Summary
重合されていないLn1とは異なる方法で細胞にシグナルを送るフラクタル特性を持つLn1ポリマーを生成する3つの方法について説明します。
Abstract
ラミニン-111(Ln1)は、上皮系、筋肉系、神経系の細胞外マトリックスの重要な部分です。我々は以前、Ln1の微細構造が細胞へのシグナル伝達の仕方を変化させることを実証したが、これはおそらくLn1がネットワークに集合すると異なる接着ドメインが露出するためであろう。このプロトコルでは、重合されたLn1を発生させる3つの方法を記述する。
Introduction
成長因子やサイトカインとは異なり、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質は構造ネットワークに集合することができます。ECM機能障害は多くの疾患の重要な要素であるため、細胞がECM組成、微細構造、および生体力学からのシグナルを感知および伝達するメカニズムは、治療法開発の魅力的な標的です。これらのネットワークの微細構造が、これらのタンパク質が細胞にシグナルを伝達する仕組みに大きな役割を果たしていることを示唆する証拠が増えています。現在までに、ECMの微細構造と細胞機能とのこの連関は、コラーゲンI1、フィブロネクチン2、およびフィブリン3について示されています。
ラミニン-111(Ln1)は、上皮細胞4、筋肉細胞5、神経細胞6に接触する細胞外マトリックスの重要な構造成分である三量体の十字型タンパク質です。乳腺では、Ln1は乳腺上皮細胞から乳汁産生細胞への機能分化に必要であり7,8,9、Ln1は腫瘍復帰の誘導に不可欠である10,11。Ln1と他のラミニンは、筋肉における皮質アクチンネットワークの発達と筋膜の組織化12,13、および神経細胞の移動と神経突起伸長13に必要である。このように、ラミニンが細胞にシグナルを送るメカニズムを理解することは、活発な研究分野です。
Ln1には、インテグリン、シンデカン、ジストログリカン、LBP-110、LamRなど、幅広い受容体に対する複数の接着ドメインが含まれています(図1A)4,14。ラミニンα1のc末端球状ドメインを含むE8断片は、ジストログリカンとインテグリリンα6β1およびα3β1の結合に必要であり15、上皮細胞の機能分化に必要である15,16。対照的に、短腕は異なる生物学的活性を示し17、ネットワーク形成後にこれらの異なるLn1ドメインを認識できることは、細胞の挙動を変化させる可能性があることを意味する。
我々は最近、高分子ネットワークに配列されたLn1がフラクタル特性(すなわち、複数の長さスケールにわたって自己相似な構造)を示すことを実証した18。フラクタルネットワークは、この配列を欠いているLn1と比較して、上皮細胞に対して異なるシグナルを伝達する19。このフラクタルネットワークは、特定のアセンブリ構造を示しており、ここで、長腕は、細胞18に優先的に曝露される。この異なる長腕表示の結果として、上皮細胞は、よく組織化されたタイトジャンクションとアクチンストレス線維の抑制を有する乳生産細胞に機能分化する19。
本稿では、Ln1長腕の高い表示を示す短腕-短腕結合相互作用からLn1ネットワークを生成する3つの方法、すなわち、1)酸性緩衝液による無細胞集合、2)糖タンパク質との共インキュベーション、または3)細胞表面ジストログリカンとの相互作用について述べる。これら3つの方法は、3つの非常に異なるメカニズムによって類似したラミニンの微細構造を生成するため、実験計画に柔軟性を持たせることができます。以前の研究では、これら3つの方法が生物学的頑健性を表す可能性があることが示唆されています:乳腺上皮では、細胞表面のジストログリカン、糖タンパク質、または人工的に構造化されたラミニンのいずれかが機能分化を誘導することができます19。したがって、研究者は研究対象に基づいてこれらの方法から選択することができます:細胞膜中のジストログリカンがフラクタルネットワークに正しい重合を誘導するため、ジストログリカン発現細胞はLn-1微細構造に対する感受性を示さない19,20。ラミニンと糖タンパク質の混合物であるマトリゲル21は、Ln-1の最も経済的な供給源であり、ジストログリカンノックアウト乳腺細胞を分化させるのに必要な微細構造を提供する20が、ロットごとにばらつきのあるタンパク質の複雑な混合物を含んでいる。PolyLMは、この機能を提供する最もクリーンで還元主義的なシステムですが、マトリゲル19と比較して、乳腺細胞の分化を誘導するコストが高く、有効性が低くなります。
これら3つの方法は、拡散制限凝集18,19に特徴的なフラクタルネットワーク構造を有し、複数の実験系22,23,24,25において凝集したラミニンと比較して生物活性の変化を示す。これらの方法を用いた今後の研究により、上皮分化に必要な受容体とシグナル伝達を同定し、腫瘍などの異常な微小環境20の細胞において正常な細胞-マトリックス相互作用を回復させることが決定される可能性がある。
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Protocol
1.解凍して分注するlaminin-111
注:精製されたラミニン-111は市販されていますが(通常、マトリゲルとして販売されているEHSマトリックスから精製されています)、すべての供給源が無傷の非分解タンパク質を提供するわけではありません。
- Ln1を調達し、流戮サイズ排除クロマトグラフィー26 またはポリアクリルアミドゲル電気泳動26を行うことにより、Ln1が分解されていないことを確認する。変性Ln1は337 kDa、197 kDa、177 kDaのバンドを持ち、ネイティブLn1は711 kDaのシングルバンドを持つ必要があります。
- Ln1を冷蔵庫の氷上で一晩解凍し、低タンパク質結合チップと滅菌技術を使用して、低タンパク質吸着性微量遠心チューブ(通常、培養オーバーレイの場合は100 μg/チューブ、コーティングの場合は10 μgで分注)に分注します27。アリコートを凍結し、-80°Cで保存してください。
2. 低pH緩衝液を用いたラミニン重合
- polyLM重合バッファーの作製:1 mM CaCl2 と20 mM酢酸ナトリウムを超純水で秤量し、混合します。次に、HClまたは酢酸を使用してpHを4.0に調整します。0.2μmフィルターに通した滅菌フィルターを使用し、4°Cで保存します。
- コントロール重合バッファーの作製:必要に応じて、1 mM CalCl2 と 20 mM Tris を混合し、10 N HCl または 12 N NaOH を使用して pH を 7.0 に調整します。0.2μmフィルターに通した滅菌フィルターを使用し、4°Cで保存します。
注: プロトコルはここで一時停止できます。 - 必要な数のLn-1アリコートを冷蔵庫で一晩解凍します。
- 滅菌細胞培養技術を用いて、適切なバッファー(ステップ2.1のpolyLM重合バッファーまたはステップ2.2のコントロール重合バッファーのいずれか)を最終濃度100 μg/mLのラミニンアリコートに添加し(すなわち、0.5 mLを50 μgアリコートに添加)、ピペッティングで穏やかに混合します。
- 蛍光標識ラミニンを可視化に使用する場合は、再溶解し、1:50 wt/wt比(例:2 μg/100 μg)で添加し、ピペッティングで穏やかに混合します。
注:細胞接着の基質としてラミニンを使用する場合は、手順2.6〜2.8に従います。 - 適切な緩衝液で希釈した直後に、ラミニンを培養プラスチックまたはガラス器具に転写し、37°Cの細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートします。 カバーガラスをコーティングする場合は、平衡液滴が得られる程度に十分な容量を添加し(通常、13 mmの丸いカバーガラスには50 μLを使用)、加湿したチャンバーで37°Cで一晩保管してください。
- 滅菌技術27を使用して、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
- 液体を慎重に取り除きます。表面を完全に乾かさないでください。
注:乳タンパク質誘導のために細胞を覆うためにラミニンを使用する場合は、手順2.9-2.12に従います。 - 乳腺上皮細胞を培養します。2% FBS、0.01 mg/mLインスリン、0.005 μg/mL EGF、0.05 mg/mLゲンタマイシン、および0.05 g/mLノルモシンを添加したDMEM-F12で、MepGジストログリカンノックイン(DgKI)またはMepGジストログリカンノックアウト細胞(DgKO)を培養します。
- ラミニン刺激用のDgKOおよびDgKI細胞を10,500細胞/cm2 でウェルプレートまたはカバーガラス底皿に播種します
- 希釈したラミニンを細胞培養インキュベーターで37°Cで30分間インキュベートします。
- polyLM アリコートは 2,000 x g で 20 分間遠心分離しますが、タンパク質実体のサイズが小さく、効果的に回収するにはより高速な速度が必要であるため、LM は中性 pH 20,000 x g で 20 分間遠心分離します。
- 滅菌技術27を用いて、上清を穏やかに除去し、3 μg/mLのプロラクチン、2.8 μMのヒドロコルチゾン、および5 μg/mLのインスリンを添加したDMEM-F12の適切な量の誘導培地に再懸濁する
- 細胞培養培地にラミニンを直ちに移し、細胞を刺激します。50-800 μg/mL Ln1で細胞を刺激することに成功しました
3. 単離糖蛋白質を用いたラミニン重合
- 組換えニドゲン-1とLn1を冷蔵庫の氷上で一晩静かに解凍します。
- 細胞培養培地中でLn1とニドゲン-1を1:1 wt/wtの比率で混合し、タンパク質結合の少ないチップとチューブを使用し、滅菌法を使用します。細胞培養培地中の純粋なLn1をコントロールとして使用します。
- 可視化に蛍光標識ラミニンを使用する場合は、再溶解し、1:50 wt/wt 比(例:2 μg/100 μg)で添加します。ピペッティングで静かに混合します。
- Ln1-ニドゲンをインキュベートするか、Ln1を細胞培養インキュベーターで37°Cで30分間インキュベートします。
- Ln1-ニドゲン共重合体を2,000 x g で30分間遠心分離し、コントロールLn1を20,000 x g で30分間遠心分離します。
- 上清を静かに除去し、細胞培養培地に最終濃度100〜800μgの総タンパク質/mLになるまで再懸濁します。
- 直ちに細胞を刺激するために使用するか、カバーガラスに移し、加湿した細胞培養インキュベーターで37°Cで一晩接着させます。
- カバーガラスから培地を取り出し、カバーガラスを1x PBSで洗浄した後、10%ホルマリン(PBS中の4%ホルムアルデヒド)で室温で15分間固定します。
4. ジストログリカン発現細胞を用いたラミニン重合
- 乳腺上皮細胞を培養します。2% FBS、0.01 mg/mLインスリン、0.005 μg/mL EGF、0.05 mg/mLゲンタマイシン、および0.05 g/mLノルモシンを添加したDMEM-F12で、MepGジストログリカンノックイン(DgKI)またはMepGジストログリカンノックアウト細胞(DgKO)を培養します。
- 増殖速度の違いにより、DgKI細胞は5,000細胞/cm2、DgKO細胞は8,000細胞/cm2 で播種します。加湿インキュベーターで37°Cで培養し、培地を2〜3日ごとに交換し、厳格な滅菌技術を使用して4〜5日ごとに継代します。適切な増殖速度を確保するために、血球計算盤または自動セルカウンター27 で細胞を注意深くカウントします。
- 10,500細胞/cm2 のラミニン刺激用播種細胞をウェルプレートまたはカバーガラス底皿に入れ、2日間培養し、DgKI細胞を用いてフラクタルLn1細胞およびDgKO細胞をネガティブコントロールとして作製した。Ln-1を冷蔵庫の氷上で穏やかに一晩解凍し、3 μg/mLのプロラクチン、2.8 μMのヒドロコルチゾン、および5 μg/mLのインスリンを添加したDMEM-F12の誘導培地と混合します。35 mmのディッシュには、50〜800 μgのLn1を含む1 mLの誘導媒体を使用します。
- 蛍光Ln1を使用する場合は、50:1のwt/wt比で混合します。
- 細胞から培地を取り除き、3 μg/mLのプロラクチン、2.8 μMのヒドロコルチゾン、および5 μg/mLのインスリンを添加したDMEM-F12のラミニンおよび誘導培地で覆います
- 細胞を2日間培養した後、10%ホルマリンで固定します。
5. 光学顕微鏡によるラミニン微細構造の解析
- 固定サンプルを採取し、1x PBSで室温で5分間3回洗浄します。
- 0.5% Triton X-100、3% ウシ血清アルブミン、10% ヤギ血清、40 μg/mL 抗マウスブロッキング抗体フラグメントを含む 1x PBS でサンプルを室温で 1 時間ブロッキングし、透過処理します。
注意: Triton X-100は危険です。手袋と目の保護具を着用して取り扱い、適切に廃棄してください。 - 抗ラミニン抗体を希釈率1:100で1x PBSと0.5% Triton X-100および3% BSAを混合し、加湿チャンバー内で室温で2時間、または4°Cで一晩サンプルに添加します(通常は、底部にウェットラボワイプを入れたチップボックスを使用します)。
- 一次抗体を除去し、0.5% Triton X-100 および 3% BSA を含む 1x PBS で 3 回洗浄します。
- 0.5% Triton X-100 および 3% BSA を含む 1x PBS のサンプルに適切な二次抗体を 1:500 に希釈して添加し、加湿チャンバー内で暗所の室温でインキュベートします。
- 二次抗体を除去し、0.5% Triton X-100および3% BSAを含む1x PBSで3回洗浄します。
- 細胞を含むサンプルの場合は、6 μM のファロイジンを添加して 45 分間添加した後、0.5% Triton X-100 と 3% BSA を含む PBS で 3 回洗浄し、続いて PBS で 3 回洗浄します。その後、0.1 μg/mL DAPI in PBSで5分間染色します。
- 必要に応じてサンプルを取り付けます。
- 高分解能共焦点顕微鏡を用いたln-1構造の画像化液浸対物レンズ(水浸プランアポクロマート40X/1.1NAまたは油浸プランアポクロマート63X/1.4NA)を備えたレーザー走査型顕微鏡を使用してください。
6. 箱の計数次元によるlamininの構造物の性格描写
- Matlab ツールボックスまたは ImageJ で使用可能なボックス計数次元アルゴリズムを使用して、フラクタル特性を解析します。これらの手法は、ラミニンのイメージを閾値とし、Ln1 を含むボックスの数とボックスのサイズを比較した対数対数プロットにプロットします。これらのパラメータ間の関係の傾きはボックスカウント次元であり、非フラクタルジオメトリの次元は0、1、または2になり、フラクタルジオメトリは非整数次元28になります。
注:酸処理、糖タンパク質処理、およびDgKI細胞付着Ln1はすべて、ボックスカウントフラクタル次元が~1.7であるのに対し、コントロールLn1のフラクタル次元は2.0です。
7. 電子顕微鏡によるラミニンコンストラクトのキャラクタリゼーション
- ラミニンを細胞培養培地に再懸濁し、湿度の高い37°Cの環境で90分間シリカウエハーに吸着させます。
- マトリックスを pH 7.2 の 0.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液中の 2.5% グルタルアルデヒドで固定します。
注意: グルタルアルデヒドは危険であり、手袋と目の保護具を着用してドラフトで取り扱い、有害廃棄物として処分する必要があります。 - pH 7.2 の 0.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液中の 1% 四酸化オスミウム中の後置マトリックス。
注意: 四酸化オスミウムは危険であり、手袋と目の保護具を使用してドラフトで取り扱い、適切に廃棄する必要があります。カコジル酸は危険であり、手袋と目の保護具を使用してドラフトで取り扱い、適切に廃棄する必要があります。. - pH 7.2のカコジル酸ナトリウム緩衝液で3回洗浄します。
- エタノールの濃度を上げて脱水します。
- スパッタリングコートマトリックスは、金の薄い層でコーティングされます。
- 走査型電子顕微鏡を用いた画像。
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Representative Results
ラミニン-111は、短腕の末端に3つの自己組織化ドメインを持つ三量体タンパク質です(図1A)。適切に処理すると、短いアームは六方格子に重合し(図1B、1C)、より大きな空間スケールで拡散限界凝集フラクタル特性を示します(図2)。カルシウム含有中性pH緩衝液中でインキュベートしたラミニンは、抗Ln1抗体(図2A)で可視化された小さな凝集体を形成し、ボックスカウントフラクタル次元は~2で、フラクタル性がないことを示します。対照的に、カルシウム含有pH4緩衝液(図2B)またはニドゲン-1を含む中性緩衝液(図2C)でインキュベートしたLn1は、フラクタル寸法が~1.7(図3)のレーシーネットワークを満たす空間を形成します。ジストログリカン発現細胞で培養したLn1は、同様のレーシーネットワークを形成します(図2D、挿入図は細胞核を示す)。
pH7LnとpolyLMをSEMでイメージングし、分解能を上げると、微細構造の違いがより明確になります。低分解能(図2Eiおよびv)では、polyLMネットワークはpH7-Lnと比較してより広がっているように見え、高分解能ではpH7-Ln凝集体が明らかであるのに対し(図2E iv)、高分解能ではpolyLMに六方格子が広がっているのがわかります(図2E viii)。
図1:Ln1の背景と重合法: A:Ln1は、複数の接着ドメイン(受容体結合部位)を持つ複雑な三量体タンパク質であり、さまざまなインテグリンおよび非インテグリン受容体(黒色)に結合し、短腕-短腕結合(黄褐色)によって高分子ネットワークを形成することができます。B:Ln1は、カルシウムイオンと低pH、ニドゲン-1などの糖タンパク質、または細胞表面ジストログリカンのいずれかの存在下で六方格子を形成することができます。C:六方格子を示す重合Ln1のSEM画像の例と提案されたLn1アセンブリモデル。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:Ln1重合の代表的なデータ。 A:Ln1はカルシウムを含む中性緩衝液中で凝集します。抗Ln1抗体で可視化すると、小さな凝集体が見られます。B:酸性カルシウム含有緩衝液中のLn1が重合してpolyLMとなり、フラクタル特性を示す。C:Ln1-ニドゲン-1混合物(1:1 wt/wt)は、同様のポリマーを形成します。D:ジストログリカン発現細胞に重ね合わせた中性緩衝細胞培養培地中のLn1は、同様のレース状ネットワークを示します。挿入図:細胞形態を示す核対比染色。E:pH7-LnおよびpolyLMネットワークの走査型電子顕微鏡(スピンダウン法)の分解能向上。pH7-Lnでは、低分解能スキャン(iおよびii)は比較的コンパクトな繊維を示し、高分解能スキャン(iii)では凝集体として分離します。同じ濃度のpolyLMははるかに広がり(iv&v)、高解像度スキャンでは六角形の空間充填格子(vii)が示されます。F:この微細構造変化により、DgKO乳腺上皮細胞は機能的に乳生産細胞に分化します19。i:pH7-Ln刺激細胞は、豊富なアクチンストレス繊維(赤)とタイトジャンクションを含む組織化されたzo-1(緑)を示しますが、ii:polyLM刺激細胞は、総糸状アクチンが少なく、アクチンの細胞間境界への横方向の局在、およびタイトジャンクションを含むよく組織化されたzo-1を示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:箱計数法によるフラクタル次元推定。 A&B:pH7-LnとpolyLMの生画像は、形態の違いを示しています。C&D:これらの画像は白黒画像を生成するために閾値化され、E&F:次に、画像を含むボックスの数とボックスのサイズの比率の対数が計算されます。平均傾きは、ボックス計数次元Fdが計算される。pH7-Ln の特性次元は 2.0 で、フラクタル特性がないことを示していますが、polyLM の次元は ~1.7 で、拡散が制限された凝集プロセスを示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ラミニンは、上皮系、筋肉系、神経系におけるECMの重要な要素であり、in vitroでは、細胞の機能分化の調節に重要な役割を果たすことが示されています。細胞に示されるラミニンの構造が、そのシグナル伝達と結果として生じる細胞表現型を調節することを示す証拠が増えており15,16、したがって、Ln1微細構造を制御する方法は、これらの分野で働く基礎生物学者、およびin vitroで正常な挙動を再現しようとしている組織エンジニアにとって興味深いものになるはずです。より一般的には、さまざまな細胞外マトリックスタンパク質の微細構造が生体応答を制御することが知られており、微細構造が細胞機能を調節するメカニズムを理解することは活発な研究分野です。
本研究では、拡散限界凝集に特徴的なフラクタル微細構造を持つネットワークにラミニンを重合させる3つの方法について述べる。これらのLn1ポリマーは、凝集したLn1と比較して細胞に対して異なるシグナルを送ることが示されており、細胞に対する接着ドメインの表示が変化したことが原因である可能性があります。Ln1の微細構造を制御するこれら3つの方法は、Ln1の組み立てにおける生物学的冗長性を表している可能性がありますが、これは実験的研究の課題を表しています。酸性緩衝処理を用いたLn1微細構造の制御は、ジストログリカンノックアウト細胞に添加した場合にのみ効果を発揮する19,20。したがって、実験計画では、使用するセルとLn1の純度を考慮する必要があります。市販のLn1は、一般的にナイドゲンやその他の糖タンパク質を高い割合で含むEHSマトリックスに由来します。EHSマトリックス中のLn1は、中性緩衝系でフラクタルネットワークに正しく重合します。組換えLn1は最近市販されるようになったが、非常に高価である。
Ln1タンパク質の品質は、短いアーム断片が重合を阻害する可能性があるため、この研究にとって非常に重要です。ショートアーム断片(すなわち、E4断片)は、各断片がネットワーク29に空隙を誘導するので、ネットワーク形成を妨害する。以前のデータは、E4フラグメントを含めることでLn1誘導表現型をブロックできることが示されています29,30。同様に、我々は、E4フラグメントと同様に単一の接着ドメイン29,30を含む少量のラミニン-332(未発表データ)によってネットワーク形成が破壊されることを発見しました。したがって、作業を開始する前に、Ln1が無傷であり、他のラミニン種を除去するために高度に精製されていることを確認することが重要です。
これらの方法は、細胞とマトリックスの相互作用を研究する研究者に関連していますが、ラミニンファミリーは非常に複雑であり、15の既知のメンバーと追加のスプライスバリアント31が関与しており、このファミリーは幅広い受容体、糖タンパク質、コラーゲン、および潜在的に成長因子と相互作用していることに注意する必要があります4。このように、重合したLn1は、細胞機能によって急速に修飾されることが期待できる還元主義的状態を表す。さらに、異なる器官系は、ラミニンの感知、応答、リモデリングの仕方が異なり、ジストログリカンを介したラミニンとアクチンの結合は乳腺には不要であるが19、ジストログリカンは筋細胞機能に絶対的に必要であることを実証した32。
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Disclosures
この研究は、米国エネルギー省の後援の下、ローレンス・リバモア国立研究所が契約DE-AC52-07NA27344の下で実施しました。IMリリースLLNL-JRNL-799443。
Acknowledgments
この研究は、ローレンス・リバモア国立研究所LDRD 18-ERD-062(CRへ)から資金提供を受けました。John Muschler氏には、DgKO細胞とDgKI細胞を寄贈していただき、感謝します。カリフォルニア大学バークレー校電子顕微鏡研究所のスタッフの方々には、電子顕微鏡によるサンプルの調製とデータ収集に関するアドバイスと支援をしていただき、ありがとうございました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Anti-Laminin primary antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody | Thermo | A32731 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 or similar | |
| Cell Culture Incubator | Thermo | Heracell 150 or similar | |
| Centrifuge for microcentrifuge tubes | Eppendorf | 5418 or similar | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 or equivalent | |
| Coverslips | Thermo | 25CIR-1 or similar | |
| DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red | Thermo | 11330107 | |
| EGF (Epidermal Growth Factor) | Sigma Aldrich | 11376454001 | |
| Fluorescently Labeled Laminin | Cytoskeleton Inc | LMN02 | |
| Gentamicin | VWR | VWRV0304-10G | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 or similar | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888-5G | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 16634-50mg | |
| MepG Dystroglycan Knockout Cells | LBNL | N/A | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 or similar | |
| Normocin | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma Aldrich | 75633 | |
| Ovine Prolactin | Los Angeles Biomedical Research Institute | Ovine Pituitary Prolactin | |
| Phalloidin | Thermo | A22287 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo | 10010023 or similar | |
| Purified Laminin-111 | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| Recombinant human Nidogen-1, carrier free | R&D systems | 2570-ND-050 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | S2889 or similar | |
| Sodium Cacodylate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Sterile filters | Millipore | SLGP033RS or similar | |
| Tris | Sigma Aldrich | 252859 or similar | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Ultra-low protein binding tubes | VWR | 76322-516, 76322-522 or similar | |
| Ultrapure water | Thermo | 15230253 or similar |
References
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