76322-516, 76322-522 or similar | |
| Ultrapure water | Thermo | 15230253 or similar |
References
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Wang, K., et al. Stiffening and unfolding of early deposited-fibronectin increase proangiogenic factor secretion by breast cancer-associated stromal cells. Biomaterials. 54, 63-71 (2015).
- Bruekers, S. M. C., et al. Fibrin-fiber architecture influences cell spreading and differentiation. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 495-504 (2016).
- Yurchenco, P. D. Integrating Activities of Laminins that Drive Basement Membrane Assembly and Function. Curr Top Membr. 76, 1-30 (2015).
- Colognato, H., Winkelmann, D. A., Yurchenco, P. D. Laminin Polymerization Induces a Receptor-Cytoskeleton Network. The Journal of Cell Biology. 145 (3), 619-631 (1999).
- Powell, S. K., Kleinman, H. K. Neuronal laminins and their cellular receptors. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 29 (3), 401-414 (1997).
- Li, M. L., et al. Influence of a reconstituted basement membrane and its components on casein gene expression and secretion in mouse mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (1), 136-140 (1987).
- Fiore, A., et al. Laminin-111 and the Level of Nuclear Actin Regulate Epithelial Quiescence via Exportin-6. Cell Rep. 19 (10), 2102-2115 (2017).
- Inman, J. L., Robertson, C., Mott, J. D., Bissell, M. J. Mammary gland development: cell fate specification, stem cells and the microenvironment. Development. 142 (6), 1028-1042 (2015).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Furuta, S., Ren, G., Mao, J. -H., Bissell, M. J. Laminin signals initiate the reciprocal loop that informs breast-specific gene expression and homeostasis by activating NO, p53 and microRNAs. eLife. 7, 26148 (2018).
- Brown, S. C., et al. Dystrophic phenotype induced in vitro by antibody blockade of muscle alpha-dystroglycan-laminin interaction. Journal of Cell Science. 112 (2), 209 (1999).
- Calof, A. L., Campanero, M. R., O'Rear, J. J., Yurchenco, P. D., Landert, A. D. Domain-specific activation of neuronal migration and neurite outgrowth-promoting activities of laminin. Neuron. 13 (1), 117-130 (1994).
- Li, S., et al. Laminin-sulfatide binding initiates basement membrane assembly and enables receptor signaling in Schwann cells and fibroblasts. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 179-189 (2005).
- Sonnenberg, A., et al. Integrin recognition of different cell-binding fragments of laminin (P1, E3, E8) and evidence that alpha 6 beta 1 but not alpha 6 beta 4 functions as a major receptor for fragment E8. The Journal of Cell Biology. 110 (6), 2145-2155 (1990).
- Sorokin, L., Sonnenberg, A., Aumailley, M., Timpl, R., Ekblom, P. Recognition of the laminin E8 cell-binding site by an integrin possessing the alpha 6 subunit is essential for epithelial polarization in developing kidney tubules. The Journal of Cell Biology. 111 (3), 1265-1273 (1990).
- Horejs, C. -M., et al. Biologically-active laminin-111 fragment that modulates the epithelial-to-mesenchymal transition in embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5908-5913 (2014).
- Hochman-Mendez, C., Cantini, M., Moratal, D., Salmeron-Sanchez, M., Coelho-Sampaio, T. A Fractal Nature for Polymerized Laminin. PLOS ONE. 9 (10), 109388 (2014).
- Kent, A. J., et al. The microstructure of laminin-111 compensates for dystroglycan loss in mammary epithelial cells in downstream expression of milk proteins. Biomaterials. 218, 119337 (2019).
- Weir, M. L., et al. Dystroglycan loss disrupts polarity and beta-casein induction in mammary epithelial cells by perturbing laminin anchoring. Journal of Cell Science. 119, Pt 19 4047-4058 (2006).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Palmero, C. Y., et al. The follicular thyroid cell line PCCL3 responds differently to laminin and to polylaminin, a polymer of laminin assembled in acidic pH. Molecular and Cellular Endocrinology. 376 (1), 12-22 (2013).
- Hochman-Mendez, C., Lacerda de Menezes, J. R., Sholl-Franco, A., Coelho-Sampaio, T.
- Leal-Lopes, C., Grazioli, G., Mares-Guia, T. R., Coelho-Sampaio, T., Sogayar, M. C. Polymerized laminin incorporation into alginate-based microcapsules reduces pericapsular overgrowth and inflammation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 13 (10), 1912-1922 (2019).
- Paccola Mesquita, F. C., Hochman-Mendez, C., Morrissey, J., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Laminin as a Potent Substrate for Large-Scale Expansion of Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Closed Cell Expansion System. Stem Cells International. 2019, 9 (2019).
- Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 61-67 (2002).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques. 7th edition. , John Wiley and Sons. (2016).
- Mandelbrot, B. The Fractal Geometry of Nature. , WH Freedman and Company. (1982).
- Schittny, J. C., Yurchenco, P. D. Terminal short arm domains of basement membrane laminin are critical for its self-assembly. Journal of Cell Biology. 110 (3), 825-832 (1990).
- Schuger, L., Yurchenco, P., Relan, N. K., Yang, Y. Laminin fragment E4 inhibition studies: basement membrane assembly and embryonic lung epithelial cell polarization requires laminin polymerization. International Journal of Developmental Biology. 42 (2), 217-220 (1998).
- Colognato, H., Yurchenco, P. D. Form and function: the laminin family of heterotrimers. Developmental Dynamics. 218 (2), 213-234 (2000).
- Kabaeva, Z., Meekhof, K. E., Michele, D. E. Sarcolemma instability during mechanical activity in Large myd cardiac myocytes with loss of dystroglycan extracellular matrix receptor function. Human Molecular Genetics. 20 (17), 3346-3355 (2011).
