Summary
중합되지 않은 Ln1과 비교하여 세포에 다르게 신호를 보내는 프랙탈 특성을 가진 Ln1 중합체를 생성하는 세 가지 방법을 설명합니다.
Abstract
Laminin-111(Ln1)은 상피, 근육 및 신경계의 세포외 기질의 필수적인 부분입니다. 우리는 이전에 Ln1의 미세 구조가 세포에 신호를 보내는 방식을 변경한다는 것을 입증했는데, 이는 네트워크로의 Ln1 조립이 다른 접착 영역을 노출시키기 때문일 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 중합된 Ln1을 생성하는 세 가지 방법을 설명합니다.
Introduction
성장 인자나 사이토카인과 달리 세포외 기질(ECM) 단백질은 구조적 네트워크로 조립될 수 있습니다. ECM 기능 장애는 많은 질병 상태의 핵심 요소이기 때문에 세포가 ECM 구성, 미세 구조 및 생체 역학의 신호를 감지하고 전달하는 메커니즘은 치료제 개발을 위한 매력적인 표적입니다. 이러한 네트워크의 미세 구조가 이러한 단백질이 세포에 신호를 보내는 방식에 중요한 역할을 한다는 증거가 증가하고 있습니다. 현재까지 ECM 미세 구조와 세포 기능 사이의 이러한 연관성은 콜라겐 I1, 피브로넥틴2 및 피브린3에 대해 나타났습니다.
Laminin-111 (Ln1)은 상피 세포4, 근육 세포5 및 신경 세포6와 접촉하는 세포외 기질의 핵심 구조 구성 요소인 삼중 십자형 단백질입니다. 유선에서 Ln1은 유선 상피 세포가 우유 생산 세포로 기능적으로 분화하는 데 필요하며 7,8,9 Ln1은 종양 복귀 유도에 중요합니다10,11. Ln1 및 기타 라미닌은 근육12,13에서 대뇌 피질 액틴 네트워크 및 육종 조직의 발달과 신경 세포 이동 및 신경돌기 성장에 필요하다13 . 따라서 라미닌이 세포에 신호를 보내는 메커니즘을 이해하는 것은 활발한 연구 분야입니다.
Ln1에는 인테그린, 신데칸, 디스트로글리칸, LBP-110 및 LamR을 포함한 광범위한 수용체에 대한 여러 접착 도메인이 포함되어 있습니다(그림 1A)4,14. 라미닌 α1의 c-말단 구형 도메인을 포함하는 E8 단편은 디스트로글리칸과 인테그린 α6β1 및 α3β115의 결합에 필요하며, 상피 세포의 기능적 분화에 필요하다15,16. 대조적으로, 짧은 팔은 상이한 생물학적 활성을 나타내는데(17), 이는 네트워크 형성 후 이들 상이한 Ln1 도메인을 인식할 수 있는 가용성이 세포 거동을 변화시킬 수 있음을 의미한다.
우리는 최근에 고분자 네트워크로 배열된 Ln1이 프랙탈 특성(즉, 여러 길이 스케일에 걸쳐 자체 유사한 구조)을 나타낸다는 것을 입증했습니다18. 프랙탈 네트워크는 이 배열이 결여된 Ln1과 비교하여 상피 세포에 다르게 신호를 보낸다19. 이 프랙탈 네트워크는 특정 조립체 구조를 나타내는데, 여기서 긴 팔은 세포(18)에 우선적으로 노출된다. 이러한 상이한 긴 팔 디스플레이의 결과로, 상피 세포는 잘 조직된 단단한 접합부와 액틴 스트레스 섬유의 억제를 가진 우유 생산 세포로 기능적 분화를 겪는다19.
Ln1 긴 팔의 높은 디스플레이를 보여주는 짧은 팔-짧은 팔 결합 상호 작용에서 Ln1 네트워크를 생성하는 3가지 방법을 설명합니다: 1) 산성 완충액을 사용한 cell-free 조립, 2) 당단백질과의 공동 배양 또는 3) 세포 표면 디스트로글리칸과의 상호 작용. 이 세 가지 방법은 세 가지 매우 다른 메커니즘을 통해 유사한 라미닌 미세 구조를 생성하여 실험 설계에 유연성을 허용합니다. 이전 연구는 이 세 가지 방법이 생물학적 강건성을 나타낼 수 있음을 시사한다: 유선상피에서 세포 표면 디스트로글리칸, 당단백질 또는 인위적으로 구조화된 라미닌은 기능적 분화를 유도할 수 있다19. 따라서, 연구자들은 연구 주제에 따라 이러한 방법들 중에서 선택할 수 있다: 세포막의 디스트로글리칸이 프랙탈 네트워크로 올바른 중합을 유도하기 때문에, 디스트로글리칸 발현 세포는 Ln-1 미세구조에 대한 민감도를 나타내지 않는다 19,20. 라미닌과 당단백질(21)의 혼합물인 마트리겔(Matrigel)은 Ln-1의 가장 경제적인 공급원이며, 디스트로글리칸 녹아웃(dystroglycan knockout) 유선세포가20을 분화하도록 유도하는 데 필요한 미세구조를 제공하지만, 로트 간 변동성이 있는 복잡한 단백질 혼합물을 포함하고 있다. PolyLM은 이 기능을 제공하는 가장 깨끗하고 환원주의적인 시스템이지만 Matrigel19에 비해 유방 세포 분화를 유도하는 데 비용이 증가하고 효능이 낮습니다.
이들 3가지 방법은 확산 제한 응집(diffusion limited aggregation)18,19의 프랙탈 네트워크 구조 특성을 가지며, 다중 실험 시스템(22,23,24,25)에서 응집된 라미닌(laminin)과 비교하여 변화된 생물학적 활성을 나타낸다. 이러한 방법을 사용하는 향후 연구는 상피 분화에 필요한 수용체와 신호를 확인하고 종양과 같은 비정상적인 미세 환경20에서 세포에서 정상적인 세포-기질 상호 작용을 복원하도록 결정할 수 있습니다.
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Protocol
1. 해동 및 분취 라미닌-111
참고: 정제된 라미닌-111은 상업적으로 이용 가능하지만(일반적으로 Matrigel로 판매되는 EHS 매트릭스에서 정제됨) 모든 공급원이 온전하고 분해되지 않은 단백질을 제공하는 것은 아닙니다.
- Ln1 및 실행 크기 배제 크로마토그래피(26 ) 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(26)을 소싱하여 Ln1이 분해되지 않았는지 확인합니다. 변성된 Ln1은 337kDa, 197kDa 및 177kDa의 대역을 가져야 하며 네이티브 Ln1은 711kDa의 단일 대역을 가져야 합니다.
- Ln1을 냉장고의 얼음 위에서 밤새 해동하고, 저단백질 결합 팁과 멸균 기술을 사용하여 저단백질 결합 마이크로 원심분리기 튜브(일반적으로 배양 오버레이의 경우 100μg/튜브 또는 코팅의 경우 10μg의 부분 표본)에 분취한다27. 부분 표본을 얼려서 -80 °C에서 보관하십시오.
2. 낮은 pH 완충액을 이용한 라미닌 중합
- polyLM 중합 완충액 만들기: 무게를 측정하여 1mM CaCl2 및 20mM 아세트산 나트륨을 초순수에 혼합합니다. 그런 다음 HCl 또는 아세트산을 사용하여 pH를 4.0으로 조정합니다. 0.2μm 필터를 통해 제균 필터를 사용하고 4°C에서 보관합니다.
- 대조군 중합 완충액 만들기: 1mM CalCl2 및 20mM Tris를 혼합하고 필요에 따라 10N HCl 또는 12N NaOH를 사용하여 pH를 7.0으로 조정합니다. 0.2μm 필터를 통해 제균 필터를 사용하고 4°C에서 보관합니다.
참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. - 필요한 수의 Ln-1 부분 표본을 냉장고에서 밤새 해동합니다.
- 멸균 세포 배양 기법을 사용하여 적절한 완충액(2.1단계의 polyLM 중합 완충액 또는 2.2단계의 대조 중합 완충액)을 최종 농도 100μg/mL(즉, 0.5mL에서 50μg 분취액 추가)로 라미닌 분취액에 첨가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.
- 시각화를 위해 형광 태그가 부착된 라미닌을 사용하는 경우 1:50 wt/wt 비율(예: 2 μg/100 μg)로 재구성 및 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.
알림: 세포 부착을 위한 기질로 라미닌을 사용하는 경우 2.6-2.8단계를 따르십시오. - 적절한 완충액으로 희석한 직후 라미닌을 배양 플라스틱 또는 유리 용기에 옮기고 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 배양합니다. 커버슬립을 코팅할 때는 평형 방울이 생성될 수 있을 만큼 충분히 큰 부피를 추가하고(일반적으로 13mm 원형 커버슬립의 경우 50μL 사용) 37°C의 가습 챔버에서 밤새 보관합니다.
- 멸균 기술27을 사용하여 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다.
- 액체를 조심스럽게 제거하십시오. 표면이 완전히 건조되지 않도록 하십시오.
알림: 우유 단백질 유도를 위해 세포를 덮기 위해 라미닌을 사용하는 경우 2.9-2.12단계를 따르십시오. - 유방 상피 세포 배양. 2% FBS, 0.01mg/mL 인슐린, 0.005μg/mL EGF, 0.05mg/mL 겐타마이신 및 0.05g/mL 노르모신이 보충된 DMEM-F12의 MepG 디스트로글리칸 녹인(DgKI) 또는 MepG 디스트로글리칸 녹아웃 세포(DgKO) 세포를 배양합니다.
- 웰 플레이트 또는 커버슬립 바닥 접시에서 10,500 cells/cm2 의 라미닌 자극을 위해 DgKO 및 DgKI 세포를 종자합니다.
- 희석된 라미닌을 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다.
- 원심분리기 polyLM은 2,000 x g 에서 20분 동안 분주하지만, 단백질 개체의 크기가 작고 효과적으로 수집하기 위해 더 빠른 속도가 필요하기 때문에 LM을 20,000 x g 의 중성 pH에서 20분 동안 원심분리합니다.
- 멸균 기법27을 사용하여 상층액을 부드럽게 제거하고 3μg/mL 프로락틴, 2.8μM 하이드로코르티손 및 5μg/mL 인슐린이 보충된 DMEM-F12의 적절한 부피의 유도 배지에 재현탁시킵니다
- 세포 배양 배지에 라미닌을 즉시 전달하여 세포를 자극합니다. 50-800 μg/mL Ln1로 세포를 성공적으로 자극했습니다.
3. 분리된 당단백질을 이용한 라미닌 중합
- 재조합 니도겐-1과 Ln1을 냉장고의 얼음 위에서 밤새 부드럽게 해동합니다.
- 세포 배양 배지에서 저단백질 결합 팁과 튜브를 사용하고 멸균 기술을 사용하여 Ln1과 니도겐-1을 1:1 wt/wt 비율로 혼합합니다. 세포 배양 배지에서 순수 Ln1을 대조군으로 사용하십시오.
- 시각화를 위해 형광 태그가 부착된 라미닌을 사용하는 경우 1:50 wt/wt 비율(예: 2 μg/100 μg)로 재구성 및 추가합니다. 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다.
- Ln1-nidogen을 배양하거나 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 대조군 Ln1을 배양합니다.
- 2,000 x g 에서 30분 동안 Ln1-니도겐 공중합체를 원심분리하고 대조군 Ln1을 20,000 x g 에서 30분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 부드럽게 제거하고 세포 배양 배지에서 최종 농도 100-800μg의 총 단백질/mL로 재현탁시킵니다.
- 즉시 사용하여 세포를 자극하거나 커버슬립으로 옮겨 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 부착할 수 있습니다.
- 커버슬립에서 배양 배지를 제거하고 1x PBS로 커버슬립을 세척한 다음 실온에서 10% 포르말린(즉, PBS의 4% 포름알데히드)으로 15분 동안 고정합니다.
4. 디스트로글리칸 발현 세포를 이용한 라미닌 중합
- 유방 상피 세포 배양. 2% FBS, 0.01mg/mL 인슐린, 0.005μg/mL EGF, 0.05mg/mL 겐타마이신 및 0.05g/mL 노르모신이 보충된 DMEM-F12의 MepG 디스트로글리칸 녹인(DgKI) 또는 MepG 디스트로글리칸 녹아웃 세포(DgKO) 세포를 배양합니다.
- 성장률의 차이로 인해 DgKI 세포를 5,000 cells/cm2로 종자하고 DgKO 세포를 8,000 cells/cm2 로 종자합니다. 가습 인큐베이터에서 37°C에서 2-3일마다 배지를 교체하고 엄격한 멸균 기술을 사용하여 4-5일마다 통과합니다. 적절한 성장 속도를 보장하기 위해 혈구계 또는 자동 세포 카운터(27 )로 세포를 주의 깊게 계수합니다.
- 10,500 cells/cm2 에서 라미닌 자극을 위한 시드 세포를 웰 플레이트 또는 커버슬립 바닥 접시에 넣고 DgKI 세포를 사용하여 음성 대조군으로 프랙탈 Ln1 및 DgKO 세포를 생성하여 2일 동안 배양합니다. Ln-1을 냉장고의 얼음 위에서 밤새 부드럽게 해동한 다음 3μg/mL 프로락틴, 2.8μM 하이드로코르티손, 5μg/mL 인슐린이 보충된 DMEM-F12 유도 배지와 혼합합니다. 35mm 접시의 경우 50-800μg의 Ln1과 함께 1mL의 유도 배지를 사용합니다.
- 형광 Ln1을 사용하는 경우 50:1 wt/wt 비율로 혼합합니다.
- 세포에서 배지를 제거하고 3μg/mL 프로락틴, 2.8μM 하이드로코르티손 및 5μg/mL 인슐린이 보충된 DMEM-F12의 라미닌 및 유도 배지로 덮습니다.
- 2일 동안 세포를 배양한 후 10% 포르말린으로 고정합니다.
5. 광학 현미경을 통한 라미닌 미세구조의 특성화
- 고정 샘플을 수집하고 실온에서 1x PBS로 5분 동안 3회 세척합니다.
- 0.5% Triton X-100, 3% 소 혈청 알부민, 10% 염소 혈청 및 40μg/mL 항마우스 차단 항체 단편을 사용하여 가습 챔버에서 실온에서 1시간 동안 1x PBS의 샘플을 차단 및 투과시킵니다.
알림: Triton X-100은 위험합니다. 장갑과 보안경을 착용하고 적절하게 폐기하십시오. - 1:100으로 희석하여 항-라미닌 항체를 0.5% Triton X-100 및 3% BSA가 포함된 1x PBS와 혼합하고 가습 챔버에서 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 밤새 샘플에 첨가합니다(일반적으로 바닥에 젖은 실험실 물티슈가 있는 팁 상자 사용).
- 1차 항체를 제거하고 0.5% Triton X-100 및 3% BSA가 함유된 1x PBS로 3회 세척합니다.
- 0.5% Triton X-100 및 3% BSA가 포함된 1x PBS의 샘플에 1:500으로 희석하여 적절한 2차 항체를 추가하고 가습 챔버의 어두운 실온에서 배양합니다.
- 2차 항체를 제거하고 0.5% Triton X-100 및 3% BSA가 함유된 1x PBS로 3회 세척합니다.
- 세포가 포함된 샘플의 경우 6μM 팔로이딘을 45분 동안 첨가한 다음 0.5% Triton X-100 및 3% BSA가 포함된 PBS로 3회 세척한 다음 PBS로 3회 세척합니다. 그런 다음 PBS에서 0.1μg/mL DAPI로 5분 동안 염색합니다.
- 필요한 경우 샘플을 장착합니다.
- 고해상도 컨포칼 현미경을 사용한 이미지 ln-1 구조. 침지 대물렌즈(Water Immersion Plan Apochromat 40X/1.1NA 또는 Oil Immersion Plan Apochromat 63X/1.4NA)가 장착된 레이저 스캐닝 현미경을 사용하십시오.
6. 박스 카운팅 치수를 통한 라미닌 구조물의 특성화
- Matlab 툴박스 또는 ImageJ에서 사용할 수 있는 상자 계수 차원 알고리즘을 사용하여 프랙탈 속성을 분석합니다. 이 방법은 라미닌의 이미지를 임계값으로 표시하고 로그-로그에 플로팅하여 Ln1을 포함하는 상자의 개수를 상자 크기와 비교하여 플로팅합니다. 이러한 파라미터 사이의 관계의 기울기는 박스 카운팅 차원입니다: 비프랙탈 기하 도형은 0, 1 또는 2의 차원을 갖는 반면, 프랙탈 기하 도형은 정수가 아닌 차원28을 갖습니다.
참고: 산 처리, 당단백질 처리 및 DgKI 세포 부착 Ln1은 모두 ~1.7의 상자 계수 프랙탈 차원을 갖는 반면 대조군 Ln1은 2.0의 프랙탈 차원을 갖습니다.
7. 전자 현미경을 통한 라미닌 구성물의 특성 분석
- 세포 배양 배지에 라미닌을 재현탁시키고 습한 37°C 환경에서 90분 동안 실리카 웨이퍼에 흡착시킵니다.
- pH 7.2에서 0.1M 나트륨 카코딜레이트 완충액의 2.5% 글루타르알데히드에 매트릭스를 고정합니다.
알림: 글루타르알데히드는 위험하므로 장갑과 보안경이 있는 흄 후드에서 처리하고 유해 폐기물로 처리해야 합니다. - pH 7.2에서 0.1M 나트륨 카코딜레이트 완충액의 1% 오스뮴 테트라옥사이드의 후미자 매트릭스.
알림: 사산화오스뮴은 위험하므로 장갑과 보안경이 있는 흄 후드에서 취급하고 적절하게 폐기해야 합니다. 카코딜레이트는 위험하므로 장갑과 보안경이 있는 흄 후드에서 취급하고 적절하게 폐기해야 합니다. - pH 7.2의 카코딜산나트륨 완충액으로 3회 세척합니다.
- 에탄올 농도를 증가시켜 탈수하십시오.
- 얇은 금색 층이 있는 스퍼터 코트 매트릭스.
- 주사 전자 현미경을 사용한 이미지.
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Representative Results
Laminin-111은 짧은 팔 끝에 3개의 자가 조립 도메인이 있는 삼량체 단백질입니다(그림 1A). 적절하게 처리하면 짧은 암이 육각형 격자(그림 1B,1C)로 중합될 수 있으며, 이는 더 큰 공간 규모에서 확산 제한 응집체 프랙탈 특성을 나타냅니다(그림 2). 칼슘 함유 중성 pH 완충액에서 배양된 라미닌은 항-Ln1 항체(그림 2A)로 시각화된 작은 응집체를 형성하며, 이는 상자 계수 프랙탈 치수가 ~2로 프랙탈리티가 없음을 나타냅니다. 대조적으로, 칼슘 함유 pH4 완충액(그림 2B) 또는 니도겐-1이 있는 중성 완충액(그림 2C)에서 배양된 Ln1은 ~1.7의 프랙탈 치수(그림 3)로 공간을 채우는 레이스 네트워크를 형성합니다. 디스트로글리칸 발현 세포로 배양된 Ln1은 유사한 레이스 네트워크를 형성합니다(그림 2D, 삽입물은 세포핵을 나타냄).
pH7Ln 및 polyLM을 SEM으로 분해능을 높이면서 이미징하면 미세 구조의 차이가 더욱 분명해집니다. 저분해능(그림 2Ei 및 v)에서는 polyLM 네트워크가 pH7-Ln에 비해 더 넓게 퍼져 있는 것처럼 보이고, 고분해능에서는 pH7-Ln 응집체가 뚜렷하게 나타나는 반면(그림 2E iv), 고분해능에서는 polyLM에서 확산된 육각형 격자를 볼 수 있습니다(그림 2E viii).
그림 1: Ln1의 배경과 중합 방법: A: Ln1은 여러 접착 도메인(수용체 결합 부위 표시)을 가진 복잡한 삼량체 단백질로, 다양한 인테그린 및 비인테그린 수용체(검은색)와 결합하고 짧은 팔-짧은 팔 결합(황갈색)으로 고분자 네트워크를 형성할 수 있습니다. B: Ln1은 칼슘 이온과 낮은 pH, 니도겐-1과 같은 당단백질 또는 세포 표면 디스트로글리칸이 있는 상태에서 육각형 격자를 형성할 수 있습니다. C: 육각형 격자 및 제안된 Ln1 조립 모델을 보여주는 중합된 Ln1의 SEM 이미지 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Ln1 중합에 대한 대표 데이터. A: Ln1은 칼슘과 함께 중성 완충액에서 응집됩니다. anti-Ln1 항체로 시각화하면 작은 응집체를 볼 수 있습니다. B: 산성 칼슘 함유 완충액의 Ln1은 폴리LM으로 중합되어 프랙탈 특성을 나타냅니다. C: Ln1-nidogen-1 혼합물(1:1 wt/wt)은 유사한 중합체를 형성합니다. D: 디스트로글리칸 발현 세포에 겹쳐진 중성 완충 세포 배양 배지의 Ln1은 유사한 레이스 네트워크를 보여줍니다. 삽입 사진: 세포 형태를 보여주는 핵 대조염색. E: 분해능이 증가하는 pH7-Ln 및 polyLM 네트워크(스핀 다운 방법)의 주사 전자 현미경. pH7-Ln에서 저분해능 스캔(i & ii)은 상대적으로 조밀한 섬유를 보여주며, 이는 고분해능 스캔(iii)에서 응집체로 분해됩니다. 동일한 농도의 polyLM은 훨씬 더 많이 퍼져 있으며(iv&v), 고해상도 스캔은 육각형의 공간 채우기 격자(vii)를 보여줍니다. F: 이러한 미세구조적 변화는 DgKO 유선상피세포가 기능적으로 우유 생산 세포로 분화하도록 한다19. i: pH7-Ln 자극 세포는 풍부한 액틴 스트레스 섬유(빨간색)와 단단한 접합부(녹색)를 포함하는 무질서한 zo-1을 나타내는 반면, ii: polyLM 자극 세포는 총 사상체 액틴을 덜 함유하고 있으며, 세포-세포 경계로의 액틴의 측면 국소화 및 단단한 연접을 포함하는 잘 조직된 zo-1을 포함합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 박스 카운팅 방법을 사용한 프랙탈 차원 추정. A&B: pH7-Ln 및 polyLM의 원시 이미지는 형태학의 차이를 보여줍니다. C&D: 이 이미지는 흑백 이미지를 생성하도록 임계값이 설정되고, E&F: 그런 다음 상자를 포함하는 상자 수와 상자 크기의 비율에 대한 로그를 계산합니다. 평균 기울기는 박스 계수 치수 Fd가 계산됨을 나타냅니다. pH7-Ln은 2.0의 특성 차원을 가지며 이는 프랙탈 특성이 없음을 나타내는 반면, polyLM은 ~1.7의 차원을 가지며 확산 제한 응집 과정을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
라미닌은 상피, 근육 및 신경 장기 시스템에서 ECM의 핵심 요소를 나타내며 세포의 기능적 분화를 조절하는 데 필수적인 역할을 하는 것으로 체외에서 밝혀졌습니다. 세포에 표시되는 라미닌의 구조가 신호 전달 및 결과 세포 표현형15,16을 조절한다는 증거가 증가하고 있으므로 Ln1 미세 구조를 제어하는 방법은 이 분야에서 일하는 기초 생물학자와 체외에서 정상적인 행동을 재현하려는 조직 엔지니어에게 관심을 가져야 합니다. 보다 일반적으로, 다양한 세포외 기질 단백질의 미세구조는 생물학적 반응을 조절하는 것으로 알려져 있으며, 미세구조가 세포 기능을 조절하는 메커니즘을 이해하는 것이 활발한 연구 분야입니다.
이 연구에서는 라미닌을 확산 제한 응집의 프랙탈 미세 구조 특성을 가진 네트워크로 중합하는 세 가지 방법을 설명합니다. 이러한 Ln1 중합체는 응집된 Ln1과 비교하여 세포에 다르게 신호를 보내는 것으로 나타났으며, 이는 잠재적으로 세포에 대한 접착 도메인 표시의 변경으로 인한 것입니다. Ln1 미세구조를 제어하는 이 세 가지 방법은 Ln1 조립에서 생물학적 중복성을 나타낼 수 있지만 이는 실험 작업에 대한 도전을 나타냅니다. 산성 완충액 처리를 사용하여 Ln1 미세구조를 제어하는 것은 디스트로글리칸 녹아웃 세포(19,20)에 첨가할 때만 효과를 나타낸다. 따라서 실험 설계는 사용할 세포와 Ln1의 순도를 고려해야 합니다. 상업적으로 이용 가능한 Ln1은 일반적으로 높은 비율의 니도겐 및 기타 당단백질을 포함하는 EHS 매트릭스에서 파생됩니다. EHS 매트릭스의 Ln1은 중성 완충 시스템에서 프랙탈 네트워크로 정확하게 중합됩니다. 재조합 Ln1은 최근 상업적으로 이용 가능해졌지만 매우 비쌉니다.
Ln1 단백질 품질은 짧은 암 조각이 중합을 차단할 수 있기 때문에 이 작업에 매우 중요합니다. 짧은 암 단편(즉, E4 단편)은 각각의 단편이 네트워크(29) 내의 공극을 유도하기 때문에 네트워크 형성을 방해한다. 이전 데이터는 E4 단편의 포함이 Ln1 유도 표현형29,30을 차단할 수 있음을 보여줍니다. 마찬가지로, 우리는 네트워크 형성이 E4 단편과 마찬가지로 단일 접착 도메인29,30을 포함하는 소량의 laminin-332 (미공개 데이터)에 의해 방해를 받는다는 것을 발견했습니다. 따라서 작업을 시작하기 전에 Ln1이 손상되지 않았는지, 다른 라미닌 종을 제거하기 위해 고도로 정제되었는지 확인하는 것이 중요합니다.
이러한 방법은 세포-기질 상호작용을 연구하는 연구자들과 관련이 있지만, 라미닌 계열은 15개의 알려진 구성원과 추가적인 스플라이스 변이체(31)를 포함하는 매우 복잡하며, 이 계열은 광범위한 수용체, 당단백질, 콜라겐 및 잠재적인 성장 인자4와 상호 작용한다는 점에 유의해야 합니다. 따라서, 중합된 Ln1은 세포 기능에 의해 빠르게 변형될 것으로 예상할 수 있는 환원주의적 상태를 나타낸다. 더욱이, 서로 다른 장기 시스템은 라미닌을 다르게 감지하고, 반응하고, 리모델링한다: 우리는 디스트로글리칸을 통한 라미닌과 액틴의 결합이 유선(19)에 필수적인 반면, 디스트로글리칸은 근세포 기능(32)에 절대적으로 필요하다는 것을 입증했다.
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Disclosures
이 연구는 미국 에너지부의 후원 하에 로렌스 리버모어 국립 연구소(Lawrence Livermore National Laboratory)가 DE-AC52-07NA27344 계약에 따라 수행했습니다. IM 릴리스 LLNL-JRNL-799443.
Acknowledgments
이 연구는 로렌스 리버모어 국립 연구소 LDRD 18-ERD-062 (C.R.)의 자금 지원을 받았습니다. DgKO 및 DgKI 세포를 선물해 주신 John Muschler에게 감사드립니다. 전자 현미경 샘플 준비 및 데이터 수집에 대한 조언과 도움을 주신 University of California Berkeley Electron Microscope Laboratory의 직원에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Anti-Laminin primary antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody | Thermo | A32731 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 or similar | |
| Cell Culture Incubator | Thermo | Heracell 150 or similar | |
| Centrifuge for microcentrifuge tubes | Eppendorf | 5418 or similar | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 or equivalent | |
| Coverslips | Thermo | 25CIR-1 or similar | |
| DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red | Thermo | 11330107 | |
| EGF (Epidermal Growth Factor) | Sigma Aldrich | 11376454001 | |
| Fluorescently Labeled Laminin | Cytoskeleton Inc | LMN02 | |
| Gentamicin | VWR | VWRV0304-10G | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 or similar | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888-5G | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 16634-50mg | |
| MepG Dystroglycan Knockout Cells | LBNL | N/A | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 or similar | |
| Normocin | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma Aldrich | 75633 | |
| Ovine Prolactin | Los Angeles Biomedical Research Institute | Ovine Pituitary Prolactin | |
| Phalloidin | Thermo | A22287 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo | 10010023 or similar | |
| Purified Laminin-111 | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| Recombinant human Nidogen-1, carrier free | R&D systems | 2570-ND-050 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | S2889 or similar | |
| Sodium Cacodylate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Sterile filters | Millipore | SLGP033RS or similar | |
| Tris | Sigma Aldrich | 252859 or similar | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Ultra-low protein binding tubes | VWR | 76322-516, 76322-522 or similar | |
| Ultrapure water | Thermo | 15230253 or similar |
References
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